Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Анализ данных литературы по ботанической характеристике, химическому составу, применению кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой в народной медицине и фармакологическим исследованиям .
1.1 Ботаническая характеристика кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой 11
1.2 Химический состав кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой 14
1.3 Применение кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой в народной
медицине и фармакологические исследования 22
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 25
2.1 Объекты исследования 25
2.2 Методы исследования биологически активных веществ
2.2.1 Приготовление водных извлечений для качественного анализа 25
2.2.2 Анализ углеводов 26
2.2.3 Анализ азотсодержащих соединений 26
2.2.4 Анализ дубильных веществ 29
2.2.5 Анализ органических кислот 30
2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и разделение природных соединений 31
2.2.7 Анализ кумаринов 32
2.2.8 Анализ фенолкарбоновых кислот 32
2.2.9 Анализ флавоноидов
2.2.10 Исследование методом ВЭЖХ фенольных соединений 33
2.2.11 Анализ тритерпеновых соединений 34
2.2.12 Анализ каротиноидов 36
2.2.13 Исследование жирно-кислотного состава 37
2.2.14 Анализ сесквитерпеновых лактонов 37
2.2.15 Минеральный состав исследуемых видов растений 38
2.3 Методы изучения углеводов 39
2.3.1 Выделение полисахаридов 39
2.3.2 Изучение полисахаридов 41
2.4 Установление числовых показателей 45
2.5 Проведение морфолого-анатомических исследований 46
2.6 Методы токсико-фармакологических исследований
2.6.1 Определение острой токсичности 46
2.6.2 Определение антиоксидантной активности 47
2.6.3 Определение отхаркивающего действия 48
2.6.4 Определение противовоспалительной активности 48
2.6.5 Определение антибактериальной активности 50
2.7 Статистическая обработка полученных результатов 51
ГЛАВА 3 Результаты изучения качественного и количественного содержания биологически активных веществ кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой 52
3.1 Результаты анализа углеводных производных 52
3.1.1 Результаты анализа свободных сахаров 52
3.1.2 Результаты анализа связанных сахаров 53
3.2 Результаты анализа азотсодержащих соединений 53
3.2.1 Результаты анализа азотистых оснований 53
3.2.2 Результаты анализа аминокислотного состава 54
3.3 Результаты анализа дубильных веществ 57
3.3.1 Результаты качественного обнаружения дубильных веществ 57
3.3.2 Результаты количественного определения дубильных веществ 57
3.4 Результаты анализа органических кислот 57
3.4.1 Результаты качественного обнаружения органических кислот 57
3.4.2 Результаты количественного определения свободных органических кислот
3.5 Результаты анализа кумаринов 59
3.6 Результаты анализа фенолкарбоновых кислот 60
3.7 Результаты анализа флавоноидов 62
3.8 Результаты исследования методом ВЭЖХ фенольных соединений 63
3.9 Результаты анализа тритерпеновых соединений
3.9.1 Результаты качественого обнаружения тритерпеновых соединений 65
3.9.2 Результаты количественного определения тритерпеновых соединений 66
3.10 Результаты анализа каротиноидов 67
3.10.1 Результаты качественого обнаружения каротиноидов 67
3.10.2 Результаты количественного определения каротиноидов
3.11 Результаты исследования жирно-кислотного состава 67
3.12 Результаты исследования сесквитерпеновых лактонов
3.12.1 Результаты качественого обнаружения сесквитерпеновых лактонов 69
3.12.2 Результаты количественного определения сесквитерпеновых лактонов 3.13 Результаты анализа минерального состава растений 70
3.14 Результаты изучение углеводов 72
3.14.1 Выделение полисахаридных фракций 72
3.15 Результаты анализа углеводных фракций 73
3.15.1Результаты количественного определения моносахаридов в углеводных фракциях. 76
3.15.2 Результаты анализа функциональных групп пектиновых веществ 77
ГЛАВА 4 Исследование подлинности, показателей качества травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой 80
4.1 Определение подлинности сырья 80
4.1.1 Определение морфологических признаков травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой 80
4.1.2 Определение микродиагностических признаков травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой 81
4.2 Установление числовых показателей сырья 95
4.2.1 Результаты определения влажности 95
4.2.2 Результаты определения золы 96
4.2.3 Результаты определения экстрактивных веществ 97
4.3 Результаты определения суммы флавоноидов 98
4.3.1 Результаты разработки методики определения содержания суммы флавоноидов 99
4.3.2 Методика количественного определения суммы флавоноидов 103
4.3.3 Результаты валидации методики количественного определения суммы флавоноидов в траве кульбабы осенней 104
4.3.4 Содержание суммы флавоноидов в траве кульбабы осенней и кульбабы шершавоволоситой 108
4.4 Результаты количественного определения полисахаридов 109
4.4.1 Результаты изучения условий гравиметрического определения суммы полисахаридов по 4.4.2 Методика количественного определения суммы полисаха полисахаридов в траве кульбабы осенней 113
4.5 Изучение динамики кумуляции флавоноидов и полисахаридов в зависимости от фазы вегетации 115
4.6 Установление сроков годности сырья 116
4.7 Разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье «Кульбабы трава» 118
ГЛАВА 5 Изучение фармакологической активности кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой и стандартизация их водных извлечений 122
5.1 Результаты определения острой токсичности 122
5.2 Результаты определения антиоксидантной активности 123
5.3 Результаты определения отхаркивающей активности 127
5.4 Результаты определения противовоспалительной активности 128
5.5 Результаты определения антибактериальной активности 131
5.6 Стандартизация водных извлечений 133
Общие выводы 135
Список литературы
- Химический состав кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой
- Исследование методом ВЭЖХ фенольных соединений
- Результаты анализа азотсодержащих соединений
- Определение микродиагностических признаков травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой
Химический состав кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой
В медицине с давних времен используются лекарственные растения, многие из которых являются представителями семейства Астровых.
Семейство Астровые (Asteraceae) является крупнейшим семейством цветковых растений, насчитывающим около 1300 родов и более 20000 видов, распространенных по всему земному шару. В странах СНГ произрастает свыше 3500 видов [73]
Представители семейства чаще всего – травянистые растения, реже полукустарники; в тропиках имеется несколько древесных представителей [46].
Астровые распространены повсюду, где встречаются высшие растения - от тундровой до экваториальной зоны, от океанических берегов до горных вершин, на скупых барханах и плодороднейших черноземах [169].
Семейство разделяется на два не равных по объему подсемейства. Относительно невелико подсемейство Латуковые (Lactucoideae или Liguliflorae, Cichorioideae), к которому относятся все роды, имеющие корзинки исключительно с язычковыми цветками, причем язычки 5-зубчатые, вегетативная часть несет только у данного подсемейства млечники. Все остальные роды относятся к подсемейству Астровые (Asteroideae или Tubuliflorae) [73, 169].
Род Кульбаба – Leontodon L. относится к подсемейству Латуковые и включает в себя до 45 видов растений, большая часть которых распространена в Средиземноморье. На востоке род доходит до западной части Западной Сибири, на севере достигает тундровой зоны. Имеется несколько видов в Южной и Северной Америке [176].
В Европейской части России произрастают 4 представителя рода кульбаба: кульбаба осенняя (Leontodon autumnalis L.), кульбаба шершавоволосистая (Leontodon hispidus L.), кульбаба дунайская (Leontodon danubialis Jacq.) и кульбаба шершавая (Leontodon biscutellifolius DC.) [100].
В ходе изучения флоры Курской области А. В. Полуянов и Н. А. Прудников установили, что на территории данной области произрастают 2 вида кульбабы: кульбаба осенняя (Leontodon autumnalis L.) и кульбаба шершавоволосистая (Leontodon hispidus L.) [135]. Представители рода Кульбаба являются одно- и многолетними травянистыми растениями. Для них характерен простой стебель с одной корзинкой или ветвистый, с несколькими корзинками. Листья зубчатые или перисто надрезанные, реже почти цельнокрайние, образуют прикорневую розетку. Многоцветковые корзинки желтого или оранжевого цвета. Обвертки почти черепитчатые, состоящие из 1-3 рядов листочков, с более короткими наружными листочками. Цветоложе голое, ячеистое, волокнистое или мелкоямчатое, по краям ямок с маленькими волосистыми пленками. Семянки цилиндрические, более-менее веретенообразные, без носика или с коротким носиком, продольнобороздчатые, поперечноморщинистые; хохолок не опадающий, из 1-2 рядов щетинок, при основании не сросшихся. Щетинки внутреннего ряда перистые, наружного ряда всегда более короткие, часто просто зубчатые [176].
Кульбаба осенняя (Leontodon autumnalis L.) (рисунок 1) – многолетнее травянистое растение. Корневище укороченное, как бы обрубленное, с многочисленными крепкими волокнами. Стебель обычно ветвистый, реже простой, гладкий или более-менее обильно снабженный простыми волосками. Прикорневые листья лежачие, удлиненные, довольно широкие, с длинными крылатыми черешками, зубчатые или перисто надрезанные, или перисто раздельные с линейными долями, реже цельнокрайние или почти цельнокрайние.
Цветоносы длинные, полые, на вершине утолщенные, снабженные линейными или шиловидными, прижатыми к стеблю листочками. Корзинки до цветения прямостоячие, во время цветения до 2 см длиной, при плодах до 2,5 см шириной. Обвертка из ланцетных листочков с белым паутинистым опушением или кроме того с рыжими щетинистыми, реже белыми или черными волосками. Венчик желтый или очень редко бледно-фиолетовый. Семянки веретеновидные, 5 мм длиной, к верхушке и к основания слабо суженные, бороздчатые, поперечноморщинистые. Хохолок до 6-7 мм длиной, грязно-белый, с одним рядом перистых к основанию слабо расширенных и зубчатых щетинок, реже среди перистых встречаются простые зубчатые щетинки [176]. Цветет с июня до осени [100].
Кульбаба осенняя распространена в Центральной и Атлантической Европе,
Скандинавии, странах СНГ, занесена в Северную Америку. Она произрастает в Европейской части России, Предкавказье, Южном Закавказье, Западной и Восточной Сибири, на Камчатке, на Сахалине. Кульбаба осенняя растет на полях, выгонах, лугах, в кустарниковых зарослях, в разреженных лесах [73, 176]. Согласно Флоры Центрального Черноземья коэффициент встречаемости кульбабы осенней составляет 81-100 % [77].
Кульбаба шершавоволосистая (Leontodon hispidus L.) (рисунок 2) – многолетнее травянистое растение высотой 10-60 см. Корневище короткое, как бы обрубленное, горизонтально или вертикально вниз направленное, с многочисленными нитевидными корнями, стрелка прямая, шероховатая от мелких вильчатых волосков, внизу иногда розоватая, вверху под корзинкой слабо утолщенная, густоволосистая, безлистная, или реже с одним линейным листом, преимущественно в верхней части.
Рисунок 2 – Кульбаба шершавоволосистая (Leontodon hispidus L.) (фото автора) Прикорневые листья длиной 5-20 см, 1-3 см шириной, продолговатые или ланцетные, выемчато-зубчатые, надрезанно-выемчатые, покрытые короткими жесткими вильчатыми волосками, на нижней поверхности с многочисленными точечными ямками, на дне которых сидят вильчатые волоски, в живом состоянии большей частью волнисто-курчавые, к основанию постепенно сужающиеся в довольно длинный, иногда розовый черешок.
Корзинки во время цветения прямостоячие, до цветения поникающие, диаметром 1,2-3 см. Язычковые цветки желтые, листочки обвертки линейные, линейно-ланцетные, темно-зеленые, наружные отклоненные листочки щетинисто-волосистые, с простыми щетинистыми волосками и с небольшой примесью двувильчатых волосков, вверху по краю паутинисто 14 волосистые. Цветоложе пленчатое, волосистое, слегка выпуклое. Семянки длинной 4-6 мм, шириной 0,75 мм, веретеновидные, с относительно коротким носиком, прямые или слегка изогнутые, продольнобороздчатые, поперечноморщинистые, светло-коричневые, блестящие. Хохолок двурядный, щетинки наружного ряда короткие, зубчатые, внутреннего ряда перистые – до 7 мм длиной, при основании расширенные, блестящие [176]. Цветет в июне-июле, иногда вторично в августе [100]. Распространена в различных регионах Цетральной и Атлантической Европы, Скандинавии, на Балканском и Антолийском полуострове и на территории стран СНГ. В России кульбаба шершавоволосистая произрастает в Европейской части, в Причерноморье и на Кавказе. Растет на полянах, опушках, лугах, в степях, среди зарослей кустарников [73, 176, 100]. Согласно Флоры Центрального Черноземья коэффициент встречаемости кульбабы шершавоволосистой составляет 21-40 % [77].
Исследование методом ВЭЖХ фенольных соединений
Сведения, представленные в обзоре литературы, демонстрируют разнообразие химического состава изучаемых видов. Так, ранее из них были выделены: фенольные соединения, тритерпены, гваянолидовые сесквитерпены, витамины, жирное масло. Данные виды изучались, в основном, зарубежными авторами. В это же время сырье, из флоры Российской Федерации, практически не изучено. В связи с этим, целесообразным является изучение химического состава кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой, которые широко распространенны в областях Центральной России.
На начальном этапе нами было проведено изучение химического состава кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой, направленное на выявление различных классов природных соединений, представленных в растительном сырье [глава 2, раздел 2.2]. Результатом исследований явилось установление наличия углеводов, карбоновых, в том числе органических, фенолкарбоновых, и жирных кислот, каротиноидов, азотсодержащих, тритерпеновых и фенольных соединений (дубильных веществ, кумаринов, флавоноидов), минеральных элементов, сескитерпеновых лактонов.
Свободные сахара качественно определяли реакцией Бертрана (по образованию с реактивом Фелинга кирпично-красного осадка меди оксида) и бумажной хроматографией [глава 2, раздел 2.2.2]. Моносахариды открывались в виде красно-коричневых зон абсорбции. Таким образом, с достоверными образцами сахаров в траве кульбабы осенней идентифицировали глюкозу, в траве кульбабы шершавоволосистой - глюкозу и фруктозу.
Для подтверждения присутствия гликозидов проводили реакции с реактивом Фелинга и раствором а-нафтола 20% [глава 2, раздел2.2.2]. Выпадение большего количества осадков при взаимодействии с жидкостью Фелинга, после предварительного проведения гидролиза кислотой серной 5%, свидетельствует о присутствии связанных сахаров в траве кульбабы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой. Появление колец вишнево-красного цвета с раствором -нафтола свидетельствует о наличие сахаров в форме гликозидных соединений в сырье изучаемых растений.
Для выделения полисахаридов к концентрированным водным извлечениям добавляли спирт этиловый 96% [глава 2, раздел 2.2.2], в результате чего происходило образование рыхлых осадков. Полученные осадки отделяли от жидкой среды, промывали спиртом этиловым 96% и высушивали на воздухе. К растворам, оставшимся после отделения полисахаридных осадков, прибавляли жидкость Фелинга и раствор меди сульфата.
Положительные реакции свидетельствуют о наличии в траве кульбабы осенней и в траве кульбабы шершавоволосистой полисахаридов.
Азотистые основания играют важную роль в физиологических реакциях организма. Холин является составной частью наиболее распространенных фосфолипидов - лецитина и сфингомиелина, проявляет липотропное действие [7, 163].
Холин и бетаин оказывают влияние на деятельность нервной системы, связанную с формированием и функционированием условных рефлексов, а также на процессы возбуждения и торможения [7], что говорит о целесообразности изучения азотистых оснований в траве кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой. Качественное обнаружение Присутствие азотистых оснований в траве кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой в водных извлечениях доказывали качественными реакциями и методом бумажной хроматографии [глава 2, раздел 2.2.3].
При проведении качественных реакций с раствором кислоты фосфорновольфрамовой 3% происходило помутнение извлечений, с реактивом Манделина наблюдалось появление кольца красно-коричневого цвета на границе двух сред, с раствором кислоты хлористоводородной 0,2 н и бриллиантовым зеленым 0,1% -окрашивание растворов в зеленый цвет.
Хроматограммы помещали в эксикатор, в котором проводили их проявление йодными парами. При нанесении водных извлечений из травы кульбабы осенней на хроматографическую бумагу установлено наличие 3 соединений (Rf 0,28, Rf 0,45, Rf 0,80), а при нанесении водных извлечений травы кульбабы шершавоволосистой - 6 соединений (Rf 0,13, Rf 0,22, Rf 0,32, Rf 0,51, Rf 0,67, Rf 0,80), относящихся к азотистым основаниям (рисунок 4).
Содержание азотистых оснований устанавливали методом фотоэлектроколориметрии [глава 2, раздел 2.2.3]. Содержание суммы азотистсодержащих соединений в траве кульбабы осенней составило 0,075±0,001%, в том числе холина – 0,055±0,001%; в траве кульбабы шершавоволосистой – 0,096±0,003%, в том числе холина – 0,067±0,002%.
Аминокислоты в составе белков и ферментов участвуют практически во всех физиологических процессах организма. Аминокислоты не только являются структурными составляющими белков и ферментов, но и находятся в свободном виде в тканях растений и клеточном соке в качестве резерва. Они участвуют в различных обменных процессах.
Результаты анализа азотсодержащих соединений
Стебель в поперечном сечении округлый, поверхность ребристая. Ребер в количестве 12-15 (рисунок 38). Клетки эпидермиса удлиненные, вытянутые вдоль оси стебля с прямыми или заостренными концами. Наружная стенка клеток эпидермиса утолщена и покрыта кутикулой. Устьица аномоцитного типа. Эпидермис опушен многоклеточными, многорядными, ветвистыми волосками (древовидные волоски) (рисунки 39, 40, 41).
Стебель пучкового типа строения. Первичная кора хорошо выражена и состоит из колленхимы, паренхимы и эндодермы. Колленхима пластинчатая, залегает под эпидермисом в 3-5 слоев в ребрах и 1-2 слоя в межреберье, далее в 2-5 слоев следует хлорофиллоносная паренхима. Эндодерма хорошо выражена, клетки ее крупные расположены в один слой. Центральный цилиндр начинается с перициклической склеренхимы, которая залегает над пучками крупными участками и переходит в межпучковую зону, образуя сплошное кольцо. Закрытые коллатеральные пучки располагаются по кругу, более крупные отмечены в ребрах, в межреберье пучки меньших размеров. Флоэма пучков тонкостенная, мелкоклеточная, сосуды ксилемы расположены радиальными рядами, между которыми залегают склеренфицированные участки паренхимы. Паренхима сердцевины занимает небольшой объем, в центре стебля она разрушается, образуя полость. Клетки ее крупные, округлой формы (рисунок 40).
При рассмотрении микропрепаратов листа с поверхности было установлено, что клетки верхнего эпидермиса прямостенные, клетки нижнего эпидермиса сильно извилистостенные, с продольной морщинистой кутикулой (рисунки 42, 43, 45).
По краю листа и вдоль жилки клетки эпидермиса прямостенные, прозенхимной формы с прямыми или со скошенными концами (рисунок 46). Устьица располагаются равномерно, как на нижнем, так и на верхнем эпидермисе. Устьичный аппарат аномоцитного типа (рисунки 42, 43). Вдоль жилки листа отмечено наличие млечников (рисунок 44).
Эпидермис листа опушен простыми волосками двух типов: - многоклеточными, многорядными, ветвистыми волосками (древовидные волоски), расположенными на возвышающем пьедестале. Такой тип волосков встречается по краю, вдоль жилки, на нижнем эпидермисе листа (рисунки 45 и 47). - многоклеточными (четырех-семи), тонкостенными волосками, стенки клеток которых часто спадаются и перекручиваются. Такие волоски приурочены к жилке и наклонены к поверхности листа, прилегая к нему (рисунки 46, 48). При изучении микропрепарата язычкового цветка с поверхности установлено, что клетки эпидермиса трубки венчика прозенхимной формы, с прямыми боковыми стенками. Эпидермис зубцов венчика представлен клетками с сосочковидными выростами, которые хорошо прослеживаются на верхушке и по краю зубцов венчика язычкового цветка. В средней части зубцов венчика клетки эпидермиса продольно вытянутые с мелкозазубренными боковыми стенками (рисунки 49, 50, 51).
На эпидермисе трубки венчика встречаются длинные многоклеточные, многорядные волоски с заостренной конечной клеткой однорядной или многорядной верхушки (рисунки 52, 53). Клетки эпидермиса по краю листочков обвертки тонкостенные, прямостенные с прямыми или со скошенными конечными клетками. Ближе к серединной части клетки эпидермиса слегка извилистостенные. Клетки эпидермиса обвертки с бурым содержимым (рисунки 56, 59). Вдоль жилок листочков обвертки проходят млечники. Листочки обвертки опушены различными типами волосков: многоклеточными тонкостенными длинными волосками со спадающимися стенками, часто перекрученными, такой тип волосков встречается на верхушке листочков обвертки (рисунок 55); многоклеточными многорядными волосками, с заостренной конечной клеткой и одно или многорядной верхушкой расположенными по краю и по поверхности листочков обвертки (рисунок 59); многоклеточными, многорядными, ветвистыми волосками (древовидные волоски), чаще приуроченными к жилке обвертки (рисунок 56); простыми одно-четырехклеточными тонкостенными волосками, с оттянутой или тупой верхушкой, со спадающимися стенками; такой вид волосков встречается по краю обвертки (рисунки 57, 58).
Определение микродиагностических признаков травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой
При выборе направлений фармакологического скрининга мы основывались на данных об использовании кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой в народной медицине, представленных в главе 1 [глава 1, раздел 1.3], а также на результатах собственных исследований химического состава изучаемых видов. Таким образом, нами предложены следующие векторы фармакологического скрининга: - изучение острой токсичности; изучение антиоксидантной активности; - изучение отхаркивающего действия; изучение противовоспалительной активности; изучение антибактериальной активности.
Для изучения острой токсичности исследуемые фитокомплексы (настои и водорастворимые полисахаридные комплексы), полученные из травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой, вводили беспородным белым мышам различного пола массой от 18,0 г до 20,0 г [глава 2, раздел 2.6.1].
Результаты проведенного эксперимента, отраженные в таблице 36, демонстрируют, что при введении в забрюшинное пространство изучаемых настоев в дозе от 1000 до 5000 мг/кг и водорастворимых полисахаридных комплексов в дозе от 100 до 300 мг/кг не отмечалась гибель животных.
Средняя летальная доза (LD50) в ходе проведения эксперимента не была установлена, так как при введении максимально допустимой дозы не наблюдалась гибель животных.
Таким образом, было установлено, что исследуемые фитокомплексы не обладают токсичностью в анализированном диапазоне доз.
Интерпретация полученных данных на основе классификации К.К. Сидорова, позволяет отнести исследуемые фитокомплексы к классу практически нетоксичных веществ.
Результаты изучения острой токсичности настоев и водорастворимых полисахаридных комплексов кульбабы осенней и кульбабы шершавоволоситой Фитокомплекс Доза, мг/кг Количество животных живых погибших Кульбаба осенняя Настой 1000 6 2000 6 3000 6 4000 6 5000 6 0 Водорастворимыйполисахаридныйкомплекс 100 6 200 6 300 6 0 Кульбаба шершавоволосистая Настой 1000 6 2000 6 3000 6 4000 6 5000 6 0 Водорастворимыйполисахаридныйкомплекс 100 6 200 6 300 6 0
В настоящее время большое внимание медицинского сообщества обращено к оксидативному стрессу. Оксидативный стресс представляет собой окислительное повреждение клеточных компонентов, вызванное воздействием реактивных форм кислорода, главным образом, свободными радикалами.
Свободнорадикальное окисление является патофизиологической составляющей онкологических и воспалительных заболеваний, сахарного диабета, атеросклероза, катаракты, болезней Паркинсона и Альцгеймера, сердечно-сосудистых заболеваний и процессов старения [152, 237].
Формирование естественных антиоксидантных механизмов осуществляется благодаря использованию в пищу продуктов, обладающих выраженными оксидазо-ингибирующими свойствами [152]. Важное значение в данном случае имеет потребление местного растительного сырья, содержащего наиболее усваемые нутриенты и обеспечивающего поддержание антиоксидантной защиты организма [152].
В настоящее время определение антиоксидантной активности проводят различными методами: методом добавления содержащих антиоксиданты образцов в модельную реакцию окисления, хемилюминесцентным, спектрофотометрическим, кулонометрическим и вольтамперометрическим методами [4, 78, 119, 178, 185].
Несмотря на многообразие применяемых методов определения антиоксидантной активности, отсутствует общепринятая единица ее измерения, в связи с чем, получаемые с их помощью результаты, значительно отличаются.
Наиболее универсальным методом является сравнение антиоксидантной активности изучаемого объекта с антиоксидантной активностью сильного восстановителя. В качестве субстратов восстановителей чаще всего используют известные флавоноидные соединения: рутин, кверцетин, цинарозид и дигидрокверцетин.
Изучение антиоксидантной активности извлечений из кульбабы осенней и кульбабы
шершавоволосистой проводили по методике, основанной на окислительно восстановительном взаимодействии между извлеченными из сырья веществами, обладающими восстановительными свойствами, и раствором калия перманганата (окислителем) [глава 2, раздел 2.6.2].
Анализируемые извлечения готовили в соотношении масса сырья – объем экстрагента 1:10. Экстракцию проводили в течение 15 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником, после чего колбы охлаждали в течение 45 минут на воздухе. Охлажденные извлечения фильтровали через бумажные фильтры в мерные колбы и доводили соответствующим растворителем до первоначального объема. Для установления оптимальной извлекающей способности веществ восстановительного характера, определяли антиоксидантную активность в различных извлечениях. В качестве экстрагентов применяли воду очищенную и спирт этиловый различных концентраций: 30%, 50%, 70% и 96%. Антиоксидантную активность определяли в пересчете на рутин, кверцетин и цинарозид, используемые в качестве стандартных растворов [119].
Согласно литературным данным антиоксидантная активность растений объясняется в основном наличием фенольных соединений, в частности флавоноидов и гидроксикоричных кислот [1, 60, 221]. Для выявления биологически активных веществ, обуславливающих антиоксидантную активность, в полученных извлечениях устанавливали количественное содержание флавоноидов и суммы фенольных соединений. Количественное определение суммы флавоноидов проводили в соответствии с ранее разработанной методикой [глава 4, раздел 4.3.1.].
Количественное содержание суммы фенольных соединений устанавливали методом прямой спектрофотометрии в пересчете на хлорогеновую кислоту, для чего исследуемый объем анализируемого извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки соответствующим экстрагентом, спектрофотометрировали при длине волны 325 нм. Расчет количественного содержания фенольных соединений вели с использованием удельного коэффициента поглощения хлорогеновой кислоты в спирте этиловом 50% равном 504 [31]. Результаты определения представлены в таблице 37.