Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Ботаническая характеристика растений рода лаконос 14
1.1.1. Описание внешнего вида сырья и растений лаконоса американского и ягодного 14
1.1.2. Анатомическое строение корней лаконоса американского и лаконоса ягодного 19
1.2. Химический состав лаконоса американского и лаконоса ягодного 22
1.2.1. Химический состав корней лаконоса американского и ягодного 22
1.2.2. Химический состав плодов и семян лаконоса американского и лаконоса ягодного 30
1.2.3. Химический состав листьев лаконоса американского и лаконоса ягодного 35
1.2.4. Фармакологические исследования полисахаридов надземной части лаконоса американского 36
1.3. Современные аспекты стандартизации сырья и гомеопатической матричной настойки лаконоса американского. 38
1.4. Применение лаконоса американского и лаконоса ягодного 45
1.4.1. Применение лаконоса в России 45
1.4.2. Применение лаконоса за рубежом 50
Выводы главы 1 52
Глава 2. Объекты и методы исследования 54
2.1. Объекты исследования 54
2.2 Методы исследования 54
Выводы главы 2 57
Глава 3. Разработка характеристик подлинности корней и травы лаконоса американского и лаконоса ягодного 58
3.1. Внешние признаки корней и травы лаконоса 58
3.1.1. Изучение внешних признаков корней лаконоса американского и ягодного 58
3.1.2. Анализ внешних признаков травы лаконоса американского и лаконоса ягодного 62
3.2. Микроскопическое исследование корней и травы (стеблей, черешков и листьев) лаконоса американского и лаконоса ягодного 67
3.2.1. Микроскопическое исследование корней лаконоса американского 67
3.2.2. Микроскопическое исследование корней лаконоса ягодного 70
3.2.3. Микроскопическое исследование листьев лаконоса американского 76
3.2.4.Микроскопическое исследование листьев лаконоса ягодного 77
3.2.5. Микроскопическое исследование черешков лаконоса американского и лаконоса ягодного 80
3.2.6. Микроскопическое исследование стеблей лаконоса американского и лаконоса ягодного 87
Выводы главы 3 94
Глава 4. Изучение качественного состава биологически активных веществ корней лаконоса американского и лаконоса ягодного 95
4.1. Изучение состава БАВ высушенных корней лаконоса с помощью качественных реакций 95
4.2. Сравнительное изучение качественного состава БАВ высушенных корней лаконоса двух видов методом ТСХ
4.2.1. Сравнительное изучение качественного состава тритерпеновых соединений высушенных корней лаконоса американского и лаконоса ягодного 97
4.2.2. Сравнительное изучение качественного состава фенолкарбоновых кислот корней лаконоса американского и лаконоса ягодного 98
4.2.3. Сравнительное изучение качественного состава органических кислот в высушенных корнях лаконоса американского и лаконоса ягодного 99
4.3. Качественный анализ сапонинов методом ВЭЖХ 100
4.4. Идентификация свободных сахаров в высушенных корнях лаконоса... 102 ВЫВОДЫ ГЛАВЫ 4 104
ГЛАВА 5. Количественное определение биологически активных веществ в корнях исследуемых видов лаконоса 105
5.1. Определение влажности свежих и высушенных корней лаконоса американского и лаконоса ягодного 105
5.2. Определение содержания экстрактивных веществ в высушенных корнях лаконоса американского и лаконоса ягодного 105
5.3. Разработка методики количественного определения сапонинов в высушенных корнях лаконоса в пересчете на олеаноловую кислоту 107
5.3.1. Изучение оптимальных условий проведения методики количественного определения тритерпеновых сапонинов в высушенных корнях лаконоса американского и лаконоса ягодного... 108
5.4. Количественное определение фенолкарбоновых кислот в высушенных корнях лаконоса американского и лаконоса ягодного... 118
5.5. Количественное определение органических кислот в высушенных корнях лаконоса 120
5.6. Количественное определение полисахаридов в высушенных корнях лаконоса 121
Выводы главы 5 122
ГЛАВА 6. Получение и исследование матричных настоек из свежих корней лаконоса двух видов, проведение их качественного и количественного анализа 124
6.1. Изучение состава матричных настоек с помощью качественных реакций 125
6.2. Изучение состава матричных настоек методом ТСХ и ВЭЖХ 1 6.2.1. Определение тритерпеновых сапонинов в матричных настойках лаконоса американского и ягодного методом ТСХ.. 126
6.2.2. Определение фенолкарбоновых кислот в матричных настойках лаконоса американского и ягодного методом ТСХ 127
6.2.3. Определение органических кислот в матричных настойках лаконоса американского и ягодного методом ТСХ 128
6.2.4. Качественное определение сапонинов в матричных настойках методом ВЭЖХ 130
6.2.5. Идентификация свободных сахаров в матричных настойках лаконоса американского и ягодного 1 6.3. Количественное определение сапонинов в матричных настойках из свежих корней исследуемых видов лаконоса методом СФМ 133
6.4. Получение и исследование десятичных разведений матричных настоек лаконоса американского и ягодного 135
Выводы главы 6 136
Общие выводы 138
Список литературы .
- Химический состав лаконоса американского и лаконоса ягодного
- Методы исследования
- Микроскопическое исследование корней и травы (стеблей, черешков и листьев) лаконоса американского и лаконоса ягодного
- Сравнительное изучение качественного состава тритерпеновых соединений высушенных корней лаконоса американского и лаконоса ягодного
Введение к работе
Актуальность темы
Гомеопатические лекарственные средства в Российской Федерации разрешены к медицинскому применению. Сырьем для изготовления гомеопатических лекарственных средств служат субстанции растительного, минерального и животного происхождения. На долю растительных гомеопатических средств приходится около 60% от общего числа гомеопатических препаратов.
Растения рода лаконос (Phytolacca) широко применяются в гомеопатии в России и за рубежом. На территории России наиболее распространенными видами считаются лаконос американский (Phytolacca americana L.) и лаконос ягодный (Phytolacca acinosa Roxb.). Лаконос американский произрастает преимущественно в южных районах нашей страны и на Кавказе, тогда как лаконос ягодный более адаптирован к климату средней полосы России.
Богатая история применения лаконоса связана с его химическим составом. Лаконос содержит такие биологически активные вещества (БАВ), как тритерпеновые и стероидные сапонины, флавоноиды, алкалоиды, беталаиновые соединения, противовирусные белки, полисахариды.
Из свежих корней лаконоса американского получают матричную
настойку, которая входит в состав ряда гомеопатических препаратов, таких, как
Тонзипрет, Тонзилар, Ангин-Хель, Фитолакка-плюс и другие.
Фармакопейные статьи на матричную настойку лаконоса американского включены в гомеопатические фармакопеи Германии, Индии, Франции. Высушенные корни обоих видов лаконоса (американского и ягодного) были включены в фармакопею Китая и применяются в аллопатии в виде порошка при карбункулах, а также как слабительное и мочегонное средства.
Ввиду близкого химического состава обоих видов лаконоса,
особенностей климатических предпочтений и распространения лаконоса на территории нашей страны, исследования различных сырьевых источников лаконоса в сравнительном аспекте является актуальной задачей.
Анализ нормативной документации показал, что статьи на сырье лаконоса американского, а также сырье и матричную настойку лаконоса ягодного в России отсутствуют. Отечественная статья на матричную настойку лаконоса американского требует доработки в соответствии с современными требованиями к стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов.
Степень разработанности темы исследования
В отечественной литературе наиболее изученным видом является лаконос
американский. В работах приведено изучение химического состава
преимущественно надземных органов лаконоса американского,
произрастающего на Кавказе (Яковлева С.Г., 2000). Среди БАВ лаконоса наиболее изученными группами являются флавоноиды, беталаиновые
соединения (Дзадзиева М.С., 2011) и полисахариды. Для последних имеются данные фармакологических исследований на предмет их фармакосанирующей активности (Муравьева Т. И., 1999). В отдельных научных работах представлены исследования состава БАВ корней лаконоса американского. Для количественного анализа сапонинов лаконоса американского был предложен метод гравиметрии (Муравьева Т. И., 1999). Также приведены данные по разработке методов стандартизации гомеопатической матричной настойки лаконоса американского (Терешина Н.С., 2006).
Целью исследования является сравнительное изучение и стандартизация сырья и матричных настоек из корней лаконоса американского и лаконоса ягодного.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Провести анализ научной литературы и нормативной документации на изучаемые виды лаконоса и препараты из сырья лаконоса;
-
Провести сравнительное изучение внешних признаков свежих и высушенных корней и травы лаконоса американского и лаконоса ягодного;
-
Провести сравнительное микроскопическое исследование корней, стеблей, черешков и листьев лаконоса американского и лаконоса ягодного и выявить их отличительные особенности;
-
Установить состав БАВ корней лаконоса исследуемых видов с помощью качественных реакций, тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
-
Определить содержание экстрактивных веществ в высушенных корнях лаконоса с использованием различных экстрагентов;
-
Разработать методику количественного определения сапонинов в корнях лаконоса исследуемых видов;
-
Определить количественное содержание основных классов БАВ (сапонинов, полисахаридов, фенолкарбоновых кислот, органических кислот) в корнях лаконоса;
-
Получить матричные настойки из свежих корней лаконоса американского и лаконоса ягодного и их основные разведения. Установить качественный состав матричных настоек и состав основных разведений;
-
Определить количественное содержание сапонинов в матричных настойках.
Решение задач осуществлялось путем обобщения литературных данных и проведения соответствующих экспериментальных исследований.
Научная новизна результатов исследования
Получены научно-обоснованные данные при экспериментальном изучении состава БАВ корней и матричных настоек из свежих корней лаконоса американского и лаконоса ягодного: сапонинов, полисахаридов, органических кислот, фенолкарбоновых кислот. Дана их количественная характеристика с
использованием современных физико-химических методов (ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрия). Определено содержание экстрактивных веществ в извлечениях из корней лаконоса, полученных с использованием различных экстрагентов. Проведено микроскопическое исследование корней, стеблей, черешков и листьев лаконоса обоих видов, а также измельченного сырья корней лаконоса, определены биометрические характеристики размеров выростов по краю листа, крахмальных зерен в корнях, размеров и количества клеток с кристаллами оксалата кальция в корнях и листьях лаконоса американского и ягодного. Получены десятичные разведения приготовленных матричных настоек из свежих корней обоих видов лаконоса и установлено содержание в них сапонинов и фенолкарбоновых кислот.
Теоретическая значимость работы
Использование современных методов анализа позволило получить новые данные о качественном и количественном составе БАВ лаконоса американского и лаконоса ягодного, а также матричных настойках из свежих корней этих видов. Материал, представленный в работе, может служить основой для разработки показателей качества данных видов сырья и матричных настоек, установления их норм, а также для разработки характеристик подлинности и инструкций по заготовке сырья.
Практическая значимость результатов исследования
Разработанные методики количественного определения сапонинов, а также комплекс испытаний для подтверждения подлинности сырья (внешние признаки, микроскопия, качественные реакции, хроматографические пробы) лаконоса американского и лаконоса ягодного представляют практический интерес для идентификации и оценки качества сырья лаконоса. Разработаны проекты фармакопейных статей «Настойка гомеопатическая матричная Phytolacca americana» и «Настойка гомеопатическая матричная Phytolacca acinosa». Данные о качественном и количественном составе БАВ лаконоса и матричных настоек, характеристики внешних признаков и микроскопии внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России. Результаты внедрения подтверждены актом внедрения.
Методология и методы исследований
Методология исследования построена на анализе литературных данных, оценке степени разработанности и актуальности темы исследования, постановке целей и задач исследования по сравнительному изучению лекарственного растительного сырья (ЛРС) и матричных настоек лаконоса. В процессе выполнения эксперимента использовались следующие методы: ТСХ, УФ-спектрофотометрия, титриметрия, гравиметрия, ВЭЖХ. Статистическая обработка полученных результатов проводилась в соответствии с общей фармакопейной статьей ГФ XII, в. 2, ОФС 42-0111-09.
Степень достоверности результатов
Все полученные результаты и выводы, сделанные из них, основаны на достаточном количестве экспериментальных исследований. В работе
использовалось сертифицированное оборудование, на которое выданы действующие свидетельства о поверке. Разработанные методики валидированы. В исследовании использован достаточный объем литературных источников отечественных и иностранных авторов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Минобрнауки России.
Апробация диссертации
Результаты исследований доложены на XXIII Московской
международной гомеопатической конференции: «Развитие гомеопатического
метода в современной медицине» 25 – 26 января 2013 г., научно-практической
конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и
сырья природного происхождения в медицине» 28 февраля 2013 г., XXIV
Московской международной гомеопатической конференции "Развитие
гомеопатического метода в современной медицине" 24 – 25 января 2014 г., научно-методической конференции "II Гаммермановские чтения" 3 – 6 февраля 2014 г., II Научно-практической конференции "Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине" 27 февраля 2014 г., международной научно-практической конференции: «Перспективы внедрения инновационных технологий в фармации» 24 – 25 ноября 2014 г. на базе ГОУ ВО Московской области «Московский государственный областной гуманитарный институт», XXV Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» 23 – 24 января 2015 г., III Научно-практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине" 19 февраля 2015 г.
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке целей и задач, экспериментальной работе, статистической обработке результатов и анализе полученных данных. Вклад автора является определяющим на всех этапах проводимого исследования. В работах, выполненных в соавторстве, автор принимал непосредственное участие в экспериментальной и аналитической работе, в научном обосновании и обобщении полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – «Фармацевтическая химия, фармакогнозия», а именно пунктам 2, 3, 6 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтической науки
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательской работы кафедры фармакогнозии фармацевтического
факультета ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006.06352).
Основные положения, выносимые на защиту:
результаты сравнительного изучения внешних признаков свежих и высушенных корней, травы лаконоса американского и лаконоса ягодного;
результаты микроскопического исследования цельных и измельченных корней, листьев, черешков и стеблей лаконоса американского и лаконоса ягодного;
результаты изучения качественного состава и количественного содержания биологически активных веществ (сапонинов, полисахаридов, органических кислот, свободных сахаров, фенолкарбоновых кислот) корней лаконоса американского и лаконоса ягодного;
данные по стандартизации матричных настоек из свежих корней лаконоса американского и лаконоса ягодного.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 157 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 4 экспериментальных глав, выводов, библиографического указателя, включающего 140 источников, из которых 82 на иностранных языках и приложения. Работа иллюстрирована 64 рисунками и 27 таблицами.
Химический состав лаконоса американского и лаконоса ягодного
Описание внешних признаков травы лаконоса американского приведено в Гомеопатической фармакопее Индии 1990 г. По данным фармакопеи это мясистая сочная трава, 1 – 4 м в высоту, листья удлиненные, вытянутые или овально 15 ланцетные, 10 – 30 см в длину, острые или заостренные. Цветки маленькие, около 2,5 см в длину. Цветоносы соцветия 5 – 20 см в длину, сгибаются под тяжестью плодов. Тычинок много, расположены в 2 ряда, завязь шаровидная, плоды – сочные ягоды темно-фиолетового цвета, около 12 мм в диаметре.
Литературные источники описывают лаконос как многолетнее травянистое растение. Корень лаконоса американского толстый, располагается вертикально, снаружи покрыт коричневатой пробкой, а внутри белый волокнистый. Корневище короткое и многоглавое (рис.1.1.1). От корня поднимается несколько стеблей, полых, гладких, ветвистых, красновато-зеленых, 2,5 – 5см в диаметре, достигающих в высоту до 2,5 м. Верхняя структура стебля характерна для семейств маревые (Chenopodiaceae) и амарантовые (Amarantaceae) [22, 23, 29, 59].
Лаконос американский (Phytolacca americana L.): 1 – внешний вид: A – цветущий побег, B – цветок (x2), C – цветок продольный разрез, D – диаграмма, E – плод, F – семя целиком и его продольный разрез (х3); 2 – строение надземной части растения в фазе цветения; 3 – строение надземной части растения в фазе плодоношения Листорасположение у лаконоса американского очередное. Листья простые, цельнокрайние, тонкие, овально-ланцетной формы, без опушения и прилистников, черешок короткий. С начала вегетации цвет листьев светло-зелный, позднее они краснеют [22, 23, 59].
Цветки мелкие правильные, обоеполые, с простым пятимерным околоцветником, находятся в верхней части стебля и собраны в поникающие кисти длиной до 15 см. Листочки околоцветника сначала беловатые, позднее краснеют. Андроцей состоит из 10 тычинок, расположенных супротивно и разделяющих околоплодник на части. Тонкие тычиночные нити начинаются в основании и поднимаются вверх, переходя в пыльники с 2 ячейками. Гинецей состоит из 10 пестиков, чередующихся с тычинками, которые смыкаются на основании, а вверху свободны. Стенки зрелой завязи мясистые. Плод – сочная, округлая ягода, в незрелом состоянии зеленая, с бороздками (до 10 штук), при созревании окрашивается в черно-фиолетовый цвет, в диаметре около 8 мм. Семена черные, почковидные, длиной 2,5 – 3,0 мм, шириной 2,0 – 2,5 мм, содержат крахмалистый эндосперм, который огибает эмбрион [22, 23, 29].
Лаконос американский произрастает в 48 американских штатах и Канаде. На Северном Кавказе, в Крыму, на Черноморском побережье семейство лаконосовых представлено одним видом, лаконосом американским, который является рудеральным [20, 21].
Как правило, лаконос американский обитает на сорных местах вдоль обочин дорог, на насыпях, в садах и огородах, на виноградниках [50]. Лаконос ягодный
Лаконос ягодный (рис. 1.1.2) в литературных источниках был охарактеризован как растение с многоглавым корневищем и вертикальным стержневым толстым корнем; стеблей, как и у лаконоса американского, несколько, они зеленые, прямые, мясистые и ветвистые. Листья очередные, простые, овальные, яйцевидные, цельнокрайние, тонкие, с черешком размером 1,5 – 3 см, светло-зелные, голые, длиной до 30 см и до 15 см шириной. Цветки актиноморфные, около 8 мм в диаметре, мелкие, собраны в плотные прямостоячие кисти. Гинецей состоит из 8 пестиков, андроцей из 8 – 10 тычинок с розовыми пыльниками. Плод представляет собой сложную ягоду и состоит из сборных костянок, легко отделяющихся от цветоложа, в незрелом состоянии зеленый, 8-ребристый. При созревании плод становится сочным, черно-фиолетового цвета, с выраженными ребрами; размер плодов 0,8 – 1,3 см в диаметре; сок черновато-пурпурного цвета. Семена черные, матовые, почковидной формы, размером около 3 мм [22, 23, 87].
Таким образом, основными отличиями лаконоса американского от лаконоса ягодного по изученным литературным данным являются форма кистей на стадии зрелости плодов (поникающие кисти, в отличие от прямостоячих у Ph. acinosa), форма зрелых плодов (округлые, а не лопастные, как у лаконоса ягодного), а также форма листовой пластинки [26]. Phytolacca acinosa Roxb. это относительно теплолюбивый азиатский вид, который произрастает от Гималаев до Японии. Кроме того, лаконос ягодный культивируется в ботанических садах, выращивается в качестве декоративного растения. В природе он встречается в сорных местах [25, 48].
Ежегодно у лаконоса американского и лаконоса ягодного отмирает стебель. Весной из почек возобновления, расположенных на корневище и у основания прошлогодних стеблей, отрастают новые побеги. Размножается лаконос весенним делением корневища, а также семенами, которые распространяются птицами. Последовательное созревание плодов в соцветиях приводит к увеличению периода доступности плодов для птиц, что приводит к возможности распространения семян лаконоса с сентября по декабрь [23, 90].
Лаконос дат обильный самосев. Неочищенные от мякоти семена при посеве неглубоко заделывают в почву. Лаконос не требователен к почвам, хорошо растет как на лгких, так и на среднетяжлых грунтах. По отношению к свету лаконос американский является светолюбивым растением, а лаконос ягодный теневыносливым [23, 72].
Описание внешних признаков корней в виде сырья лаконоса американского приведено в Гомеопатической фармакопее Индии и Фармакопее Китая. Строение корней лаконоса ягодного – только в Фармакопее Китая (табл.1.1.1).
Методы исследования
Объектами исследования являлись: свежие и высушенные корни и трава лаконоса американского, собранные в Краснодарском крае, Лазаревском районе; свежие и высушенные корни и трава лаконоса ягодного, собранные в Ботаническом саду Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Объекты заготавливались в вегетационный период в течение 2011– 2013 гг.
Были разработаны примы заготовки корней лаконоса: корни выкапывали, тщательно очищали от земли и быстро промывали холодной водой. Затем отделяли короткое корневище и мелкие корни, оставшиеся корни разрезали кусками до 2 см в длину, и 2 см в диаметре и высушивали. Сушку образцов осуществляли в естественных условиях (воздушно-теневая сушка). Высушенное сырье хранилось в бумажных пакетах в чистом, сухом, хорошо вентилируемом помещении в соответствии с требованиями ГФ XI, в. 1, ОФС «Хранение лекарственного растительного сырья».
Характеристику внешних признаков корней лаконоса проводили в соответствии с ОФС «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы» ГФ ХI, в. 1, с. 263; характеристику внешних признаков травы проводили в соответствии с ОФС «Травы» ГФ ХI, в. 1, с. 256. Для микроскопических исследований использовались методики приготовления микропрепаратов, указанные с общей статье ГФ XI, в. 1, с. 277 «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» [17].
Из высушенных корней были приготовлены поперечные срезы, из измельченного сырья и порошка – давленый препарат, из листьев – препарат листа с поверхности. Корни фиксировали в смеси этиловый спирт-глицерин (1:1), листья предварительно кипятили в 2,5% щелочи 2 минуты [17]. Микроскопическое исследование проводилось с помощью микроскопа БИОЛАМ-С II с объективами х10, х40, х100. Измерения проводились с помощью окуляр-микрометра. Фотосъемка была проведена на цифровую фотокамеру FinePix F 470 и Nikon Сoolpix L19. Определение влажности сырья проводили по методике, описанной в ГФ XI, в. 1, с. 285, ОФС «Определение влажности лекарственного растительного сырья». Плотность матричных настоек определяли по методике ГФ XI изд., в.1, с.24 (метод 1), сухой остаток определяли по методике, изложенной в ОФС «Настойки», ГФ XI изд., в. 2, с.148. Исследования качественного состава алкалоидов, фенольных и тритерпеновых соединений, органических кислот проводились методом ТСХ. Сорбенты, подвижные фазы и детекторы указаны в пятой главе работы. Метод титриметрии применялся для количественного определения суммы органических кислот и проводился по методике, описанной в ГФ XI, в. 2, с. 294, в ст. № 38 «Плоды шиповника» [18]. Спектрофотометрический метод использовался для определения суммы тритерпеновых сапонинов в изучаемых объектах исследования [28]. Исследование проводили на спектрофотометре Cary-4000 (Agilent, США). Метод ВЭЖХ использовали при анализе таких групп БАВ, как тритерпеновые сапонины, фенолкарбоновые кислоты, свободные сахара [88]. Исследования сапонинов и фенолкарбоновых кислот проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) с времяпролетным масс селективным детектором Agilent 6200 TOF LC/MS с ионизацией электрораспылением, с автосемплером. Программное обеспечение обработки хроматографических данных – ChemStation.
Идентификация свободных сахаров осуществлялась прямофазовой ВЭЖХ на колонке Luna NH2 4.6250mm (5um) с подвижной фазой ацетонитрил/вода 70:30 при скорости потока 1 мл/мин, комнатной температуре и с рефрактометрическим детектированием. Метод гравиметрии использовался для количественного определения полисахаридов и экстрактивных веществ в корнях лаконоса. Для определения полисахаридов использовалась методика, приведенная в ГФ XI в. 2, с. 264, в ст. № 20 «Листья подорожника большого», для определения экстрактивных веществ – ГФ XI, в. 1, с. 295, в ОФС «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье» [17, 18].
В качестве стандартных образцов (СО) использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества: олеаноловая кислота («Deltaorigin»), хлорогеновая кислота («Sigma-Aldrich»), кофейная кислота («Sigma-Aldrich»), феруловая кислота («Sigma-Aldrich»), яблочная кислота (РеаХим), лимонная кислота (РеаХим), винная кислота (РеаХим), щавелевая кислота (РеаХим), аскорбиновая кислота (РеаХим). Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии в соответствии с общей фармакопейной статьей ГФ XII, вып. 2, ОФС 42-0111-09 [16].
Микроскопическое исследование корней и травы (стеблей, черешков и листьев) лаконоса американского и лаконоса ягодного
Для разработки характеристики подлинности необходимо было провести сравнительное изучение внешних признаков корней лаконоса американского и лаконоса ягодного и выявить их основные отличия.
Характеристику внешних признаков сырья лаконоса проводили в соответствии с ОФС «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы» ГФ ХI.
Корни лаконоса американского у растения представляли собой стержневые корни с умеренным содержанием придаточных корней, длиной до 50 см, шириной до 8 см. Корень мясистый, ветвистый, с коротким многоглавым корневищем, на котором видны почки возобновления.
Корни лаконоса ягодного представляли собой корни правильной конической формы, длиной до 50 см, шириной до 10 см. В верхней части, у корневой шейки заметны почки возобновления в виде округлых шишек зеленовато-розового цвета, размером от 0,5 до 1 см (рис. 3.1.1.1). Корни лаконоса обоих видов (не менее 10 образцов от одного и от другого вида) выкапывали из земли, освобождали от надземных частей и мелких корней, тщательно очищали от земли и быстро промывали в холодной воде, затем отделяли от короткого корневища и разрезали на куски. Анализ свежего сырья лаконоса
Свежее сырье представляет собой куски корней различной формы длиной до 2 см, диаметром до 2 см. С наружной поверхности у лаконоса американского и лаконоса ягодного имеются рубцы в виде кольчатых утолщений, круглые поперечные бугорки от придаточных корней. Цвет корня у лаконоса американского снаружи коричневатый, цвет утолщений был более светлый, чем сам корень. У лаконоса ягодного цвет наружной поверхности желтовато-коричневый, а при соскабливании наружных слов пробки розовый. На изломе корни лаконоса американского волокнистые, желтовато-белые, со светлыми концентрическими поясами. Концентрические пояса также наблюдаются и у ягодного лаконоса. Однако цвет излома у него желтовато-розовый. Запах у лаконоса американского слабый, у лаконоса ягодного слабый крахмалистый. Вкус сырья не определяется, так как, по данным литературы, растение содержит токсичные соединения (табл.3.1.1.1).
Внешние признаки свежих корней лаконоса американского и лаконоса ягодного Признак Корни лаконоса американского Корни лаконоса ягодного Форма, размеры Куски корней различной формы длиной до 2 см, диаметром до 2 см Характер наружной поверхности Гладкая, с рубцами в виде поперечных кольчатых утолщений и поперечными бугорками от придаточныхкорней Характер излома Волокнистый Зернистый Цвет наружной поверхности Снаружи коричневый, цветутолщений более светлый,чем сам корень Розовато-коричневый, присоскабливании наружныхслов пробки – розовый Цвет излома Желтовато-белый, видныжелтые концентрическиепояса Желтовато-розовый, сзаметнымиконцентрическими поясами Запах Специфический
Таким образом, у свежего сырья выявлены различия в цвете наружной поверхности (коричневый у лаконоса американского и розовато-коричневый у лаконоса ягодного), цвете излома (желтовато-белый у лаконоса американского и желтовато-розовый у ягодного) и в характере излома (волокнистый у лаконоса американского и зернистый у лаконоса ягодного). Особенностями свежих корней обоих видов лаконоса также являются наличие рубцов в виде поперечных кольчатых утолщений с бугорками от придаточных корней на наружной поверхности, наличие концентрических колец на изломе.
Высушенные корни лаконоса американского представляют собой куски корней или их части, разрезанные поперк или продольно, различающиеся по толщине. Поверхность и края корней морщинистые, неровные. Цвет наружной поверхности светло-коричневый, излом желтовато-белый. Концентрические кольца, образованные дополнительным камбием, отчетливо выражены, более выпуклые по сравнению со свежими корнями. Запах слабый, вкус не определяется (рис. 3.1.1.2). Рис. 3.1.1.2. Внешний вид цельных высушенных корней лаконоса американского (слева) и лаконоса ягодного (справа) Высушенные корни лаконоса ягодного представляют собой куски корней или их части, разрезанные поперк или продольно, различающиеся по толщине. Поверхность и края корней морщинистые. Цвет наружной поверхности коры розовато-коричневый. Излом розовато-белый. Концентрические кольца, образованные дополнительным камбием, отчетливо выражены, более выпуклые по сравнению с кольцами свежих корней этого вида. Запах слабый, вкус не определяется (рис. 3.1.1.2, табл. 3.1.1.2).
У высушенного сырья двух видов лаконоса различия заключались в цвете наружной поверхности (коричневый у американского и светло-коричневый у ягодного) и излома (желтовато-белый у американского и розовато-белый у ягодного). Для обоих видов корней лаконоса характерно наличие ярко выраженных концентрических колец, морщинистый характер поверхности корней.
В ходе работы были описаны внешние признаки свежей травы лаконоса американского и лаконоса ягодного и выявлены их основные отличия. Для исследования заготавливалась верхушечная надземная часть растений длиной до 40 см.
Стебли лаконоса обоих видов представляют собой округлые стебли с несколькими небольшими ребрышками, более выраженными у лаконоса ягодного. Листорасположение очередное. Цвет стеблей красновато-зеленый у лаконоса американского и светло-зеленый у лаконоса ягодного. Исследование листьев проводилось визуально. Исследование цветков проводилось с помощью бинокулярной лупы (рис. 3.1.2.1).
Внешний вид травы лаконоса американского (слева) и лаконоса ягодного (справа) Листья лаконоса американского яйцевидной или яйцевидно-ланцетной формы, цельнокрайние, к основанию суживающиеся в угловатый черешок, около черешка ассиметричные, длиной до 15 см, шириной до 6 см, длина черешка до 3,5 см. Цвет листьев сверху зеленый или буровато-зеленый, снизу более светлый, с сиреневыми пятнами, черешок желто-зеленый (рис. 3.1.2.2).
Цветки лаконоса американского собраны в плотные кисти до 5 см в длину. Цветоножки размером 0,4 – 0,7 см; цветки с простым околоцветником, мелкие (2 – 3 мм в диаметре). Листочков околоцветника пять, яйцевидной формы, бело-розовые или кремовые. Тычинок десять, цвет пыльников розоватого цвета. Пестик из десяти сросшихся плодолистиков (рис. 3.1.2.3).
Рис.3.1.2.3. Цветки лаконоса американского (слева) и лаконоса ягодного (справа)
Цветки лаконоса ягодного собраны в соцветия кисть длиной до 8 см. Цветки с простым околоцветником, на цветоножках размером 0,5 – 1 см, мелкие (3 – 6 мм в диаметре). Листочков околоцветника пять, они белые или зеленоватые, с розоватым оттенком. Тычинок десять, цвет пыльников желтоватый. Пестик из десяти разделенных плодолистиков. Внешние признаки травы лаконоса приведены в таблице 3.1.2.1.
Сравнительное изучение качественного состава тритерпеновых соединений высушенных корней лаконоса американского и лаконоса ягодного
Спектрофотометрический анализ агликонов в извлечениях из лаконоса, полученных с использованием этилового спирта различных концентраций и воды в описанных выше условиях, показал, что наибольшее содержание сапонинов наблюдается в извлечении, полученном с использованием в качестве экстрагента 70% этилового спирта, что согласовывалось с полученными ранее данными.
Методика определения агликонов сапонинов лаконоса в пересчете на олеаноловую кислоту: 1,00 г сырья, просеянного сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм, помещали в колбу на 100 мл, затем приливали 50 мл 70% этилового спирта и кипятили на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Аналогичным образом экстрагировали ещ 4 раза. Извлечение фильтровали, объем доводили до 250 мл, отбирали аликвоту 25 мл и выпаривали е на водяной бане. К выпаренному остатку приливали 10 мл 3 М HCl и кипятили в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 3 часов. Извлечение охлаждали, разбавляли водой в 2 раза и пятикратно экстрагировали этилацетатом в делительной воронке. Этилацетатное извлечение объединяли, промывали водой до нейтральной реакции среды промывных вод, и отгоняли растворитель в вакуумном испарителе. Полученный осадок помещали в мерную колбу на 25 мл, растворяли в 95% этиловом спирте доводили до метки (раствор А). 5 мл раствора А помещали в колбу на 25 мл и доводили 95% этиловым спиртом до метки (раствор Б). К 2 мл раствора Б добавляли равное количество аммиачного буфера (pH=10,0). Снимали оптическую плотность при длине волны 209±2 нм против смеси 95% спирт – аммиачный буфер (1:1).
Приготовление стандартного раствора олеаноловой кислоты: 0,0032 г СО олеаноловой кислоты помещали в мерную колбу на 10 мл, растворяли в 95% этиловом спирте и доводили раствор до метки. Затем пипеткой отбирали 5 мл, помещали в мерную колбу на 10 мл и доводили до метки. К 2 мл полученного раствора добавляли равное количество аммиачного буфера (pH=10,0). Снимали оптическую плотность при длине волны 209 нм против смеси 95% спирт – аммиачный буфер (1:1).
Таким образом, сумма агликонов сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту составила 13,64±0,27% у лаконоса ягодного и 6,79±0,16% у лаконоса американского (табл.5.3.1.1). Для приведенной методики определялись такие характеристики, как специфичность, линейность, правильность и прецизионность [12, 15, 16].
Для доказательства специфичности было показано, что характеристические компоненты четко определяются в образце в присутствии сопутствующих веществ. При аналитической длине волны оптическая плотность буферного раствора и раствора сравнения не отличалась от базовой линии. До добавления аммиачного буферного раствора поглощения при данной длине волны не наблюдалось, следовательно, сопутствующие вещества не вносят вклад в оптическую плотность испытуемых растворов.
Далее была доказана линейная зависимость в выбранном диапазоне применения методики между концентрацией исследуемого вещества в извлечении и оптической плотностью на пяти различных разведениях стандартного образца олеаноловой кислоты в концентрациях от 0,033 до 0,130 мг/мл. Для каждой точки было выполнено 3 измерения. В указанном диапазоне зависимость линейная, коэффициент корреляции составил 0,999 (рис. 5.3.1.5).
Правильность применяемой методики в сравнении с другой методикой доказать не представляется возможным, так как не существует другой проверенной спектрофотометрической или титриметрической методики для количественного определения сапонинов лаконоса. Метод ВЭЖХ направлен на определение отдельных сапонинов, тогда как спектрофотометрическая методика позволяет определить суммарное содержание сапонинов и сравнение этих двух методов не является корректным.
Правильность доказывалась путем добавления олеаноловой кислоты к исследуемому образцу с известной концентрацией сапонинов. Добавку проводили на уровнях от 80 до 120 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики. В эксперименте стандарт олеаноловой кислоты добавлялся к извлечению с известной концентрацией сапонинов, производных олеаноловой кислоты (к навеске с содержанием 60% целевой концентрации в пробе). Поскольку отклик был пропорционален добавленному количеству олеаноловой кислоты, это доказывает, что определяются именно производные олеаноловой кислоты. Содержание агликонов сапонинов в образце 6,79% (67,9 мг/г) для лаконоса американского (табл. 5.3.1.2) и 13,64% (136,4 мг/г) для лаконоса ягодного (табл. 5.3.1.3).