Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы
1.1. Ботаническая характеристика рода Arisaema. 15
1.2. Характеристика видов ариземы.
1.2.1. Аризема единокровная - Arisaema consanguineum 18 Schott.
1.2.2. Аризема амурская - Arisaema amurense Maxim. 19
1.2.3. Аризема красноватая - Arisaema erubescens 21 Schott.
1.2.4. Аризема разнолистная - Arisaema heterophyllum 22 Blume.
1.3. Заготовка сырья. 24
1.4. Химический состав видов ариземы. 25
1.5. Фармакологические свойства и применение в 28 научной медицине. Применение в народной и традиционной медицине (Китай, Вьетнам, РФ).
1.6. Сведения о фармакогностическом изучении 35 различных видов ариземы и стандартизации лекарственного растительного сырья.
Выводы к главе первой.
Глава 2 Объекты, материалы и методы исследования
2.1. Объекты и материалы исследования 38
2.2. Методы качественного и количественного 39 химического анализа
2.2.1. Качественное определение флавоноидов методом 41 ТСХ и ВЭЖХ
2.2.2. Количественное определение флавоноидов 43 спектрофотометрическим методом
2.2.3. Качественное определение сапонинов методом 43 ТСХ
2.2.4. Количественное определение сапонинов 43 спектрофотометрическим методом
2.2.5. Определение состава липофильной фракции 44 методом газовой хромато-масс-спектрометрии
2.2.6. Определение содержания дубильных веществ 45
ГЛАВА 1 Обзор литературы
1.1. Ботаническая характеристика рода Arisaema. 15
1.2. Характеристика видов ариземы.
1.2.1. Аризема единокровная - Arisaema consanguineum 18 Schott .
1.2.2. Аризема амурская - Arisaema amurense Maxim. 19
1.2.3. Аризема красноватая - Arisaema erubescens Schott.
1.2.4. Аризема разнолистная - Arisaema heterophyllum Blume.
1.3. Заготовка сырья. 24
1.4. Химический состав видов ариземы. 25
1.5. Фармакологические свойства и применение в научной медицине. Применение в народной и традиционной медицине (Китай, Вьетнам, РФ).
1.6. Сведения о фармакогностическом изучении различных видов ариземы и стандартизации лекарственного растительного сырья.
Выводы к главе первой.
Глава 2 Объекты, материалы и методы исследования
2.1. Объекты и материалы исследования 38
2.2. Методы качественного и количественного химического анализа
2.2.1. Качественное определение флавоноидов методом 41 ТСХ и ВЭЖХ
2.2.2. Количественное определение флавоноидов спектрофотометрическим методом
2.2.3. Качественное определение сапонинов методом ТСХ
2.2.4. Количественное определение сапонинов спектрофотометрическим методом
2.2.5. Определение состава липофильной фракции методом газовой хромато-масс-спектрометрии
2.2.6. Определение содержания дубильных веществ 45
2.2.7. Определение содержания аминокислот 46
-2 2.2.8.
Определение содержания полисахаридов
2.2.9. Определение содержания свободных органических кислот
2.2.10. Определение содержания суммы свободных и связанных Сахаров
2.3. Методы фармакологических исследований 50
2.3.1. Определение острой токсичности 51
2.3.2. Определение хронической токсичности 51
2.3.3. Изучение противовоспалительной активности 52
2.3.4. Изучение седативной активности 53
2.3.5. Изучение антидепрессивной активности 53
2.4. Методы определение некоторых числовых показателей
2.4.1. Определение влажности сырья 55
2.4.2. Определение содержания экстрактивных веществ 55
2.4.3. Определение золы общей 56
2.4.4. Определение золы, нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты
2.5. Статистическая обработка 58
2.6. Морфолого - анатомическое исследование 58
ГЛАВА 3 Изучение химического состава клубнелуковиц ариземы единокровной
3.1. Определение основных групп БАВ 60
3.2. Определение состава липофильной фракции методом газовой хромато-масс-спектрометрии
3.3. Определение состава гидрофильной фракции
3.3.1. Определение содержания дубильных веществ 64
3.3.2. Определение содержания полисахаридов 6 5
3.3.3. Определение содержания свободных органических кислот
3.3.4. Определение содержания суммы свободных и связанных Сахаров
3.4. Определение содержания флавоноидов 69
3.4.1. Идентификации флавоноидов в сырье ариземы 69
единокровной методом ТСХ.
-3 3.4.2. Идентификации флавоноидов в сырье ариземы единокровной методом ВЭЖХ/МС
3.4.3. Количественное определение суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом
3.5. Определение содержания сапонинов 87
3.5.1. Определение сапонинов методом ТСХ 87
3.5.2. Количественное определение суммы сапонинов спектрофотометрическим методом
3.6. Определение содержания аминокислот 96
Выводы к главе третьей
Глава 4 Изучение фармакологических свойств ариземы единокровной
4.1. Определение острой токсичности 101
4.2. Определение хронической токсичности 103
4.3. Изучение противовоспалительной активности 104
4.4. Изучение седативной активности 109
4.5. Изучение антидепрессивной активности 111
Выводы к главе четвертой.
Глава 5 Исследование морфолого -анатомических признаков клубнелуковиц ариземы единокровной .
5.1. Изучение внешних признаков сырья ариземы единокровной
5.2. Изучение анатомического строения клубнелуковиц ариземы единокровной.
Выводы к главе пятой.
ГЛАВА 6 Определение некоторых числовых показателей сырья
6.1. Определение содержания экстрактивных веществ 120
6.2. Определение влажности сырья 122
6.3. Определение золы общей 122
6.4. Определение золы, нерастворимой в 10 % 123 хлористоводородной кислоте
Выводы к главе шестой.
Общие выводы.
Список использованной литературы.
2.2.7. Определение содержания аминокислот 46
-2 2.2.8.
Определение содержания полисахаридов
2.2.9. Определение содержания свободных органических кислот
2.2.10. Определение содержания суммы свободных и связанных Сахаров
2.3. Методы фармакологических исследований 50
2.3.1. Определение острой токсичности 51
2.3.2. Определение хронической токсичности 51
2.3.3. Изучение противовоспалительной активности 52
2.3.4. Изучение седативной активности 53
2.3.5. Изучение антидепрессивной активности 53
2.4. Методы определение некоторых числовых 55
показателей
2.4.1. Определение влажности сырья 55
2.4.2. Определение содержания экстрактивных веществ 55
2.4.3. Определение золы общей 56
2.4.4. Определение золы, нерастворимой в 10 % 57 растворе хлористоводородной кислоты
2.5. Статистическая обработка 58
2.6. Морфолого - анатомическое исследование 58
ГЛАВА 3 Изучение химического состава клубнелуковиц ариземы единокровной
3.1. Определение основных групп БАВ 60
3.2. Определение состава липофильной фракции методом газовой хромато-масс-спектрометрии
3.3. Определение состава гидрофильной фракции
3.3.1. Определение содержания дубильных веществ 64
3.3.2. Определение содержания полисахаридов
3.3.3. Определение содержания свободных органических кислот
3.3.4. Определение содержания суммы свободных и связанных Сахаров
3.4. Определение содержания флавоноидов 69
3.4.1. Идентификации флавоноидов в сырье ариземы единокровной методом ТСХ.
-3 3.4.2. Идентификации флавоноидов в сырье ариземы единокровной методом ВЭЖХ/МС
3.4.3. Количественное определение суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом
3.5. Определение содержания сапонинов 87
3.5.1. Определение сапонинов методом ТСХ 87
3.5.2. Количественное определение суммы сапонинов спектрофотометрическим методом
3.6. Определение содержания аминокислот 96
Выводы к главе третьей.
Глава 4 Изучение фармакологических свойств ариземы единокровной
4.1. Определение острой токсичности 101
4.2. Определение хронической токсичности 103
4.3. Изучение противовоспалительной активности 104
4.4. Изучение седативной активности 109
4.5. Изучение антидепрессивной активности 111
Выводы к главе четвертой.
Глава 5 Исследование морфолого -анатомических признаков клубнелуковиц ариземы единокровной .
5.1. Изучение внешних признаков сырья ариземы единокровной
5.2. Изучение анатомического строения клубнелуковиц ариземы единокровной.
Выводы к главе пятой.
Глава 6 Определение некоторых числовых показателей сырья
6.1. Определение содержания экстрактивных веществ 120
6.2. Определение влажности сырья 122
6.3. Определение золы общей 122
6.4. Определение золы, нерастворимой в 10 % 123 хлористоводородной кислоте
Выводы к главе шестой.
Общие выводы.
Список использованной литературы.
- Аризема амурская - Arisaema amurense Maxim.
- Аризема единокровная - Arisaema consanguineum 18 Schott
- Качественное определение сапонинов методом
- Определение содержания свободных органических кислот
Введение к работе
Актуальность темы.
Лекарственные средства растительного происхождения широко используются в медицинской практике. Они обладают разнообразными фармакологическими свойствами, низкой токсичностью и ценовой доступностью. Расширение ассортимента фитопрепаратов за счет рационального использования ресурсов дикорастущих лекарственных растений в различных регионах мира открывает новые возможности для фармацевтической науки и медицины.
Природное разнообразие флоры Юго-Восточной Азии представлено широким спектром пищевых, лекарственных, декоративных и технических растений. Однако, следует отметить слабую изученность многих перспективных для медицины видов с позиций ботанического ресурсоведения и фармакогностического анализа. К таким растениям относятся и виды рода Аризема (Arisaema).
Род Аризема, включает более 150 видов, произрастающих, в основном, в странах Юго – Восточной Азии, в Китае, на Дальнем Востоке РФ, в тропической зоне Африки.
Виды ариземы известны как декоративные и лекарственные растения.Они достаточно широко используются в традиционной медицине Китая : наружно в качестве отвлекающих средств в составе мазей, а также сырье, прошедшее специальную обработку, применяется как отхаркивающее средство. Лекарственные препараты из ариземы используются также при некоторых заболеваниях желудочно-кишечного тракта.
Порошок клубнелуковиц некоторых видов ариземы или сухой экстракт входит
в состав комплексных китайских препаратов, разрешенных к медицинскому
применению в ряде стран, в том числе и в России. В народной медицине сок
клубней ариземы применяется в качестве противоревматического,
антианемического, антисептического, противовоспалительного средства.
С фармакогностической точки зрения растения рода Аризема изучены недостачно: сырье трех видов ариземы (ариземы амурской, ариземы разнолистной, ариземы красноватой) включено в настоящее время только в Государственную Фармакопею КНР.
Аризема единокровная, произрастающая во Вьетнаме, используется в
народной медицине в качестве отхаркивающего, противосудорожного,
противовоспалительного средства.
Сведения о химическом составе растения весьма разноречивы.
Фармакологические свойства препаратов ариземы единокровной не изучались. В то же время растение достаточно широко распространено на территории Вьетнама и может обеспечить сырье для производства лекарственных средств.
Все изложенное выше свидетельствует об актуальности
фармакогностического изучения ариземы единокровной (Arisaema consanguineum Schott.) как перспективного источника биологически активных веществ и внедрения нового вида лекарственного растительного сырья (ЛРС) в медицинскую практику Вьетнама.
Степень разработанности темы исследования. Несмотря на то, что некоторые виды ариземы (аризема амурская, аризема красноватая, аризема разнолистная) используются в традиционной китайской медицине (ТКМ), в народной медицине Социалистической Республики Вьетнам (СРВ) и РФ, аризема единокровная не нашла медицинского применения в научной медицине из-за недостаточный изученности химического состава и фармакологических свойств.
Цель настоящего исследования. Целью данной работы является
информационно – аналитическое исследование данных литературы о растениях рода Arisaema : обоснование перспективности углубленного фармакогностического и фармакологического изучения ариземы единокровной; изучение химического состава сырья, его морфолого – анатомических особенностей; проведение исследований по стандартизации сырья с использованием современных методов анализа для разработки проекта НД и внедрения ариземы единокровной в медицинскую практику Вьетнама.
Постановка задач и выбор средств для их решения. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить литературу по фармакогностическому анализу, фармакологии,
химическому составу, методам анализа основных действующих веществ
ариземы единокровной.
-
С помощью качественных реакций и методов хроматографического анализа определить качественный химический состав клубнелуковиц ариземы единокровной.
-
Изучить состав липофильных соединений клубнелуковищ ариземы единокровной.
-
Разработать методики идентификации и количественного определения флавоноидов в сырье.
-
С помощью современных физико-химических методов анализа исследовать качественный состав и определить количественное содержание аминокислот, свободных и связанных сахаров, полисахаридов, дубильных веществ, свободных органических кислот.
-
Разработать методики идентификации и количественного определения сапонинов в сырье ариземы единокровной.
-
Провести оценку острой и хронической токсичности, а так же некоторых видов фармакологической активности изучаемого растения.
-
Исследовать морфологические и анатомо-диагностические признаки клубнелуковиц ариземы единокровной.
-
Определить числовые показатели сырье ариземы единокровной (влажности, золы общей, золы нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты и экстрактивных веществ).
10. На основе полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи на клубнелуковицы ариземы единокровной для включения в ГФ СРВ. Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.
Научная новизна.
Впервые проведено информационно-аналитическое исследование данных о растениях рода аризема и обоснована перспективность фармакогностического и фармакологического изучения ариземы единокровной.
Проведено фармакогностическое исследование сырья ариземы единокровной с целью изучения химического состава, фармакологических свойств, разработки характеристик подлинности и показателей качества.
Впервые в результате проведенных исследований с использованием методов хроматографии (ТСХ) получены новые данные о качественном составе биологически активных веществ в клубнелуковицах ариземы единокровной: флавоноидов, сапонинов, аминокислот, свободных и связанных сахаров. Изучен состав липофильной фракции и установлено наличие 16 соединений, в том числе: этилового эфира пальмитиновой кислоты, п-цимола, ментона, бутановой кислоты, н-цетилового спирта, ментола и камфоры. Впервые разработаны методики для клубнелуковиц ариземы единокровной и подобраны условия количественного определения с использованием спектрофотометрического метода флавоноидов, сапонинов. С использованием аминокислотного анализа выявлен качественный и количественный состав аминокислот в клубнелуковицах ариземы единокровной. Обнаружено 19 аминокислот из них 9 незаменимых. В процессе исследования качественного и количественного состава сахаров в клубнелуковицах ариземы единокровной методом ВЭЖХ установлено, что в качестве свободных сахаров присутствуют фруктоза и глюкоза, а связанные сахара представлены глюкозой, маннозой, ксилозой, галактозой и арабинозой. В клубнелуковицах определено количественное содержание полисахаридов, дубильных веществ и свободных органических кислот.
Выявлены диагностически значимые морфолого-анатомические признаки сырья, позволяющие проводить диагностику клубнелуковиц ариземы единокровной.
Определена острая и хроническая токсичность сырья ариземы единокровной, изучена фармакологическая активность и установлено противовоспалительное, седативное и антидепрессивное действие. Определены числовые показатели: влажность, зола общая, зола не растворимая в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, сумма экстрактивных веществ, извлекаемых водой, сумма флавоноидов в пересчете на шафтозид (апигенин 8-С--L-арабинозид 6-С--D-глюкозид).
Теоретическая значимость работы. Представленный в работе экспериментально - практический материал может служить теоретической базой для исследования и создания лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья «Клубнелуковицы ариземы единокровной». Использование
предложенных физико-химических методов анализа позволит систематизировать контроль качества и стандартизацию клубнелуковиц ариземы единокровной.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:
методики идентификации и количественного определения флавоноидов в клубнелуковицах ариземы единокровной.
получены экспериментальные данные, подтверждающие эффективность применения изучаемого вида ариземы во Вьетнамской традиционной медицине в качестве противовоспалительного, седативного и антидепрессивного средства.
результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры
фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по теме «Лекарственное растительное сырье, содержащее флавоноиды».
разработан проект нормативного документа на сырье «Клубнелуковицы ариземы единокровной» для ГФ СРВ с учетом гармонизации требований к качеству сырья, предъявляемых в фармакопеях различных стран и представлен на рассмотрение для включения его в ГФ СРВ.
Методология и методы исследования. Объектами исследования служили клубнелуковицы ариземы единокровной, собранные в стадии цветения, высушенные в естественных условиях (теневая сушка). Методология исследования заключалась в изучении и обобщении литературных данных по теме исследования, оценке степени разработанности и актуальности темы, постановке цели и задач исследования по разработке методик анализа, идентификации и определении содержания сапонинов, флавоноидов и других БАВ ЛРС, формулировании выводов, определяющих теоретическое и практическое значение результатов работы. При выполнении работы были использованы методы хроматографии в тонком слое сорбента, спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГХ/МС. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ГФ XII изд. (ОФС 42-0111-09). Морфолого-анатомический анализ сырья проводили в соответствии с техникой и требованиями, описанными в ГФ СССР XI изд., для изучения фармакологической активности ариземы единокровной использовали общепринятые методики.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных статей, полностью отражающих содержание диссертации; из них 5 статей в изданиях, включенных в «Перечень рецензируемых научных журналов» рекомендованных ВАК РФ.
Степень достоверности результатов. Для получения результатов по качественному и количественному содержанию основных биологически активных веществ (БАВ) были проведены исследования по анализу трех серий лекарственного растительного сырья (в достаточном числе повторностей от 6). Сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки и выборов критериев при фармакологических исследованиях позволяют считать их достоверными.
Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на пяти научных конференциях: на конференции «V Международный молодежной медицинский конгресс» Санкт-Петербург, 06.12.2013 г; на II научно - практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» Москва, 27.02.2014 г; на «II Всероссийской научной интернет – конференции с международным участием» Казань, 16.12.2014 г; на XXV Московской международной гомеопатической конференции: «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» Москва, 23.01.2015 г; на III Научно - практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» Москва, 19.02.2015 г. Апробация диссертации прошла на научной межкафедральной конференции кафедр фармакогнозии, фармацевтической и токсической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, и лаборатории НИИ Фармации Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Личный вклад автора. При непосредственном участии автора были определены цели и задачи работы, разработаны методические подходы к их выполнению; был проведен сбор, обобщение и анализ литературных данных. Диссертант принимал непосредственное участие при разработке методик идентификации и количественного определения содержания основных групп БАВ в исследуемом объекте. Автору принадлежит ведущая роль при проведении
экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций, докладов и проекта нормативного документа на сырье ариземы единокровной. Диссертация и автореферат написаны лично автором.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2,3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно – исследовательских работ ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ (№ государственной регистрации: 01201168237) по научной проблеме «Совершенствование образовательных технологий додипломного и последипломного медицинского и фармацевтического образования». Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты изучения качественного состава и определения количественного
содержания биологически активных веществ (органических кислот, свободных
и связанных сахаров, дубильных веществ, флавоноидов, сапонинов,
полисахаридов, аминокислот) в сырье ариземы единокровной.
Результаты изучения фармакологическиой активности сырья ариземы
единокровной. Результаты морфолого-анатомического изучения сырья ариземы единокровной. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, содержит 38 таблиц и 37 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 экспериментальных глав, выводов, библиографии из 107 наименований, из которых 23 на иностранных языках, интернет - ресурсов, и приложения.
Аризема амурская - Arisaema amurense Maxim.
Многолетнее травянистое клубнелуковичное растение, вид рода Аризема (Arisaema) семейства Ароидные (Агасеае). Клубень шарообразной формы, 1,5 - 4 см в диаметре. Лист один, листовая пластинка пальчатораздельная, доли в числе 7 - 14, на вершине острые, черешок длиной 20 - 45 см, зелено-серый, чуть коричневый, поперечно - полосатый или пятнистый. Соцветие - типичное для рода, с нитевидно вытянутой верхушкой и вертикальными светлыми полосами в нижней половине покрывала (рис. 1.1 и 1.2).
Распространение: во Вьетнаме (Лаокай, Хазанг, Каобанг, Контум, Хоабинг), в Индии, Китае, Таиланде [36].
Во время цветения цветок имеет запах рыбы, кончик початка и покрывало сильно окрашены, на обеих сторонах покрывала видны капли нектара, около каждой щели находится капля, щель может закрываться [19,60].
Многолетнее травянистое растение. Корнеклубни почти шарообразные, 2 - 5 см в диаметре. Лист один, сидит на черешке 17 - 30 см длиной; листовое влагалище фиолетовое, охватывает 1/3 часть длины черешка. Пластинка листа пяти раздельная, ее доли обратнояйцевидно-ланцетные или овальные, цельнокрайние, концы коротко заостренные, основание клиновидное. Боковые доли листа сидят по две на черешке до 1 см длиной, средняя доля 7 - 12 см длиной, 4 - 7 см шириной, имеет черешок до 2 см длиной. Цветонос короче черешка. Трубка крыла соцветия воронковидная, зеленая или фиолетовая с белыми продольными полосками; пластинка крыла острая на конце. Цветет в конце апреля -начале июня; плоды созревают в июне - июле. Соцветие - початок. Мужское соцветие с широко расставленными цветками, около 2 см, женское - 1 см длиной. Початок в период плодоношения утолщается, после окончания периода плодоношения он становится фиолетово - красным. Расположение нектарников такое же, как у Arisaema consanguineum, но выделение нектара происходит посредством диффузии через наружные стенки эпидермиса, щели образуются редко. Плоды - красные, узкоконические ягоды. Семена в числе 4, красные, яйцевидные, гладкие
Осенью початок, унизанный сочными алыми ягодами, виден издалека. Но лучше его не трогать: дело в том, что растение сильно ядовито, и вызывает ожоги кожи и слизистой оболочки; нужно быть очень осторожным с этим растением.
Распространена на Дальнем Востоке - Россия (Хабаровский край, Приморье, Сахалин), Китай (Хэбэй, Хэйлунцзян, Цзилинь, Ляонин, Внутренняя Монголия, Шаньси, Шаньдун), Корея.
Аризема амурская - реликтовый вид. Растёт в лиственных и смешанных лесах, среди деревьев, на полянах и опушках кедрово-широколиственных лесов, по берегам рек, на высоте не выше 100 - 200 м над уровнем моря. [11, 21, 22, 42,47,51, 59,60,62,80]. -20 Культивирование. Культура этого растения непростая. Перспективнее всего культивировать его на юге Приморского края.
Многолетнее травянистое клубневое растение, вид рода Аризема (Arisaema) семейства Ароидные (Агасеае). Клубень сжато - шаровидный, 2 - 7 см в диаметре. Катафиллов три, тёмно-зелёные, с беловатыми полосками и пятнами, до 55 см длиной, на вершине острые. Лист один, иногда два. Черешок зелёный, гладкий, без пятен, до 100 см длиной и около 2 см в диаметре, вложенный примерно до 50 см во влагалища, образующие ложный стебель. Листовая пластинка пальчатораздельная; листочки сидячие, в числе 18-23, зелёные снизу, сверху тускло - зелёные, узкоовальные или узколинейные, 18 - 28 см длиной, 2-20 мм шириной, в основании клиновидные, на вершине длиннозаострённые, с хвостовидным образованием с нитевидной частью 7 - 10 см длиной. Жилки снизу приподнятые, сверху утопленные; боковые жилки многочисленные, косовосходящие. Соцветия и цветки: Цветоножка короче черешков, до 75 см длиной, со свободной частью около 9 см длиной. Покрывало зелёное, с неясными беловатыми продольными полосками или без них; трубка цилиндрическая, 6 - 7 см длиной, около 1,5 см в диаметре, края устья
Многолетнее травянистое клубнелуковичное растение, вид рода Аризема (Arisaema) семейства Ароидные (Агасеае). Клубень шарообразной формы, 1,5 - 4 см в диаметре. Лист один, листовая пластинка пальчатораздельная, доли в числе 7 - 14, на вершине острые, черешок длиной 20 - 45 см, зелено-серый, чуть коричневый, поперечно - полосатый или пятнистый. Соцветие - типичное для рода, с нитевидно вытянутой верхушкой и вертикальными светлыми полосами в нижней половине покрывала (рис. 1.1 и 1.2).
Распространение: во Вьетнаме (Лаокай, Хазанг, Каобанг, Контум, Хоабинг), в Индии, Китае, Таиланде [36].
Во время цветения цветок имеет запах рыбы, кончик початка и покрывало сильно окрашены, на обеих сторонах покрывала видны капли нектара, около каждой щели находится капля, щель может закрываться [19,60].
Многолетнее травянистое растение. Корнеклубни почти шарообразные, 2 - 5 см в диаметре. Лист один, сидит на черешке 17 - 30 см длиной; листовое влагалище фиолетовое, охватывает 1/3 часть длины черешка. Пластинка листа пяти раздельная, ее доли обратнояйцевидно-ланцетные или овальные, цельнокрайние, концы коротко заостренные, основание клиновидное. Боковые доли листа сидят по две на черешке до 1 см длиной, средняя доля 7 - 12 см длиной, 4 - 7 см шириной, имеет черешок до 2 см длиной. Цветонос короче черешка. Трубка крыла соцветия воронковидная, зеленая или фиолетовая с белыми продольными полосками; пластинка крыла острая на конце. Цветет в конце апреля -начале июня; плоды созревают в июне - июле. Соцветие - початок. Мужское соцветие с широко расставленными цветками, около 2 см, женское - 1 см длиной. Початок в период плодоношения утолщается, после окончания периода плодоношения он становится фиолетово - красным. Расположение нектарников такое же, как у Arisaema consanguineum, но выделение нектара происходит посредством диффузии через наружные стенки эпидермиса, щели образуются редко. Плоды - красные, узкоконические ягоды. Семена в числе 4, красные, яйцевидные, гладкие
Многолетнее травянистое клубневое растение, вид рода Аризема (Arisaema) семейства Ароидные (Агасеае). Клубень сжато - шаровидный, 2 - 7 см в диаметре. Катафиллов три, тёмно-зелёные, с беловатыми полосками и пятнами, до 55 см длиной, на вершине острые. Лист один, иногда два. Черешок зелёный, гладкий, без пятен, до 100 см длиной и около 2 см в диаметре, вложенный примерно до 50 см во влагалища, образующие ложный стебель. Листовая пластинка пальчатораздельная; листочки сидячие, в числе 18-23, зелёные снизу, сверху тускло - зелёные, узкоовальные или узколинейные, 18 - 28 см длиной, 2-20 мм шириной, в основании клиновидные, на вершине длиннозаострённые, с хвостовидным образованием с нитевидной частью 7 - 10 см длиной. Жилки снизу приподнятые, сверху утопленные; боковые жилки многочисленные, косовосходящие. Соцветия и цветки: Цветоножка короче черешков, до 75 см длиной, со свободной частью около 9 см длиной. Покрывало зелёное, с неясными беловатыми продольными полосками или без них; трубка цилиндрическая, 6 - 7 см длиной, около 1,5 см в диаметре, края устья
Аризема единокровная - Arisaema consanguineum 18 Schott
Методика. 1 г изучаемого сырья измельченных до размера частиц проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в кругло донную коническую колбу с притертой пробкой. Прибавляли 10 мл 70 % этанола и нагревали на водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения фильтровали через бумажный фильтр в пробирку (раствор А).
На хроматографическую пластинку «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» размеров 10x15 см наносили в первую точку 15 мкл раствора А, во вторую точку 15 мкл 0,1 % раствора эсцина в 70 % этаноле. Пластинку помещали в хроматографическую камеру, с ПФ н-бутанол - кислота уксусная ледяная -вода (5:1:4) и хроматографировали восходящим способом в течение 30 мин. Когда фронт растворителей пройдет около 10 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе до удаления растворителей, опрыскивали 10 % раствором кислоты серной в 40 % этаноле и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100- 105Св течение 5 мин.
Приготовление раствора РСО 0,015 % эсцина: 0,015 г вещества помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 100 мл спирта этилового 70 %, растворяли и доводили до метки спиртом этиловым 70 %, перемешивали [30].
Методика. Сырье измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. При изготовлении извлечений из одной весовой части лекарственного растительного сырья получали 5 объемных частей готового продукта (экстраген - 95 % этанол ).
Полученные извлечения отставляли при температуре не выше 10 С до получения прозрачной жидкости не менее 2 суток и фильтровали (ГФ XI).
Исследование проводили на приборе «Agilent Technologies», состоящем из: 1) газового хроматографа 7890 (колонка НР-5, 50 м х 320 мкм х 1,05 мкм) и 2) масс-селективного детектора 5975 С с квадрупольным масс-ана-лизатором. Температурная программа хроматографирования: при 40 С - изотерма 2 мин; далее программируемый нагрев до 250 С со скоростью 5 С/мин; при 250 С - изотерма 15 мин; далее программируемый нагрев до 320 С со скоростью 25С/ мин; при 320 С -изотерма 5 мин. Инжектор с делением потока 1:50. Температура инжектора 250 С. Температура интерфейса 280 С. Газ-носитель - гелий; скорость потока - 1мл/мин. Хроматограмма образцов - по полному ионному току. Условия масс - спектрометрического анализа: энергия ионизирующих электронов 70 эВ; регистрация масс - спектров в положительных ионах в диапазоне (m/z) от 20 до 450 со скоростью 2,5 скан/сек. Программное обеспечение - ChemStation Е 02.00. Идентификация компонентного состава (качественный анализ) проведена по библиотеке полных масс - спектров NIST-05 и соответствующим значениям хроматографических линейных индексов удерживания (7lin). Относительное содержание (%) компонентов смеси (количественный анализ) вычислено из соотношения площадей хроматографических пиков методом простой нормировки.
Определение дубильных веществ в объектах проводили в соответствии с методикой ОФС ГФ XI «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье» [35].
Методика. Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья, просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливали 250 мл нагретой до кипения воды и кипятили с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Жидкость охлаждали до комнатной температуры и процеживали около 100 мл в коническую колбу вместимостью 200-250 мл через вату так, чтобы частицы сырья не попали в колбу. Затем отбирали пипеткой 25 мл полученного извлечения в другую коническую колбу вместимостью 750 мл, прибавляли 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании раствором перманганата калия (0,02 моль/л) до золотисто - желтого окрашивания. Параллельно проводили контрольный опыт. 1 мл раствора перманганата калия (0,02 моль/л) соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин. Содержание дубильных веществ (X) в процентах в пересчете
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 0,5 мм. Пробу массой 1,0 г (точная навеска) помещали в круглодонную колбу со шлифом, прибаляли 20 мл 70 % спирта этилого, взвешивали с точностью ± 0,01 г и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Затем охлаждали до комнатной температуры, взвешивали и при необходимости доводили 70 % спиртом этиловым до первоначальной массы. Полученное извлечение фильтровали через бумажный фильтр. Первые 10 мл фильтрата отбрасывали. Из последующей порции элюата отбирали 50 мкл и упаривали досуха в вакуумном испарителе фирмы «Servanta». Сухой остаток растворяли в 200 мкл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, нагревали на водяной бане в течение 15 мин при температуре 60 " С, перемешивали и центрифугировали в течение 3 мин при 4000 оборотах. Для анализа использовали 50 мкл полученного гидролизата.
Аминокислотный анализ водорастворимых фракций проводили на аминокислотном анализаторе модель 835 на стальной колонке (0,4 х 15 см), заполненной катионно - обменной смолой марки 2619 (Hitachi custom Ion -Exchange Resin). Разделение аминокислот проводилось в 3 системах натрий - цитратных буферных растворов: 0,18Н рН 3,25; 0,ЗН рН 3,9; 1,6Н рН 4,75. Нингидриновый реактив готовили с использованием метилового эфира этиленгликоля. Цитратные буферные растворы подавали в колонку по стандартной программе со скоростью 32 мл/ч, нингидриновый реактив со скоростью 20 мл/ч. После выхода из аналитической колонки разделенные аминокислоты смешивались с нингидриновым реактивом в смесительном блоке в соотношении 2:1. Реакция аминокислот с нингидриновым реактивом проходила за 4 мин при температуре 100 С в реакционной бане. Колориметрическое определение окрашенных комплесов, образующихся в результате реакции с нингидрином, проводится непрерывно и одновременно при 2 длинах волн. Первичные амины давали пурпурную окраску, плотность которой измеряли при длине волны 570 нм, а вторичные - пролин и оксипролин образовывали соединения желтой окраски (плотность измеряли при длине волны 440 нм).
Качественное определение сапонинов методом
Оптимальными условиями извлечения сапонинов из сырья ариземы единокровной являются: экстрагент - 95 % этанол, соотношение сырья и экстрагента 1:100, измельченность сырья - 1-2 мм, нагревание на кипящей водной бане 60 мин, двухкратная экстракция.
Полученные результаты были использованы при разработки методика количественного определения сапонинов в сырье ариземы единокровной.
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размер частиц, проходящих через сито с диаметром отверстий 2мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья, помешали в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 60 мл 95 % этанола, подкисленного кислотой хлористоводородной концентрированной присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 мин. После чего извлечение охлаждали под струей холодной воды до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попали на фильтр.
Шрот в круглодонной колбе заливают 40 мл 95 % этанола подкисленного кислотой хлористоводородной концентрированной и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 мин. Извлечение охлаждали под струей холодной воды и фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Клуглодонную колбу и осадок на фильтре промывали 5 мл 95% этанола подкисленного и доводят объем раствора тем же этанолом до метки (раствор А).
2 мл раствора А в выпарительной чашке упаривают на кипящей водяной бане досуха, охлаждали. После охлаждения осадок растворяли в 5 мл воды и переносят в стеклянную колонку диаметром 10 мм и длиной 25 мм с 3 г алюминия оксида II степени активности. Выпарительную чашку промывали 5 мл воды и приливали раствор в ту же колонку. Элюент -93 собирают в другую выпарительную чашку, когда раствор пройдет через колонку, выпарительную чашку с элюентом ставят на кипящую водяную баню и выпаривали элюент досуха. Сухой остаток охлаждали и количественно переносят 95% этанолом в мерную колбу, вместимостью 25 мл. Объем раствора в колбе доводили до метки 95% этанолом и перемешивали (раствор Б).
В пробирку с притертой пробкой отмеривают 2 мл раствора Б и осторожно по стенке пробирки прибавляли 8 мл кислоты серной концентрированной и тщательно перемешивали.
Через 20 мин. измеряют оптическую плотность при длине волны 328 ± 3 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь: 2 мл 95% этанола и 8 мл кислоты серной концентрированной (раствор В).
Содержание сапонинов в процентах в пересчете на эсцин и абсолютно сухое сырье (X) вычисляли по формуле : W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах. Примечание: приготовление 95 % этанола подкисленного кислотой хлористоводородной концентрированной. В мерную колбу вместимостью 100 мл отмеривали 50 мл 95 % этанола, добавляли 0,5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и перемешали. Доводят объем раствора в колбе 95 % до метки и перемешивали.
Для установления точности и воспроизводимости методика была проведена статическая обработка полученых результатов. Из табл. 24. следует, что ошибки единичного определения сапонинов в клубнелуковицах ариземы единокровной при доверительной вероятности 0,95 составляет ± 4,71 %. Для установления систематической ошибки использовали метод добавок стандарта эсцина. Полученые результаты представлены табл. 25.
Анализируя полученные данные можно сделать следующие заключение, что с помощью разработанной методики возможно определить малые количества сапонинов с достаточной точностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ± 5 % [13].
В настоящее время из различных растительных источников идентифицировано более 300 свободных аминокислот и продуктов их метаболизма [28,44,63,66,86,104].
Для большинства используемых в медицине видов лекарственных растений известен качественный аминокислотный состав и количественное содержание отдельных аминокислот в сырье и препаратах из него. Известен качественный и количественный состав аминокислот в сырье калины обыкновенной, донника белого, пажитника голубого, лопуха большого [25,45,56,93,99].
Согласно полученным данным (см. табл. 27, рис. 25.), в клубнелуковицах ариземы единокровной содержится 19 аминокислот из них 9 незаменимых . В количественном отношении аминокислоты в сырье составляют 5,2 %. Преобладающими в сумме свободных аминокислот являются аргинин 16,32 %, глутаминовая кислота 16,0 %, аспарагиновая кислота 11,62 % , лейцин 7,45 %, валин 5,6 %, глицин 5,48 % [67].
Определение содержания свободных органических кислот
Для внедрения нового вида ЛРС в медицинскую практику необходимо разработать нормативную документацию, включающую перечень сведений о характеристиках подлинности и требований к качеству сырья.
К характеристикам подлинности относятся внешний вид сырья, особенности анатомического строения и качественный химический состав, присущий данному сырью. Требования к качеству ЛРС включают ряд числовых показателей, о которых речь пойдет в главе 6.
С целью разрабтки характеристик подлинности сырья ариземы единокровной нами проведено морфолого-анатомическое изучение клубнелуковиц этого вида ариземы. Результаты изучения химического состава сырья ариземы единокровной приведены в главе 3.
Характеристику внешних признаков сырья ариземы единокровной проводили в соответствии с ОФС «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы» ГФ XI [35].
Сырье ариземы единокровной представляет собой высушенные цельные или нарезанные вдоль клубнелуковицы приплюснутой формы диаметром 5-10 см. В верхней части имеется углубление с чешуевидными остатками листьев, нижняя часть выпуклая, места прикрепления корней и их остатки располагаются по кругу выше периметра клубнелуковицы. Цвет снаружи светло-коричневый, на изломе - беловато-кремовый. Запах слабый, специфический. Вкус жгучий, раздражающий
В связи с отсуствием информации о микроскопическом исследовании клубнелуковиц ариземы единокровной было проведено углубленное анатомическое изучение с целью уточнения и визуализации диагностически значимых признаков.
Микроскопические исследования анатомического строения сырья проводили согласно методикам ГФ XI и методикам, приведенным в научной литературе [35].
В результате микроскопического изучения поперечных и продольно-радиальных срезов клубнелуковиц ариземы единокровной были определены следующие анатомо-диагностические признаки.
Клубнелуковицы имеют пучковое строение. Проводящие пучки преимущественно мелкие, закрытые коллатеральные расположены и ориентированы хаотично. Покровная ткань представлена однослойным эпидермисом коричневого цвета, под которым располагаются несколько слоев крупных клеток гиподермы со слегка утолщенными одревесневающими клеточными стенками (реакция с флороглюцином) (рис. 32.). В некоторых клетках гиподермы наблюдается содержимое в виде бесцветных или оранжевых смолисто-маслянистых капель (рис. 33.). Основная паренхима состоит из округлых или слегка удлиненных клеток, заполненных крахмальными зернами (рис. 34.). Крахмальные зерна преимущественно простые, размером от 5 до 15 мкм, округлые, с крестообразной щелью в центре зерна особенно обильные скопления крахмальных зерен наблюдаются в округ проводящих пучков. Среди клеток основной паренхимы видны более крупные (до 250 мкмв диаметре) клетки со слизью (реакция с тушью) (рис. 35.). Кристаллические включения клубнелуковиц ариземы единокровной представлены двумя образованиями: 1) игольчатыми кристаллами оксалата кальция в виде рафид или беспорядочно ориентированных скоплений, расположенных в крупных клетках паренхимы (рис. 36.), 2) сферокристаллы неустановленных веществ, легко растворяющиеся в растворах кислот, размером около 45 мкм (рис. 34.). Сосуды ксилемы проводящих пучков имеют преимущественно кольчатую и крупносетчатую вторичную утолщенность клеточных стенок (рис. 37). Механические элементы отсутствуют.
В ходе исследования были определены биометрические характеристики анатомо-диагностических признаков клубнелуковиц ариземы единокровной, представленные в таблице 33. Частота встречаемости признаков на поперечном срезе приведена в таблице 34.
Проведено изучение внешних признаков сырья и установлено, что наиболее характерными являются следующие признаки: приплюснутая форма клубнелуковиц, наличие на верхушке чешуевидный остатков листьев и кольцеобразно расположенных мест прикрепления корней.
Определены анатомо-диагностические признаки клубнелуковиц ариземы единокровной с применением гистохимических реакций и биометрических характеристик. Выявлены и визуализированы диагностические признаки: строение проводящих пучков, клеток паренхимы, наличие игольчатых кристаллов оксалата кальция в виде рафид, сферокристаллов, форма и размер крахмальных зерен, а так же наличие клеток - идиобласт со слизью.
Проект нормативного документа на новый вид ЛРС помимо характеристик подлинности содержит ряд числовых показателей, определяющих качество сырья. Это каличество действующих или экстрактивных веществ, влажность, зола общая, зола нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, органическая примесь, минеральная примесь.
По требованию ГФ Вьетнама среди числовых показателей для характеристики любого вида ЛРС должно быть определение влажности, золы общей, и золы нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты.
Клубнелуковицы ариземы единокровной во Вьетнаме применяются либо в виде водного отвара, либо в виде спиртовой настойки. В связи с чем мы сочли целесообразным определить сырье содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой и 40 %, 70 %, 95 % этанолом соответственно. Определение влажности сырья было необходимо для дальнейшей количественной оценки отдельных групп БАВ.
Определение содержания экстрактивных веществ, как параметра оценки суммы биологически активных соединений в клубнелуковицах ариземы единокровной проводили по методике ГФ XI [35], используя экстрагенты различной полярности.