Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Фармакогностическая характеристика и современное состояние изученности растений рода cotinus mill 13
1.1 Краткая ботаническая характеристика семейства Anacardiaceae .13
1.2 Ботаническая характеристика Cotinus coggygria Scop 14
1.3 Сведения об изученности химического состава Cotinus coggygria Scop .15
1.4 Биологическая активность Cotinus coggygria Scop. и использование растения в традиционной и научной медицине 21
1.5 Фармакологическая активность 22
1.5.1 Антиоксидантная активность 22
1.5.2 Противораковая активность .25
1.5.3 Антигенотоксическая активность .26
1.5.4 Антимикробная активность 28
1.5.5 Противовирусная активность 31
1.5.6 Гепатопротекторная активность 31
1.5.7 Противовоспалительная активность 33
1.5.8 Другие виды активности 34
Заключение по обзору литературы 35
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований
2.1 Объекты исследования .37
2.2 Методы исследования биологически активных веществ
2.2.1 Качественные реакции 37
2.2.2 Тонкослойная хроматография .38
2.2.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография .39
2.2.4 Атомно-абсорбционная спектрометрия .43
2.2.5 Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях 44
2.2.6 Титриметрические методы
2.3 Методы стандартизации сырья 49
2.4 Методы ресурсоведческих исследований 50
ГЛАВА 3 Исследование химического состава листьев скумпии кожевенной .52
3.1 Идентификация основных групп биологически активных веществ .52
3.2 Изучение аминокислотного состава листьев скумпии кожевенной 53
3.3 Исследование фенольных соединений .54
3.3.1 Качественный анализ .54
3.3.2 Количественный анализ 3.4 Количественное определение дубильных веществ 65
3.5 Количественное определение антоцианов и хлорофилла 71
3.6 Определение содержания органических кислот 74
3.7 Исследование элементного состава листьев скумпии кожевенной 76
Выводы по главе 3 .78
ГЛАВА 4 Определение запасов скумпии кожевенной в отдельных районах ставропольского края 81
4.1 Природные условия Ставропольского края и определение запасов 81
4.2 Характеристика природных условий и ресурсные исследования в Шпаковском районе 86
4.3 Характеристика природных условий и ресурсные исследования в Андроповском районе 88 4.4 Характеристика природных условий и ресурсные исследования в Минераловодском районе 91
Выводы по главе 4 95
ГЛАВА 5 Разработка норм качества сырья «листья скумпии кожевенной» и установление срока годности 96
5.1 Изучение динамики накопления БАВ в изучаемом объекте по фазам вегетации 96
5.1.1 Динамика накопления дубильных веществ .96
5.1.2 Динамика накопления флавоноидов
5.2 Морфологические признаки сырья .98
5.3 Микроскопические признаки сырья 100
5.4 Определение товароведческих показателей сырья 108
5.5 Определение микробиологической чистоты сырья .
5.6 Валидационная оценка методики определения количественного содержания дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной .113
5.7 Валидационная оценка методики определения количественного содержания флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид в листьях скумпии кожевенной .120
5.8 Определение сроков годности сырья – листьев скумпии кожевенной 124
Выводы по главе 5 128
Заключение 130
Список литературы 132
- Биологическая активность Cotinus coggygria Scop. и использование растения в традиционной и научной медицине
- Методы исследования биологически активных веществ
- Исследование фенольных соединений
- Характеристика природных условий и ресурсные исследования в Андроповском районе
Биологическая активность Cotinus coggygria Scop. и использование растения в традиционной и научной медицине
Впервые в качестве отдельного семейства Anacardiaceae было выделено в 1818 году шотландским ботаником, морфологом и систематиком растений Робертом Броуном (Брауном). Род Cotinus впервые описал английский ботаник Филип Миллер в 1754 году.
Семейство Anacardiaceae (сумаховые) представляет экономическую важность и состоит из 82 родов и свыше 700 видов. Оно распределено в тропиках Африки, Азии и Америки с небольшим количеством видов, встречающихся в субтропиках и зонах умеренного климата [130]. Члены семейства хорошо известны как культивируемые и используемые в пище растения; таксоны, вызывающие дерматит (такие как Комокладия, Метопиум, Семекарпус, Токсикодендрон); содержащие лекарственные вещества; ценные источники древесины и «лаковые» растения (виды родов Токсикодендрон и Глюта). Многие виды сумаховых также ценятся как садоводческие культуры. Экземпляры скумпии, сумаха, шинуса, сеарсии, фисташки китайской, фисташки мексиканской, смодингиума и токсикодендрона выращиваются из-за их красивых соцветий, соплодий, вечнозеленой листвы и/или осенней листвы. Некоторые продукты из сумаховых, включая манго (Mangifera indica L. и другие виды), фисташки (Pistacia vera L.), орехи кешью (Anacardium occidentale L.) и розовые горошины перца (Schinus terebinthifolia L.) используются во всем мире, в то время как другие известные растения, такие как пантропические спондиасы (или момбины) и неотропические плоды имеют ограниченную территорию выращивания и потребления и не поставляются на более крупные рынки [117].
На территории Российской Федерации встречается только 6 видов семейства, из которых большинство произрастает на юге европейской части. Растения семейства представляют собой вечнозеленые или листопадные деревья и кустарники с очередным или супротивным листорасположением. Листья простые, сложные тройчатые или перистые, большей частью без прилистников. Цветки обоеполые, неполно или полно раздельнополые, в метельчатых соцветиях, правильные. Плод – костянка или орех.
Согласно системе магнолиофитов А.Л. Тахтаджяна, род Cotinus имеет следующее систематическое положение: отдел – Magnoliophyta, класс – Magnoliopsida, подкласс – Rosidae, надпорядок – Rutanae, порядок – Rutales, семейство – Anacardiaceae; подсемейство – Spondioideae; триба – Rhoideae; род – Cotinus; вид – coggygria [64]. 1.2 Ботаническая характеристика Cotinus coggygria Scop.
Скумпия кожевенная (Cotinus сogyggria Scop.) (синоним Rhus cotinus L.) относится к семейству сумаховые (Anacardiaceae). Листопадное дерево до 12 метров высотой с шаровидной или зонтиковидной кроной и стволом до 18 см в диаметре, покрытым тонкой коричнево – бурой корой. Побеги голые, блестящие или несколько опушенные, при изломе и порезах выделяющие млечный сок. Листорасположение очередное. Листья простые, округлые, яйцевидные, продолговато-яйцевидные или обратнояйцевидные, 5-10 см длиной и 3-4 см шириной, с широко клиновидным основанием, цельнокрайние или едва зубчатые, сверху голые, темно-сизо-зеленые или сизовато-красные, снизу светлее. Осенью раскрашиваются в желтые, розовые или багрово-фиолетовые тона. Растение однодомное, но иногда и двудомное. Цветки мелкие, около 3 мм в диаметре, желтовато-белые или зеленоватые, обоеполые и тычиночные, в конечных рыхлых широко конусовидных метельчатых соцветиях 15-30 см длиной и 7-12 см шириной, в которых цветоножки недоразвитых цветков сильно выпячиваются, покрываясь белыми или пурпурными оттопыренными волосками, что придает плодущему соцветию вид пышного султана, чашелистиков 5, лепестков 5, продолговатых, вдвое превышающих чашелистики, тычинок 5, завязь сидячая, одногнездная с 3 боковыми столбиками. Плод – сухая костянка, косо обратнояйцевидная или почковидная 3-5 мм длиной и 1,5-2 мм шириной [30, 93, 94]. Цветет растение обычно в мае – июне, плодоносит в августе. Произрастает среди зарослей кустарников на сухих каменистых склонах, светолюбиво и засухоустойчиво, не переносит избыточного почвенного увлажнения. На территории Российской Федерации встречается на Северном Кавказе, в Ростовской и Волгоградской областях в качестве декоративных насаждений, а также компонентов лесозащитных полос [72]. 1.3 Сведения об изученности химического состава Cotinus coggygria Scop.
Скумпия кожевенная является источником фенольных соединений, обладающих уникальным, разнообразным строением и широким спектром биологической активности [8, 23, 77, 89, 105, 126].
Методы исследования биологически активных веществ
Методы морфолого-анатомического исследования Изучение внешних признаков листьев скумпии кожевенной проводили визуально невооружённым глазом, а также с помощью лупы (х10), в соответствии с ОФС «Методы анализа лекарственного растительного сырья» ГФ XI [15].
Микроскопический анализ проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» [16]. Изучение временных препаратов проводили с помощью микроскопа «МИКРОМЕД-1» с тринокулярной насадкой, с объективами 4, 10, 40, окуляром 16. Микрофотосъемка выполнена с помощью цифровой камеры Electronic Eyepiece MD 300 (3.1 megapixels). Фотографии отредактированы в программе Adobe Photoshope SC3.
Определение числовых показателей сырья Сырье скумпии кожевенной подвергали анализу по следующим товароведческим показателям: определение воды и летучих веществ, золы общей, золы, нерастворимой в кислоте хлористоводородной 10%, содержание органических и минеральных примесей. Определение показателей проводили по методикам, рекомендованным ГФ XI и ГФ XII [13,16]. Определение микробиологической чистоты сырья Исследование проводили согласно требованиям ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота» ГФ XII [13]. Определение сроков хранения сырья Образцы сырья были заготовлены в Шпаковском, Минераловодском, Андроповском районах Ставропольского края, а также на юго-восточном склоне горы Машук в городе Пятигорске и окрестностях города Кисловодска в 2013 году. При определении сроков годности руководствовались требованиями ОСТа 42-3-84 «Лекарственные средства. Установление сроков годности» и пособиями, регламентирующими данный показатель [61].
Каждые полгода в сырье определяли содержание суммы дубильных веществ по разработанной методике, флавоноидов и числовых показателей сырья. 2.4 Методы ресурсоведческих исследований
Определение запасов сырья скумпии кожевенной определяли в соответствии с методикой определения запасов лекарственных растений на конкретных зарослях [76] и рекомендациями, описанными в учебно-методическом пособии по ресурсоведению лекарственных растений [44].
Определение урожайности листьев скумпии кожевенной проводили методом модельных экземпляров. Для этого устанавливали массу сырья, получаемую от модельного экземпляра, и численность товарных экземпляров на единицу площади. Подсчет численности экземпляров проводили на учетных площадках размером 10 м2, которые закладывали вдоль маршрутного хода. В среднем, эта численность составила 3,5 модельных экземпляра во всех обследуемых районах.
Для определения урожайности на учетных площадках собирали листья с товарных экземпляров скумпии кожевенной для определения массы модельного экземпляра. Для этого по маршрутному ходу собирали сырье у каждого пятого экземпляра (куста скумпии кожевенной), взвешивали и определяли среднюю массу. Необходимое число экземпляров в выборке, представительно отражающее массу сырья с модельного растения, устанавливали специальным статистическим способом по формуле 12: п = — (12) где п - рассчитываемое число экземпляров; р требуемая точность (15%); у- коэффициент вариации, определенный по формуле 13: 100X0 v= , (13) где М - среднее арифметическое; а - среднее квадратичное отклонение. С учетом значения переводных коэффициентов по Снедекору, рассчитывали среднее квадратичное отклонение по формуле 14: сг= ахк,(14) где а - разница между минимальным и максимальным количеством сырья, собранного с одного товарного экземпляра; k– переводной коэффициент по Снедекору, зависящий от числа выборки. Расчет урожайности производился, путем умножения среднего числа экземпляров на единицу площади и на среднюю массу сырья с модельного экземпляра. Биологический запас сырья скумпии кожевенной рассчитывали, перемножая урожайность на площадь заготовок, учитывая верхний предел урожайности. Определение эксплуатационного запаса осуществляли с учетом нижнего предела урожайности.
Исследование фенольных соединений
Климат Ставропольского края в большей степени умеренно-континентальный. В южной горной части края он более мягкий. Ставропольская возвышенность по климатическим особенностям отличается от степных равнин [11]. Восточные районы края отличаются особенно резкой континентальностью и засушливостью [2].
Регион КМВ сочетает в себе наличие множества благоприятных факторов, благодаря которым здесь успешно осуществляется бальнеологическое лечение. Основные его достоинства связаны с большим количеством солнечных дней , наряду с умеренной влажностью воздуха.
Температурный режим имеет средний диапазон +8 - +10 С. Большая часть осадков сосредоточена на летнее время (около 80%), при этом наблюдается особенность в уменьшении их объема от западных к восточным районам. Территориями с максимальным количеством осадков являются Ставропольская возвышенность и предгорья Большого Кавказа Длительность нахождения снежного покрова составляет 60-93 дня. В холодное время года преобладают восточные ветры, в теплое – западные. В агроклиматическом отношении на территории края выделяются 4 зоны: достаточного, неустойчивого увлажнения, засушливая и крайне засушливая. Зона достаточного увлажнения охватывает район КМВ. Количество осадков превышает 600 мм, а испарение влаги в объеме ниже. В результате коэффициент увлажнения превышает 1,0 [33]. Зона неустойчивого увлажнения отмечается в западных и центральных районах. Количество осадков находится в пределах 450-520 мм, температуры несколько снижаются. В результате коэффициент увлажнения устанавливается в интервале от 0,6 до 1,0. Засушливая зона располагается в центральных степных районах Ставропольского края. Количество осадков — 370-400 мм, коэффициент увлажнения до 0,5.
Восток края отнесен к крайне засушливой зоне с объем осадков, не превышающих 300-350 мм. В сочетании с максимальными показатели по испарению влаги коэффициент увлажнения имеет отметку около 0,4. Данные условия негативным образом влияют на работы в сфере сельского хозяйства.
Среди почвообразующих пород выделяются известняки, песчаные сланцы, эоловые и аллювиальные отложения, засоленные морские отложения, засоленные майкопские глины, засоленные и лессовидные пылеватые суглинки [69].
Территория Ставропольского края по характеристике почв делится на три зоны: чернозёмов, каштановых почв и горных почв. Около 40% территории края представлено черноземами, отличающимися неоднородным составом. Восток занят каштановыми почвами (до 44% от общей территории края). Здесь также появляются и светло-каштановые почвы, что связано с ухудшением климатических условий (зона полупустынь). К юго-западу, одновременно с увеличением среднегодовых температур и количества осадков, сухие степи со светло-каштановыми почвами переходят в степи с преобладанием каштановых и темно-каштановых почв. Далее в ландшафте появляются лесостепи с появлением мицеллярно-карбонатных черноземов [3].
Растительный покров
Растительность Ставропольского края очень вариабельна. При этом стоит отметить, что высокая антропогенная нагрузка, связанная с ведением сельского хозяйства, заметно сократила ареалы видов. Часть растений стала сокращаться вследствие истощения почвенного состава [38,63]. На территории края насчитывает около 2251 видов сосудистых растений, что составляет 0,8% мировой флоры [38]. Преобладающими типами растительности являются степные и полупустынные формации. В настоящее время степи большей части территории края задействованы в сельском хозяйстве. Степную зону с карбонатными черноземами представляют ковыли (Stipa tirsa, S lessingiana., S. ucrainica, S. capillata), а также келерия гребенчатая (Koeleria gracilis), овсяница валлисская (Festuca valesiaca). Многообразие травяного покрова характеризуют горицвет весенний (Adonis vernalis), незабудка лесная (Myosotis sylvatica), пион узколистный (Paeonia tenuifolia), земляника зеленая (Fragaria viridis), лабазник обыкновенный (Filipendula vulgaris), тысячелистник благородный-(Achillea nobilis), солонечник мохнатый (Galatella villosa). Заросли степных кустарников появляются в западинах (карагана мягкая - Caragana mollis, миндаль степной-Amygdalus nаnа, слива степная-Prunus stepposa) [75].
Черноземам лесостепных районов свойственны луговые степи с большим участием двудольных растений, которые периодически преобладают над злаками. Среди дерновых злаков доминируют тимофеевка степная (Phleum phleoides) и ковыль перистый (Stipa pennata), в других -трясунка средняя (Briza australis), кострец береговой (Bromopsis riparia). На западных склонах Ставропольского плато произрастают Stipa capillata и S. ucrainica, растительный покров щебнистых склонов состоит из бородача обыкновенного (Bothriochloa ischaemum) и ковыля волосовидного (Stipa capillata), также встречаются полынь таврическая (Artemisia taurica) и полынь Маршалла (A. Marschalliana) [75].
Лесостепи отмечены наличием широколиственных, преимущественно дубовых лесов [9]. Лесостепи юго-западной части Ставропольской возвышенности занимают ясенево-дубово-грабовые леса с примесью груши, клена, кизила, ильма, яблони. В верховьях балок и на плато имеются реликтовые участки букового леса из бука восточного (Fagus orientalis). Густые леса встречаются в регионе КМВ, особенно на склонах гор
Характеристика природных условий и ресурсные исследования в Андроповском районе
Приведенные экспериментальные расчеты показывают, что на всех трех уровнях концентраций получаются сопоставимые результаты, а относительное стандартное отклонение составило ±2,32%.
Таким образом, спектрофотометрическая методика количественного определения суммы дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной является линейной, прецизионной и точной условиях одной лаборатории. Количественное содержание суммы дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной по экспериментальным данным должно быть не менее 18,0%.
Таким образом, и титриметрическая, и спектрофотометрическая методики количественного определения суммы дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной валидны, позволяют получать достоверные и воспроизводимые результаты в условиях лаборатории.
Исходя из того, что метод спектрофотометрии при прочих равных условиях более избирателен по сравнению с титриметрическим методом (глава 3), для определения количественного содержания суммы дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной мы рекомендуем использовать спектрофотометрическую методику. Содержание дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной должно быть не менее 18,0%. 5.7 Валидационная оценка методики определения количественного содержания флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид в листьях скумпии кожевенной
Количественное содержание суммы флавоноидов в листьях скумпии кожевенной в пересчете на мирицетин-3-рамнозид приводится как установленная норма качества в ГОСТ 4564-79. В связи с этим проведена валидационная оценка этой методики (глава 2, пункт 2.2.6), воспроизведённой нами на современном оборудовании.
Линейность методики устанавливали, оценивая градуировочный график зависимости величины оптической плотности от суммы флавоноидов в 1 мл извлечения из листьев скумпии кожевенной. Для эксперимента готовили 5 извлечений из разных навесок сырья.
Количественное содержание суммы флавоноидов в 1 мл извлечения рассчитывали по формуле 17: Х- А 25 , (17) 380хах(100-В) где А - оптическая плотность испытуемого раствора; 120 і о/ 380 - удельный показатель поглощения (А см) продукта взаимодействия мирицетина-3-рамнозида с алюминия хлоридом при длине волны 415 нм; Va - аликвота, мл; В - влажность сырья, 10,72%. По результатам количественного определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид в исследуемом растворе эксперимента был построен градуировочный график (рисунок 34). Рисунок 34 – Градуировочный график зависимости оптической плотности от содержания суммы флавоноидов в исследуемом извлечении
Линейность методики устанавливали путем рассчета уравнения линейной зависимости и коэффициента корреляции: y = 2,71395x + 0,00004; r = 0,999 Зависимость можно считать линейной, т.к. коэффициент корреляции максимально приближен к 1.
Для определения внутрилабораторной воспроизводимости (прецизионности) методики содержание суммы флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид определяли в шести разных навесках листьев скумпии кожевенной. Результаты эксперимента представлены в таблице 39.
Из представленных данных следует, что сумма флавоноидов в листьях скумпии кожевенной в пересчете на мирицетин-3-рамнозид, составила 1,5671%, а относительное стандартное отклонение – ±3,8%.
Для установления точности методики готовили водное извлечение из травы скумпии кожевенной с максимально возможным содержанием суммы дубильных веществ 0,2273 мг/мл, так как это содержание находится на верхнем пределе линейности методики. Таким образом, для получения извлечения использовали навеску сырья 3,0 г. Чтобы получить смеси с тремя уровнями концентраций – 1:0,5(I); 1:1(II) и 1:2(III), полученное извлечение разводили водой очищенной.
Точность методики оценивали путем определения открываемости на всех уровнях концентраций, где было установлено расчетное и найденное содержание суммы дубильных веществ (таблица 40).
Результаты оценки точности методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид в листьях скумпии кожевенной (исходное содержание 0,2273 мг/мл) Уровень концентраций Расчетное содержаниесуммыфлавоноидов,мг/мл Найденное содержаниесуммыфлавоноидов,мг/мл Открываемость, R,% Метрологические характеристики I 0,1515 0,1557 102,79 X = 100,57Ж» = 1,8435ДЖ = ±1,83% 0,1515 0,1524 100,57 0,1515 0,1472 97,13 II 0,11365 0,1134 99,78 0,11365 0,1152 101,32 0,11365 0,1136 99,98 III 0,07577 0,0766 101,15 0,07577 0,0752 99,25 0,07577 0,0782 103,18 Приведенные экспериментальные расчеты показывают, что на всех трех уровнях концентраций получаются сопоставимые результаты, а относительное стандартное отклонение составило ±1,83%.
Таким образом, показано, что методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид является линейной, воспроизводимой и точной, то есть валидной, и может применяться для установления качества сырья – листьев скумпии кожевенной по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид.
Содержание суммы флавоноидов в листьях скумпии кожевенной в пересчете на мирицетин-3-рамнозид должно быть не менее 1,0%.
При определении сроков годности листьев скумпии кожевенной руководствовались требованиями ОСТа 42-3-84 и [61].
Исследования по установлению срока годности листьев скумпии кожевенной проводили с 2013 по 2015 годы. Образцы сырья представляли собой листья скумпии кожевенной, заготовленные в различных районах Ставропольского края. Сырье сбора 2013 года хранили в естественных условиях в испытательной лаборатории кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России в темном прохладном месте с относительной влажностью не более 60% и температуре окружающего воздуха 20-25С. Исследуемые образцы сырья помещали по 100,0 г в пакеты бумажные по ГОСТ 24370-80 (3 экспериментальные серии в каждой упаковке). Контроль качества образцов сырья проводили по следующим показателям: 1. Внешние признаки; 2. Числовые показатели; 3. Микробиологическая чистота; 4. Количественное содержание дубильных веществ в пересчете на танин и суммы флавоноидов в пересчете на мирицетин-3-рамнозид. Полученные результаты приведены в таблицах 41 и 42.