Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологическая, химическая и фармакологическая характеристика льнянки обыкновенной (обзор литературы) 11
1.1. Распространение, систематическое положение и ботаническое описание 11
1.2. Химический состав 14
1.3. Применение льнянки обыкновенной в народной медицине и ее биологическая активность 22
Глава 2. Объекты и методы исследований 32
2.1. Объекты исследований 32
2.2. Методы морфолого-анатомических исследований 33
2.2.1. Макроскопический анализ растительного сырья 33
2.2.2. Микроскопический анализ растительного сырья 34
2.3. Методы химического исследования 34
2.3.1. Методы качественного анализа 34
2.3.2. Методы количественного анализа 43
2.4. Методы фармакологических исследований 45
2.4.1. Острая токсичность 46
2.4.2. Диуретическая активность 46
2.4.3. Влияние на свертывающую систему крови 48
2.4.4. Антимикробная активность 49
Глава 3. Химический состав и распределение биологически активных веществ льнянки обыкновенной 50
3.1. Качественный анализ на содержание основных групп действующих веществ 50
3.2. Исследование фенольных соединений 52
3.3. Исследование иридоидных соединений 64
3.4. Исследование качественного состава углеводов 68
3.5. Динамика накопления флавоноидов и иридоидов в льнянке обыкновенной 69
3.5.1 .Динамика накопления флавоноидов 70
3.5.2. Динамика накопления иридоидов 73
3.6. Количественное определение алкалоидов в траве льнянки обыкновенной 81
3.7. Исследование качественного состава и количественного содержания липофильных веществ 82
Глава 4. Разработка технологии и фармакологические свойства экстракционных форм льнянки обыкновенной 87
4.1. Разработка технологии экстракционных форм льнянки обыкновенной 87
4.1.1. Выбор оптимального экстрагента 87
4.1.2. Выбор степени измельченности сырья 88
4.1.3. Выбор метода экстрагирования 89
4.2. Фармакологические свойства экстракционных форм льнянки обыкновенной 103
4.2.1. Исследование диуретической активности 103
4.2.2. Исследование влияния экстрактов льнянки обыкновенной на свертывающую систему крови 110
4.2.3. Изучение антимикробной активности 112
4.2.4. Острая токсичность 113
Глава 5. Разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье 115
5.1. Морфолого-анатомические особенности льнянки обыкновенной 115
5.1.1. Морфологическая характеристика льнянки обыкновенной 116
5.1.2. Анатомическая характеристика льнянки обыкновенной 123
5.2. Стандартизация лекарственного растительного сырья 141
5.3. Методика качественного обнаружения БАВ в сырье 144
5.4. Методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье 144
5.4.1. Разработка нормативной документации на государственный стандартный образец ацетилпектолинарин 144
5.4.2. Определение варианта метода спектрофотометрии и аналитической длины волны 155
5.4.3. Разработка оптимальных условий экстракции суммы флавоноидов из травы льнянки обыкновенной 157
5.4.4. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной 161
Общие выводы 167
Список литературы 169
- Применение льнянки обыкновенной в народной медицине и ее биологическая активность
- Исследование фенольных соединений
- Морфологическая характеристика льнянки обыкновенной
- Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной
Введение к работе
кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова
Актуальность темы.
Актуальной проблемой фармацевтической науки на современном этапе является создание эффективных фитопрепаратов из лекарственного растительного сырья. Это связано с тем, что при использовании синтетических препаратов часто развивается лекарственная резистентность и возникают побочные реакции, в то время как некоторые растительные вещества родственны имеющимся в организме человека, потому они малотоксичны и бесконфликтно входят в живую клетку.
Основным источником для поиска новых лекарственных растений является арсенал средств народной медицины. Наибольший интерес при этом вызывают растения, обладающие комплексным действием, так как появляется возможность применения одного средства для лечения целого ряда сопутствующих заболеваний. Например, при сердечно-сосудистых заболеваниях нередко наблюдается нарушение водно-солевого обмена и повышенная свертываемость крови, поэтому наряду с кардиотониками возникает необходимость использования мочегонных средств, относящихся к группе салуретиков и препаратов, предотвращающих развитие тромбоза.
Широкое использование льнянки обыкновенной в народной медицине при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы указывает на необходимость углубленного фармакогностического изучения этого растения, химический состав и фармакологические эффекты которого также изучены недостаточно. В связи с этим, комплексное изучение травы льнянки обыкновенной с целью внедрения ее в научную медицину является актуальным.
Цель исследования. Целью работы являлось анатомо-морфологическое и фитохимическое изучение травы льнянки обыкновенной, произрастающей в Пермском крае, исследование возможности получения экстракционных форм и установление их специфической активности и острой токсичности.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить качественный состав биологически активных веществ в траве и органах льнянки обыкновенной.
2. Разработать методику количественного определения флавоноидов спектрофотометрическим методом и составить проект нормативной документации на стандартный образец, используемый в методе количественного определения флавоноидов. Адаптировать методику количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом для травы льнянки обыкновенной.
3. Исследовать динамику накопления биологически активных веществ в траве и органах растения в зависимости от места заготовки, фазы развития и сроков хранения сырья.
4. Разработать оптимальные условия получения экстракционных форм льнянки обыкновенной, исследовать их специфическую активность и острую токсичность.
5. Провести морфолого-анатомическое исследование травы льнянки обыкновенной, выявить диагностические признаки сырья.
6. Установить показатели доброкачественности травы льнянки обыкновенной и разработать проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное фармакогностическое исследование травы льнянки обыкновенной. На основании полученных данных разработан проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».
Изучены фармакологические эффекты растения. Установлена ранее неисследованная диуретическая активность и влияние на свертывающую систему крови экстракционных форм из травы и органов льнянки обыкновенной.
Изучен химический состав травы и отдельных органов льнянки обыкновенной, а также динамика накопления основных групп биологически активных веществ в разные фазы развития.
Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной спектрофотометрическим методом. Показана целесообразность стандартизации травы льнянки обыкновенной по содержанию флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин. Разработан проект фармакопейной статьи «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец».
Впервые установлен состав липофильных веществ травы льнянки обыкновенной методом ГЖХ-МС.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований установлена возможность расширения ассортимента лекарственного растительного сырья за счет использования травы льнянки обыкновенной. Установлены основные показатели подлинности и доброкачественности растительного сырья, которые легли в основу ФС «Льнянки обыкновенной трава» и инструкции по сбору и сушке травы льнянки обыкновенной.
Для разработки методики количественного определения флавоноидов в траве льнянки обыкновенной спектрофотометрическим методом составлен проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец».
Научно обоснована целесообразность использования льнянки обыкновенной для получения экстракционных форм, оказывающих диуретическое и антикоагулянтное действие.
Основные положения, выносимые на защиту. Результаты фармакогностического, фитохимического, фармакологического исследования травы льнянки обыкновенной и экстракционных форм на ее основе, обладающих диуретической и противосвертывающей активностью.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.10018875).
Апробация полученных результатов. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования (ПГФА, Пермь, 2009 – 2012); International conference “Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine” (Saint Petersburg, 2011); Межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009); ежегодная конференция «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); IV международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, 2011); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010); конференция молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абуалиибни Сино с международным участием «Современная медицина в Таджикистане; проблемы, достижения и перспективы развития» (Душанбе, 1012); III международная научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2012).
Личное участие автора. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных, в апробации результатов исследования, подготовке основных публикаций по выполненной работе.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 18 научных работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК – 6 статей.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований, и выводов. Работа иллюстрирована 56 таблицами и 42 рисунками. Библиографический указатель включает 169 источников, из них 27 на иностранных языках.
Применение льнянки обыкновенной в народной медицине и ее биологическая активность
Первые упоминания о применении льнянки обыкновенной в народной медицине датированы XIX веком. Известный врач-эмпирик Радемахер (1859) отмечает льнянку как целебное средство при заболеваниях сосудистой системы [94].
Практика народной медицины показывает, что льнянка обыкновенная обладает рядом полезных свойств. В таблице 1 обобщены сведения о лечебных эффектах растения, используемых в народной медицине России и других стран. Льнянку используют при заболеваниях органов мочеполовой системы в качестве диуретического и противовоспалительного средства. При приеме внутрь льнянка обыкновенная оказывает стимулирующее действие на органы желудочно-кишечного тракта, растение применяют при атонии кишечника и запорах. Есть данные о влиянии растения на сердечно-сосудистую и центральную нервную систему. В корейской народной медицине льнянку обыкновенную применяют в качестве седативного средства, в Германии - при головной боли с рвотой. Наружно растение используют при различных кожных заболеваниях и в офтальмологии.
В народной медицине в качестве сырья используют надземную и подземную части растения (стебли, листья, цветки, корни), заготавливаемые во время цветения в июне - августе (в сухую солнечную погоду). Срезают растение на высоте 5-6 см от почвы. Траву льнянки высушивают в тени под навесом, на чердаках с хорошей вентиляцией или на открытом воздухе. Растение обладает неприятным запахом, который усиливается при высушивании. Вкус сырья острый, солоновато-горький [104].
Фармакологические исследования БАВ и экстракционных препаратов льнянки обыкновенной установили влияние данного растения на сердечнососудистую и центральную нервную системы [46].
Ацетилпектолинарин обладает кардиотоническим действием, увеличивая амплитуду сердечных сокращений и замедляя их ритм, при увеличении дозы вызывает гипотензивный эффект, сопровождающийся учащением и углублением дыхания [96, 105, 116]. В другое время те же авторы исследовали влияние препаратов льнянки обыкновенной на сердечно-сосудистую систему и отмечали повышение кровяного давления на 25% в течение 37 мин и последующее понижение до исходного состояния [100]; сумма флавоноидов льнянки обыкновенной повышает кровяное давление при исследовании на животных: кошках, собаках, кроликах и лягушках, вероятно, за счет снижения чувствительности холинореактивных структур. В концентрации 1:25000 препарат снимает ганглиоблокирующее действие камфоры. Следовательно, облегчение проведения тормозных импульсов происходит в области ганглиев. Этими данными авторы объясняют замедление сердечного ритма, наступающее на фоне действия суммы флавоноидов [108].
Флавоноид ацетилпектолинарин, выделенный из льнянки, по данным Рабиновича М.И. и Зельцер А.Р., относится к малотоксичным соединениям. LD50 при подкожном введении при расчете по методу Г.Н. Першина составила 825 мг/кг, при длительном введении ацетилпектолинарина в течении 30 дней никаких отклонений в состоянии подопытных животных не установлено, после вскрытия никаких патологических изменений во внутренних органах не отмечено.
Алкалоид пеганин, содержащийся в растении, согласно экспериментальным данным, оказывает легкое возбуждающее действие, вызывает умеренное слюнотечение, слезотечение, учащенное мочеиспускание, снижает кровяное давление, урежает число сердечных сокращений, повышает чувствительность мышц к ацетилхолину. Он также повышает тонус кишечника и его перистальтику, при многократном введении проявляется выраженный послабляющий и желчегонный эффекты [123]. В клинических условиях пеганин оказался эффективным при атонии, парезах, паралитической кишечной непроходимости после оперативного вмешательства [62].
Клинические испытания жидкого спиртового экстракта льнянки, проведенные профессором Д. М. Российским на больных, страдающих атонией кишечника, метеоризмом, длительными запорами, показали положительные результаты [57].
Масляный экстракт льнянки обыкновенной входит в состав крем-геля «Эндокринол», выпускаемого компанией «Эвалар». Это наружное средство специального назначения, предназначенное для кожи в области шеи, способствующее нормализации обменных процессов и повышению тургора и эластичности кожи. Регулярное применение крем-геля «Эндокринол» препятствует изменению тканей в области шеи (в том числе щитовидной железы) [169].
Использование льнянки обыкновенной в гомеопатии весьма ограничено. Растение применяют при потере сил, поносах, ночном недержании мочи и слабости мочевого пузыря [94].
В настоящее время ряд авторов активно обсуждают вопрос о возможности применения льнянки обыкновенной в ветеринарии [62, 104, 107]. Они отмечают, что сведения о токсичности растения носят противоречивый характер. Так, надземная часть является кормом для крупного и мелкого рогатого скота, однако имеются данные об отравлениях при случайном поедании свежей травы животными [62]. Отравление проявляется в слюнотечении, прекращении жвачки, поносе, затем - учащении и затруднении дыхания, ослаблении сердечной деятельности [104]. Но, тем не менее, исследованиями, проведенными на кафедре фармакологии Троицкого ветеринарного института, установлено, что галеновые формы льнянки обыкновенной малотоксичны и обладают выраженным кардиотоническим действием. Они повышают у животных кровяное давление, увеличивают амплитуду сердечных сокращений и замедляют их темп, усиливают скорость кровотока, увеличивают вольтаж зубца R электродиаграммы, уменьшают систолический показатель, удлиняют диастолический период. Препараты льнянки обыкновенной повышают тонус и увеличивают амплитуду сокращений мускулатуры тонкого кишечника животных, усиливают и учащают сократительную деятельность желудка. У коров после дачи настоя льнянки внутрь увеличивается сила и количество сокращений желудка [82].
Заболевания сердечно-сосудистой системы у животных нередко сопровождаются гипотонией желудочков. В то же время ветеринарная практика не располагает препаратами комплексного действия, стимулирующими одновременно сердечно-сосудистую систему и секреторно-моторную функцию желудочно-кишечного тракта. К таким препаратам комплексного действия можно отнести льнянку обыкновенную. Галеновые формы этого растения не обладают раздражающими свойствами, что выгодно отличает их от наперстянки и горицвета. Льнянка обыкновенная обладает мочегонным действием, увеличивает количество выделяющегося желудочного сока у животных и повышает переваривающую силу белкового фермента.
Траву или настой растения назначают внутрь в дозе 0,05 - 0,06 г сухого материала на 1 кг животной массы для лечения сердечной недостаточности у сельскохозяйственных животных, а также как слабительное и мочегонное средство.
Льнянка обыкновенная используется также в качестве декоративного растения, медоноса и инсектицида, цветки льнянки окрашивают ткани в различные оттенки желтого цвета [107]. Обоснование исследования фармакологической активности у льнянки обыкновенной.
Применение льнянки обыкновенной в народной медицине в качестве диуретического средства дает основание для более детального изучения этого эффекта. Целесообразность этого объясняется широким применением растительных мочегонных препаратов и положительной динамикой роста рынка растительных средств диуретического действия [37].
Исследование фенольных соединений
Одним из наиболее распространенных и экономичных методов, позволяющим разделить и идентифицировать фенольные соединения является метод хроматографии на бумаге. Эффективность метода обусловлена хорошей растворимостью полифенолов и их способностью проявлять характерное окрашивание в УФ свете [135].
Проведенные исследования показали, что методом хроматографии на бумаге в траве л. обыкновенной выявлено семь веществ фенольной природы (рис. 1А, табл. 4). Четыре соединения флюоресцируют в УФ свете фиолетовым цветом разной интенсивности, а после окраски хромогенным реактивом алюминия хлоридом приобретают желтый цвет. На основании этого, вещества 1, 2, 3, 6 отнесены к флавоноидам (рис. 1Б). Три вещества (4, 5, 7) флюоресцируют в УФ свете бледно-голубым цветом или не обнаруживаются, а после обработки специфическим реактивом Гепфнера окрашиваются в коричневый цвет разной интенсивности, что позволяет отнести их к фенолкарбоновым кислотам (рис. 1В). С помощью аутентичных образцов (по значению Rf, окраске реактивами и методом добавки) в траве л. обыкновенной доказано присутствие линарина (вещество 1) и ацетилпектолинарина (вещество 3).
Доминирующими компонентами в траве л. обыкновенной по интенсивности окраски являются линарин, ацетилпектолинарин, вещества 2 и 5. Соединения 4, 6 и 7 являются минорными, так как проявляются только под влиянием аммиака или хромогенного реактива.
В настоящее время ТСХ является обязательным методом анализа при разработке нормативной документации на растительное сырье. Данный метод имеет ряд достоинств, заключающихся в простоте, экономичности, доступности оборудования, экспрессности, высокой производительности и эффективности разделения.
В таблице 5 приведены результаты хроматографического исследования травы л. обыкновенной методом ТСХ. В ходе хроматографического анализа установлено, что данным методом в растении обнаружено пять фенольных соединений (рис. 2).
Три соединения по окраске в УФ свете до и после обработки хромогенными реактивами отнесены к флавоноидам (вещества 2, 3, 4), два - к фенолкарбоновим кислотам (вещества 1, 5). С помощью аутентичных образцов (по значению Rf и методом добавки) в траве л. обыкновенной доказано присутствие линарина (вещество 3) и ацетилпектолинарина (вещество 4).
Анализируя интенсивность окраски изученных компонентов выявлено, что доминирующими веществами являются линарин, ацетилпектолинарин и соединение 2. Соединения 1 и 5 обнаружены в виде бледно-окрашенных пятен, что, вероятно, связано с их минорным количеством.
С целью идентификации доминирующих компонентов 3 и 4 нами изучены их спектральные характеристики и установлена температура плавления (табл. 6). Для этого пятна 3 и 4 элюировали с пластинок спиртом этиловым 60%, затем полученный раствор фильтровали для удаления сорбента, через бумажный фильтр. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе до сухого остатка, при этом анализируемые соединения получали в виде порошков белого (вещество 3) и желтоватого цвета (вещество 4).
При добавлении комплексообразующего (алюминия хлорида) агента, УФ спектр характеризуется батохромным сдвигом обоих максимумов. Длинноволновый максимум под действием реактива смещается на 14 нм, коротковолновый - на 26 нм. Появляется дополнительное плечо в области 280 нм. Установленная спектральная характеристика вещества 3 полностью совпадает со спектром стандартного вещества линарина (рис. 3-І). Температура плавления исследуемого компонента 3 составляет 260-262 С. Таким образом, на основании спектральных данных и температуры плавления вещество 3 идентифицировано как линарин (табл. 6).
Анализируя УФ спектр вещества 4 установлено, что он имеет два максимума поглощения при 276 и 331 нм (рис. 3-П). При добавлении комплексообразующего агента наблюдается сдвиг в длинноволновую область обоих максимумов. Длинноволновый максимум смещается на 13 нм, коротковолновый - на 24 нм. В области 280 нм наблюдается появление плеча. Спектральные характеристики вещества 4 совпадают с данными, полученными для стандартного образца ацетилпектолинарина. Температура плавления компонента 4 составляет 242-244 С, что сопоставимо со значениями стандартного образца. На основании данных УФ спектроскопии и температуры плавления вещество 4 идентифицировано как ацетилпектолинарин (табл. 6).
Сравнительный хроматографический анализ органов л. обыкновенной показал, что качественный состав фенольных соединений отличается незначительно, компонентный состав колеблется от четырех до шести веществ (табл. 7, рис. 4). Вещества 3, 4, 5, 6 по флюоресценции в УФ свете после обработки хромогенным реактивом отнесены к флавоноидам, соединения 1, 2, 7, 8 - к фенолкарбоновым кислотам. С помощью аутентичных образцов (по значению Rf и методом добавки) вещество 5 было идентифицировано как линарин, соединение 6 - как ацетилпектолинарин (табл. 7).
Анализ распределения фенольных соединений по органам растения показал, что линарин и ацетилпектолинарин, а так же вещества 1 и 4 содержатся во всех органах л. обыкновенной. Наиболее разнообразный состав (6 веществ) представлен в корнях растения, при этом только они накапливают компоненты 2 и 8. Состав фенольных соединений генеративных органов л. обыкновенной представлен пятью веществами и отличается наличием вещества 7, которое отсутствует в других органах растения. Компонентный состав листьев и стеблей схож между собой. В листьях содержится четыре вещества фенольной природы. Стебли отличаются от них наличием соединения 3.
Анализ хроматографической характеристики и интенсивности окраски компонентов показал, что ацетилпектолинарин и вещество 4 являются доминирующими соединениями. Вещества 3 и 5 содержатся в небольшом количестве, т.к. обнаруживаются только после обработки хромогенными реактивами. Соединения 1, 2, 7, 8 проявляются только в УФ свете и являются минорными.
Для подтверждения данных полученных при использовании планарной хроматографии компонентный состав льнянки обыкновенной был изучен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В настоящее время данный метод широко применяется для установления качественного состава и количественного содержания фенольных соединений [9, 12,40,52,78,91, 149].
Образцы для анализа были получены по методике, описанной в главе 2.
В результате эксперимента было обнаружено 7 вещества флавоноидной природы (табл. 8, рис. 5, приложение 2).
Вещество 7, в сравнении со стандартным образцом, по времени удерживания, УФ-спектру и спектральным отношениям идентифицировано как ацетилпектолинарин.
Морфологическая характеристика льнянки обыкновенной
L. vulgaris - многолетнее травянистое растение, достигает в высоту от 20 до 80 см (рис. 14). Стебли цилиндрические, прямостоячие, голые, зеленого цвета. Стебли от основания не ветвятся, образуют боковые побеги в количестве 2-16 штук. Длина боковых побегов, в среднем, составляет около 5 см, но отдельные представители могут достигать 20 см в длину (табл. 42).Число междоузлий на стебле составляет от 20 до 80 штук. Стеблевые листья расположены очередно, сидячие. Форма листовой пластинки линейно-ланцетная, ее длина от 3 до 6 см, ширина - от 0,2 до 0,3 см. Край листовой пластинки цельный, завернутый (рис. 15-П). Общее число листьев на растении составляет от 60 до 150 штук.
Корневая система стержневого типа. Главный корень светло-коричневый. От него отходят многочисленные боковые корни с вегетативными почками, из которых формируются придаточные побеги.
Соцветие кисть, длиной от 4 до 9 см. Прицветные листья ланцетной формы, превышающие по длине цветоножки или равные им (рис. 15-Ш). Чашечка короткоколокольчатая длиной от 0,2 до 0,4 см, пятинадрезанная с ланцетными, тонкозаостренными долями.
Венчик двугубый со шпорцем и закрытым зевом, бледно-желтый. Длина венчика вместе со шпорцем составляет около 2,3 см. Верхняя губа образована 2 лепестками, в различной степени двунадрезанная. Нижняя губа состоит из 3 лепестков, имеет оранжевое пятно на выпуклой средней части нижней губы (рис. 15-1). Шпора L. vulgaris цилиндрическая или коническая, длина её, примерно, равна длине венчика. Тычинок 4, из них 2 более длинные. Пестик с двугнездной завязью, длинным столбиком и небольшим рыльцем.
Плод - продолговатая коробочка, без опушения, длиной около 1,0 см, в 2-3,5 раза длиннее чашечки (рис. 15-IV). Семена дисковидные, с широким перепончатым краем, черные, мелкобугорчатые в середине.
Анализ морфологического строения показал, что вариабельность признаков внутри фитоценоза небольшая. Большинство признаков, за исключением длины бокового побега, характеризуются постоянством параметров, вариабельность не превышает 10%.
Используя полученные сведения о морфологическом строении л. обыкновенной, проведен сравнительный анализ признаков с данными, имеющимися в литературе с целью установления диагностических показателей сырья (табл. 43) [129, 130].
Как следует из результатов анализа, морфолого-диагностические признаки л. обыкновенной, произрастающей в Пермском крае, совпадают по большинству параметров с литературными данными. Приведенные дополнительные количественные параметры структурных элементов морфологического строения позволят более быстро и точно проводить диагностику сырья л. обыкновенной. Традиционными признаками являются: форма и край листовой пластинки, форма чашелистиков, форма и окраска венчика, тип и форма плода.
Низкая вариабельность признаков указывает на то, что они устойчивы и не зависят от места произрастания л. обыкновенной.
Различие в описании морфологического строения установлено по одному признаку - типу соцветия. Во флоре СССР указано колосовидное соцветие, т.е. цветки не имеют цветоножек и являются сидячими. В ходе проведенных нами исследований установлено, что цветки располагаются на цветоножках небольшого размера вдоль тонкой главной оси, что характеризует данное соцветие как кисть. Полученные сведения совпадают с морфологическим описанием, приведенным во Флоре Европейкой части СССР. Вероятно, этот признак имеет экологозависимый характер.
На основании проведенных исследований были определены диагностические признаки для надземной части л. обыкновенной, которые можно использовать для определения подлинности сырья и составления инструкции по заготовке сырья. К ним относятся форма листовой пластинки и ее край, форма долей чашечки, форма и окраска венчика. Листовая пластинка должна быть линейно-ланцетной формы с цельным, слегка завернутым краем. Чашелистики чашечки ланцетные, тонко-заостренные. Венчик двугубый со шпорцем, бледно-желтый с оранжевым пятном на выпуклой средней части нижней губы.
Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной
Современные тенденции диктуют необходимость проведения валидации аналитических методик [2, 111, 122]. Метод количественного определения суммы флавоноидов в траве л. обыкновенной в пересчете на ацетилпектолинарин относится к категории I и валидируется по параметрам правильности, линейности и прецизионности, показателями которой являются повторяемость (сходимость) и воспроизводимость.
Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций от теоретического содержания суммы флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин в сырье (табл. 52). Растворы готовили путем разбавления аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин в растворах, имеющих концентрацию 50, 75, 100, 125, 150%. Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Его величина должна быть не ниже 0,9999.
Проверка повторяемости (сходимости) результатов методики, проведенная на одном образце в 6 повторностях показала, что степень согласованности результатов измерений, характеризующаяся величиной относительного стандартного отклонения (RSD) = 1,42%, не превышает допустимые 2,0%) (табл. 53).
Воспроизводимость методики определяли на 3 образцах сырья в 3-х кратной повторности двумя аналитиками и в двух лабораториях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 3,0% между результатами двух аналитиков и результатами определения в двух лабораториях.
Относительное стандартное отклонение составило 2,94%, что указывает на прецизионность методики в условиях внутрилабораторной воспроизводимости (табл. 54).
Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин в растворах, полученных путем добавления необходимого количества стандарта к исследуемому раствору для концентраций 115, 140, 175, 210% (табл. 56). Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скоректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5%.
В разработанной методике процент восстановления находился в пределах от 95,80 до 103,26%), его средняя величина составила 98,89%).
Таким образом, методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин легко воспроизводима, доступна, занимает минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов. Она позволяет объективно оценивать качество травы л. обыкновенной и может быть предложена для стандартизации этого сырья в Государственную Фармакопею XII издания.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что большинство морфологических признаков L.vulgaris характеризуется постоянством параметров. Вариабельность вида незначительна.
Морфолого-диагностическими признаками травы л. обыкновенной являются форма и край листовой пластинки, форма долей чашечки, форма и окраска венчика.
Анатомо-диагностическими признаками травы л. обыкновенной для цельного и резаного сырья являются характеристика трихом листа и главной оси соцветия, гипостоматический тип листа, характер расположения околоустьичных клеток на эпидерме листа, проводящая система стебля л. обыкновенной.
Установлены оптимальные числовые показатели, регламентирующие доброкачественность сырья, которые включены в проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».
Предложены методики качественного определения БАВ в сырье.
Сформирован проект ФС «Ацетилпектолинарин - государственный стандартный образец». Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье л. обыкновенной методом прямой спектрофотометрии в пересчете на ацетилпектолинарин и проведена ее валидация. Ошибка единичного определения составляет 3,56% при доверительной вероятности 95%. Рекомендуемое содержание флавоноидов в сырье не менее 8%.
