Фармакогностическое изучение комплексных лекарственных растительных средств Бобкова Наталья Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Лекарственное растительное сырье, сырье животного происхождения и грибы как фармацевтические субстанции природного происхождения в составе лекарственных средств 12

1.2. Современные требования к качеству лекарственного растительного сырья (ЛРС) как фармацевтической субстанции растительного происхождения (ФСРП) 33

Глава 2. Объекты и методы исследования .42

Глава 3. Изучение микроскопических маркеров природного сырья отечественной и зарубежной медицины 52

3.1. Растительное сырье различных морфологических групп 52

3.1.1. Листья 53

3.1.2. Цветки 61

3.1.3. Травы и побеги .65

3.1.4. Плоды и семена 81

3.1.5. Коры 93

3.1.6. Подземные органы 96

3.2. Сырье грибного происхождения 122

3.2.1. Чага и трутовик настоящий .122

3.2.2. Пория кокосовидная .124

3.3. Сырье животного происхождения 126

3.3.1. Бадяга 126

3.3.2. Грудной щит сепии 127

3.4. Использование гистохимического анализа в определении подлинности и идентификации сырья различного происхождения .129

Глава 4. Изучение влияния технологических факторов на вариабельность анатомо-диагностических признаков ЛРС при микроскопическом анализе 139

4.1. Влияние измельченности .139

4.2. Влияние способа измельчения .169

4.2.1. Сравнительный анатомический анализ растительных порошков, полученных традиционным способом и с использованием криотехнологии 170

4.2.2. Сравнительный анатомический анализ растительных порошков, полученных традиционным способом и с использованием струйного измельчения .174

4.3. Влияние специфической первичной обработки сырья .176

Глава 5. Идентификация лекарственного сырья в лекарственных средствах методом микроскопического анализа .180

5.1. Монокомпонентные препараты из растительных порошков .180

5.2. Комплексные малокомпонентные препараты с растительными порошками 190

5.3. Комплексные многокомпонентные препараты с растительными порошками

2 5.3.1. Драже «Тонзилгон»

5.3.2. Драже «Канефрон» .206

5.3.3. Пилюли «Долартрин» .209

5.3.4. Пилюли «Глибедин» .216

5.3.5. Таблетки «Вентеронова» 220

Общие выводы .226

Список сокращений .230

Список литературы

• Современные требования к качеству лекарственного растительного сырья (ЛРС) как фармацевтической субстанции растительного происхождения (ФСРП)
• Пория кокосовидная
• Сравнительный анатомический анализ растительных порошков, полученных традиционным способом и с использованием криотехнологии
• Комплексные многокомпонентные препараты с растительными порошками

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Вопросы стандартизации и контроля качества лекарственных средств (в т.ч. и растительных) остаются приоритетными для отечественной фармации на современном этапе.

Метод микроскопического анализа, являясь одним из старейших и традиционных методов оценки подлинности лекарственного растительного сырья (ЛРС), не теряет своей актуальности и по сей день. Во все современные фармакопеи мира включены общие фармакопейные статьи, регламентирующие микроскопический метод, а в частные – микроскопические характеристики подлинности ЛРС.

Наряду с оценкой качества цельного ЛРС, как субстанции (что привычно и традиционно) метод микроскопического анализа должен использоваться и в оценке качества лекарственных растительных средств, и не только тех, которые служат для приготовления настоев и отваров (измельченное сырье, сборы, фильтр-пакеты), но и лекарственных препаратов, в состав которых входит нативное ЛРС (таблетки, драже, капсулы и другие твердые дозированные лекарственные формы.)

Ассортимент таких препаратов имеет тенденцию к расширению за счет препаратов восточной, в том числе китайской медицины, в традициях которой принято использование многокомпонентных высокодисперсных смесей измельченного растительного сырья, а нередко, сырья животного и минерального происхождения.

Изготовление и производство лекарственных растительных средств и тем более лекарственных препаратов с растительным сырьем сопряжено с применением ряда технологических процессов, способных оказать влияние на микроскопический анализ, что выражается в изменении (вариабельности) анатомо-диагностических признаков и необходимости выбора оптимальной пробоподготовки для его проведения.

В работах Ермаковой В.А., Потаниной О.Г. и др., посвященных применению и развитию микроскопического метода в анализе лекарственного растительного сырья, изучались вопросы совершенствования микроскопических характеристик лекарственных растительных средств, в том числе и комплексных, например, сборов, с учетом влияния измельчености, биометрических параметров, унификации терминологии анатомических признаков.

Однако единого системного подхода к идентификации лекарственного растительного сырья в виде порошка и комплексных лекарственных растительных средств, нашедшего отражение в современных нормативных документах, до настоящего времени выработано не было.

Таким образом, исследование вариабельности анатомо-диагностических признаков лекарственного растительного сырья различных морфологических групп и способов обработки, разработка индивидуальных методик определения подлинности и показателей качества комплексных лекарственных растительных средств, выявление закономерностей визуализации в них диагностических признаков сырья и формирование общего методического подхода к оценке качества подобных лекарственных средств методом микроскопического анализа является актуальной задачей.

Степень разработанности темы исследования. Микроскопическому анализу посвящали свои исследования такие выдающиеся российские фармакогносты как Гаммерман А.Ф., Ладыгина Е.Я., продолжателями традиций являются Самылина И.А., Ермакова В.А. К новому поколению фармакогностов-микроскопистов можно отнести Потанину О.Г. Все они внесли свой вклад в совершенствование и развитие микроскопического анализа лекарственного растительного сырья.

В настоящее время развитие микроскопического метода анализа происходит в области стандартизации свежего и быстрозамороженного лекарственного растительного сырья, более широкого внедрения количественных характеристик при микроскопической диагностике ЛРС (Потанина О.Г., 2003 г). В Самарском ГМУ изучаются возможности петиолярной микроскопии в качестве нового метода диагностики лекарственного растительного сырья (Куркин В.А. и др, 2014-2016 гг). Вместе с тем в литературе нет сведений об исследованиях, посвященных системному подходу к микроскопической диагностике ЛРС сырья как фармацевтической субстанции растительного происхождения (ФСРП) в составе разного рода комплексных лекарственных растительных средств, основанной на вариабельности диагностических признаков в зависимости от морфологической группы, размера частиц, способа измельчения и обработки сырья.

Не нашли пока отражение в ГФ РФ XIII издания требования к качеству твердых дозированных лекарственных форм, содержащих ЛРС и особенности оценки его подлинности методом микроскопического анализа.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось экспериментальное и теоретическое обоснование методического подхода к идентификации ЛРС и комплексных лекарственных растительных средств с использованием микроскопического метода.

Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1) Проанализировать и обобщить основные нормативные и научные данные по

вопросу стандартизации ЛРС как ФСРП, в том числе и в составе комплексных лекарственных средств, с использованием микроскопического метода.

1. Изучить маркеры анатомического строения и вариабельность анатомо-диагностических признаков лекарственного растительного сырья европейской и восточной медицины под влиянием некоторых технологических факторов (первичной обработки, размера частиц, условий измельчения) на диагностику растительного сырья при микроскопическом исследовании.

2. Обобщить и проанализировать опыт применения гистохимических реакций в анализе ЛРС. Расширить применение некоторых гистохимических реакций в определении подлинности и идентификации ЛРС различной дисперсности, в том числе и в составе комплексных лекарственных средств.

3. Изучить особенности проведения микроскопической идентификации ЛРС различных морфологических групп и измельченности, сырья животного происхождения и грибов индивидуально и в составе твердых дозированных лекарственных форм с использованием различных условий пробоподготовки.

4. Изучить возможность идентификации ЛРС в комплексных лекарственных средствах: отечественного производства (таблетках “Коделак”, “От кашля”, “Аллохол”, “Викаир”, “Викалин”, брикетах “Кафиол”), европейских производителей ("Канефрон", "Тонзилгон") лекарственных средств традиционной китайской медицины ("Долартрин", "Глибедин", "Вентеронова") и разработать критерии их подлинности.

5. Разработать дополнения для общих фармакопейных статей "Техника микроскопического и микрохимического исследования ЛРС", "Таблетки", посвященные микроскопической идентификации ЛРС в составе фильтр-пакетов, монокомпонентных и комплексных дозированных лекарственных растительных средств.

Научная новизна. Изучено влияние различных факторов (размера частиц, способа измельчения, специфической обработки сырья традиционной китайской медицины, использования вспомогательных веществ в лекарственных растительных препаратах) на вариабельность и визуализацию анатомо-диагностических признаков ЛРС различных морфологических групп при микроскопическом анализе.

Предложены оптимальные условия пробоподготовки микроскопического анализа, позволяющие визуализировать диагностические признаки лекарственного растительного сырья в зависимости от морфологической группы и измельченности.

Определены и охарактеризованы анатомо-диагностические признаки 21 вида
лекарственного растительного сырья европейской и восточной медицины; дополнены и
уточнены микроскопические характеристики подлинности 74 фармакопейных

фармацевтических субстанций растительного происхождения. В соответствии с современными фармакопейными требованиями анатомо-диагностические признаки всех

объектов исследования документально подтверждены более чем 500 фотоиллюстрациями, приведенными в диссертационной работе и публикациях по теме диссертации.

Выявлены особенности микроскопической диагностики сырья животного происхождения и грибов на примере бадяги, грудного щита сепии, чаги, трутовика настоящего и пории кокосовидной.

В качестве дополнительного критерия подлинности предложены методики проведения гистохимических реакций для порошков листьев толокнянки, листьев брусники, коры дуба, коры корицы, корневищ сыти, корней пиона, пории кокосовидной, травы термопсиса ланцетного и твердых дозированных лекарственных форм на их основе.

Доказана возможность идентификации ЛРС в комплексных лекарственных средствах: отечественного производства (таблетках “Коделак”, “От кашля”, “Аллохол”, “Викаир”, “Викалин”, брикетах “Кафиол”), европейских производителей ("Канефрон", "Тонзилгон") лекарственных средств традиционной китайской медицины ("Долартрин", "Глибедин", "Вентеронова»), разработаны оригинальные методики пробоподготовки к микроскопическому анализу и определены критерии их подлинности.

Экспериментально обоснован и сформулирован методический подход к микроскопической идентификации ЛРС в монокомпонентных дозированных и комплексных лекарственных растительных средствах.

Теоретическая значимость исследования. Предложена классификация

лекарственных препаратов на основе ЛРС как ФСРП, диференцирующая ЛРП для приготовления водных извлечений и твердые дозированные лекарственные формы, содержащие нативное ЛРС.

Экспериментально доказана вариабельность анатомо-диагностических признаков ЛРС различных морфологических групп в зависимости от дисперсности, условий измельчения, вспомогательных веществ, используемых при таблетировании. Установлено влияние специфичной первичной обработки сырья традиционной китайской медицины на диагностику запасного питательного вещества, в результате которой размер и форма крахмальных зерен утрачивает свое значение.

Практическая значимость исследования. Разработанные микроскопические характеристики подлинности включены в нормативную документацию предприятия ООО Фирма «Здоровье», по которой осуществляется промышленный выпуск следующих лекарственных средств: трава полыни, трава тысячелистника, трава череды, трава мелиссы, трава чабреца, трава душицы, трава пустырника, трава донника, трава спорыша, трава горца перечного, трава пастушьей сумки, трава хвоща полевого, трава фиалки, трава зверобоя, листья мать-и-мачехи, листья шалфея, листья мяты перечной, листья

ортосифона тычиночного, листья сены, листья толокнянки, листья брусники, листья эвкалипта, листья крапивы, листья подорожника, цветки ромашки, цветки календулы, цветки бессмертника, цветки пижмы, цветки липы, плоды рябины, плоды шиповника, плоды фенхеля, плоды кориандра, плоды укропа, плоды жостера, плоды черники, соплодия хмеля, корни алтея, корневища змеевика, корни солодки, корневища аира, корневища лапчатки, корневища и корни элеутерококка, корневища с корнями валерианы, чага, слоевища ламинарии, бадяга.

Характеристика подлинности листьев крапивы и пробоподготовка включены в ведомости изменений к ФС на таблетки «Аллохол», покрытые оболочкой, выпускаемые ПО «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А.Семашко.

Пробоподготовка и характеристики подлинности порошков корня солодки и травы термопсиса включены в раздел подлинность ФС таблетки «Коделак», выпускаемые АООТ "Томский химико-фармацевтический завод".

Пробоподготовка и характеристики подлинности растительного сырья включены в нормативную документацию на драже «Канефрон», «Тонзилгон», а также препараты традиционной китайской медицины «Глибедин», «Долартрин», «Вентеронова».

Сформирован банк фотоиллюстраций анатомо-диагностических признаков 95 видов лекарственного растительного сырья, материалы которого использованы при создании учебного пособия «Фармакогнозия. Атлас., т.3», «Лекарственные растения Государственной Фармакопеи» по курсу фармакогнозии для студентов фармацевтических вузов и факультетов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения влияние различных факторов (размера частиц, способа измельчения,
специфической обработки сырья традиционной китайской медицины, использования
вспомогательных веществ в лекарственных растительных препаратах) на вариабельность
и визуализацию анатомо-диагностических признаков ЛРС различных морфологических
групп при микроскопическом анализе;

- результаты исследований по разработке оптимальных условий пробоподготовки
микроскопического анализа, позволяющие визуализировать диагностические признаки
лекарственного растительного сырья в зависимости от морфологической группы и
измельченности;

- результаты сравнительного экспериментального микроскопического изучения 90 видов
цельного и измельченного лекарственного растительного сырья европейской и
традиционной китайской медицины, относящегося к морфологическим группам «листья»,
«цветки», «травы», «плоды», «семена», «коры», «подземные органы»;

- результаты микроскопической диагностики сырья животного происхождения и грибов
(бадяги, грудного щита сепии, чаги, трутовика настоящего и пории кокосовидной);

- результаты исследований по определению биологически активных веществ с
использованием гистохимических реакций, расширяющие возможности
микрохимического анализа для идентификации сырья за счет доказательства наличия и
определения локализации биологически активных веществ, визуализации
диагностических признаков в комплексных дозированных лекарственных средствах и
возможности дифференциации близкородственных видов лекарственного растительного
сырья;

- результаты исследований по идентификации ЛРС в комплексных лекарственных
средствах: отечественного производства (таблетках “Коделак”, “От кашля”, “Аллохол”,
“Викаир”, “Викалин”, брикетах “Кафиол”), европейских производителей ("Канефрон",
"Тонзилгон") лекарственных средств традиционной китайской медицины ("Долартрин",
"Глибедин", "Вентеронова») методом микроскопического анализа.

Методология и методы исследования. Теоретическую основу исследования
составили труды отечественных ученых (Гаммерман А.Ф., Муравьева Д.А., Арзамасцев
А.П., Самылина И.А.), развивающие системный подход в создании и стандартизации
рациональных лекарственных растительных препаратов, а также международная и
российская нормативная документация на ЛРС. Методология исследования построена на
сравнительном анализе литературных и полученных экспериментальных данных по
определению характеристик подлинности ЛРС как ФСРП в составе лекарственных
средств с последующим выбором оптимальных подходов и методик, позволяющих
идентифицировать ЛРС и дать рекомендации проведения микроскопического и
микрохимического анализа. При выполнении работы использованы методы

сравнительного документированного анализа; методы фармакогностического анализа ЛРС, в том числе микроскопический и микрохимический, математические методы анализа и обработки результатов.

Достоверность научных положений и выводов. Все полученные результаты и выводы, сделанные из них, основаны на достаточном количестве экспериментальных исследований. В работе использовалось современное сертифицированное оборудование, на которое выданы действующие свидетельства о поверке. В исследовании использован достаточный объем литературных источников отечественных и иностранных авторов.

Апробация результатов исследования. Результаты и основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях: Итоговая научная конференции НИИ Фармации (Москва, февраль 2007, 2010 гг); I Российский

фитотерапевтический съезд (Москва, март 2008 г); Научно-практическая конференция с международным участием "Достижения клинической фармакологии в России" (Москва, сентябрь 2009 г.); XVIII, XX, XXI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2011, 2013, 2014гг); Научно-практическая конференция НИИ Фармации «Стандартизация лекарственных растительных препаратов» (Москва, май 2011); I, II Международный конгресс «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (Москва 2011, 2012гг); I, II, III, IV Научно-практическая конференция «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (НИИ Фармации ГБОУ ВПО им. И.М. Сеченова, февраль 2013, 2014, 2015, 2016 гг); I, II Всероссийская научная интернет-конференция с международным участием "Ботаника и природное многообразие растительного мира" (Казань, декабрь 2013, 2014 гг); XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI Московская международная гомеопатическая конференция (Москва, январь 2011 - 2016 гг); Научно-практическая конференция к 70-летию Ботанического сада Первого Московского медицинского университета имени И.М. Сеченова (Москва, сентябрь 2016 г).

Апробация диссертации состоялась 26 февраля 2015 г. на заседании научной межкафедральной конференции кафедры фармакогнозии фармацевтического факультета и лаборатории фармакогнозии НИИ Фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ.

Личный вклад автора. Лично автором осуществлен выбор научного направления, выполнена основная часть экспериментальных исследований. Во всех работах, опубликованных с соавторами, автору принадлежат постановка цели и задач, обоснование выбора оптимальных путей их решения, планирование и реализация эксперимента, анализ полученных результатов, формулировка общих выводов; участие в докладах и публикациях, внедрение результатов исследования.

Внедрения результатов исследования. Разработанные микроскопические

характеристики подлинности включены в нормативную документацию предприятия ООО Фирма «Здоровье» (акты внедрения от 12 марта 2007 г, 04 сентября 2008 г, 14 ноября 2009 г, 14 февраля 2010 г, 02 ноября 2011 г, 14 сентября 2012 г, 12 февраля 2015 г).

Значительная часть материалов диссертации нашла отражение в учебном пособии: Фармакогнозия. Атлас: учебное пособие // Самылина И.А., Ермакова В.А., Бобкова Н.В., Аносова О.Г. – Т.3. – М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2009. – 488 с., и внедрена в учебный процесс кафедры фармакогнозии ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ (акт внедрения от 26 декабря 2016 г.)

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2, 3 и 6 паспорта специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно исследовательских работ ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по научной проблеме «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармакогнозии ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов, оценки качества и сертификации».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 275 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, списка литературы, включающего 239 источников, в том числе 50 иностранных, содержит 109 рисунков, 18 таблиц и 11 приложений.

Во введении обоснована актуальность темы; сформулированы цель, задачи исследования; указаны научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы, методология, положения, выносимые на защиту, доклады и публикации по теме диссертации; отражен личный вклад автора. В первой главе (обзор литературы) дана характеристика ЛРС, сырья животного происхождения и грибов как ФСРП в составе лекарственных средств. Приведены современные требования к качеству ЛРС как ФСРП. Показаны основные направления развития микроскопического метода, как одного из основных методов фармакогностического анализа. Вторая глава посвящена описанию и характеристике объектов и методов исследования. В экспериментах использовано ЛРС, реактивы и оборудование, отвечающее требованиям нормативной документации. Третья глава содержит результаты сравнительного экспериментального микроскопического изучения 90 видов цельного и измельченного ЛРС 7 морфологических групп и 5 видов сырья животного происхождения и грибов, предложены методы пробоподготовки, выявлены и охарактеризованы маркеры анатомического строения, приведены результаты

микрохимического и гистохимического исследования. В четвертой главе отражены результаты изучения влияния таких факторов как размер частиц, способ измельчения, специфическая обработка сырья на вариабельность и визуализацию анатомо-диагностических признаков ЛРС. В пятой главе приведены результаты исследований по разработке методик пробоподготовки и микроскопических характеристик подлинности ЛРС (в том числе сырья животного происхождения и грибов) в 5 видах монокомпонентных и 11 видах многокомпонентных растительных средств.

Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 51 печатная работа, из них 13 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Значительная часть материалов диссертации нашла отражение в пособии: Фармакогнозия. Атлас: учебное пособие // Самылина И.А., Ермакова В.А., Бобкова Н.В., Аносова О.Г. – Т.3. – М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2009. – 488 с.

Современные требования к качеству лекарственного растительного сырья (ЛРС) как фармацевтической субстанции растительного происхождения (ФСРП)

Резонно предположить, что анатомо-диагностическая картина ЛРС, полученного подобным образом, может иметь свои особенности и отличаться от обычного сырья при проведении его микроскопической диагностики. Однако исследований посвященных этому вопросу в доступной нам литературе выявлено не было.

Многокомпонентные прописи на основе ЛРС являются традиционной формой тибетской и китайской медицины. Известно более 400 видов растений, относящихся к флорам Индии, Китая, Монголии, Восточной Сибири, веками используемых народными целителями стран Центральной Азии [12, 31, 32, 72, 144, 186]. Лекарственные средства тибетской медицины представляют собой сложные смеси. В рецепты входят 10-20 и более объектов, существуют и более сложные составы, содержащие 40-60 ингредиентов, более редки рецепты из 2-4 компонентов [21, 31]. Использование столь сложных комплексов - это результат осуществления принципа лечения не отдельных симтомов болезни, а повышения защитных сил организма за счет улучшения обменных процессов и иммунобиологической сопротивляемости [21, 70]. Активным сторонником придания тибетской медицине статуса официального в России был врач П.А. Бадмаев [15, 46]. После революции большой вклад в изучение лекарственных растений восточной медицины внесла профессор Ленинградского химико-фармацевтического института А.Ф. Гаммерман и ее ученики [21, 31, 32]. В настоящее время систематические исследования в области тибетского лекарствоведения проводят сотрудники Бурятского научного центра Сибирского отделения Российской академии наук [17, 118, 119, 126, 135, 143, 144], в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова изучаются перспективы медицинского использования растительных ресурсов республики Тыва [62, 130, 188].

Направление в фармации по созданию и применению лекарственных препаратов на основе нативного сырья в последние годы активно развивается, и не только в России, но и в странах ближнего и дальнего зарубежья. Известны исследования белорусских ученых по созданию капсулированного порошка травы пустырника и листьев боярышника [36, 148], на Украине – многокомпонентного гранулированного препарата слабительного действия на основе порошков листьев сенны узколистной, стевии обыкновенной, овса посевного и отрубей пшеничных [161]. В России и Узбекистане – по созданию таблетированных луковиц чеснока [123]. В Грузии – мелкодисперсного порошка плодов шиповника [44].

В России в 2015 году зарегистрирован лекарственный препарат на основе травы пустырника с пиридоксином и аспаргинатом натрия, представляющий собой таблетки, покрытые оболочкой [38].

Ведутся работы и по совершенствованию технологического процесса производства давно используемого комплексного препарата Аллохол, который в качестве ФСРП включает порошок листьев крапивы и луковиц чеснока. В Самарском ГМУ - исследования по совершенствованию стандартизации БАВ в лекарственных формах из корней женьшеня, в том числе таблеток из измельченного сырья [87, 165].

Анализ патентной документации выявил большой интерес к созданию лекарственных препаратов и БАДов на основе измельченного ЛРС и композиций из него в форме парентеральных порошков, таблеток капсул и драже для лечения и профилактики сердечнососудистых, паразитарных заболеваний, расстройствах гепато-билиарной и нервной систем, а также для реабилитации в онкологии, наркологии, диетологии, геронтологии [7, 8, 9, 10, 11, 18, 19, 20, 95, 96, 112, 145, 146, 164, 174].

Введение растительных порошков в состав лекарственных средств – одно из современных направлений фармацевтического производства, положительными сторонами которого является взаимодополняющее действие всего спектра БАВ растительного сырья и, что не маловажно, рациональное использование растительных ресурсов – без шрота и отходов.

В этом направлении ведутся исследования по изучению теоретических основ и практического использования различных методов деструкции растительного сырья, технологических характеристик тонко измельченных растительных субстанций и научные основы их таблетирования [60, 81, 107, 127, 181].

В работах Меретукова З.А. изучаются вопросы влияния экструзии и криотехнологии на процесс измельчения растительных объектов [66, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 104, 105, 147]; у Хишовой О.М. и коллег на примере различных видов растительных порошков - их технологические и биофармацевтические характеристики (скорость и полнота экстрагирования в среду желудочно-кишечного тракта) [177, 178, 179, 180].

Измельчение, капсулирование и таблетирование - важные стадии в технологии производства лекарственных препаратов на основе порошкованного ЛРС. Изучались химические, микробиологические, различные технологические свойства измельченных различными способами порошков [42, 52, 82, 83, 84, 85], тогда как важнейшая характеристика -микроскопическая диагностируемость и вариабельность анатомо-диагностических признаков для них не исследовалась.

Важно оценить влияние этих процессов на микроскопическую диагностику подвергшегося обработке ЛРС и лекарственных средств на его основе.

Стандартизации ЛРС и ФСРП в Государственной фармакопее РФ 13 издания посвящен специализированный раздел «Лекарственное растительное сырье, фармацевтические субстанции растительного происхождения, лекарственные растительные препараты и методы их анализа», состоящий из 23 Общих фармакопейных статей (ОФС), а также 5 ОФС, в которых изложены требования к качеству лекарственных форм из ЛРС («Настои и отвары», «Настойки», Сборы», «Экстракты», «Гранулы резано-прессованные») [40, 124, 166].

Разработчиками и составителями были максимально полно учтены все современные тенденции развития фармакогнозии и смежных дисциплин, прежний опыт отечественных и действующих фармакопей ближнего и дальнего зарубежья, рекомендации ведущих специалистов по вопросам контроля качества растительного сырья, современных методов анализа, совершенствованию таких традиционных методов диагностики как микроскопический анализ и др. [140, 141, 149, 150, 151, 152].

Микроскопическому анализу посвящали свои исследования такие выдающиеся российские фармакогносты как Гаммерман А.Ф., Ладыгина Е.Я. [33, 34, 171], продолжателями традиций являются Самылина И.А., Ермакова В.А. [58, 137, 138, 139, 149]. К новому поколению фармакогностов-микроскопистов можно отнести Потанину О.Г. Все они внесли свой вклад в совершенствование и развитие микроскопического анализа лекарственного растительного сырья.

Микроскопический метод анализа, являясь старейшим и классическим методом определения подлинности ЛРС и ЛРП, не утратил своего значения и по сей день. Во все ведущие современные фармакопеи включены общие фармакопейные статьи,

регламентирующие микроскопический метод, а в частные – микроскопические характеристики подлинности ЛРС [39, 40, 49, 172, 198, 214, 221].

Государственной фармакопеи РФ 13 издания актуализировала все основные требования к качеству современных растительных препаратов, представляющих собой, как правило, измельченное, порошкованное ЛРС, а также сборы. В ГФ РФ 13 издания впервые была включена ОФС на новую лекарственную форму «Гранулы резано-прессованные» [40, 63, 170].

Пория кокосовидная

Для побегов туи свежих, травы лаконоса свежей, травы эфедры готовили микропрепараты поперечных срезов стеблей и побегов, а также препарат эпидермиса побегов и стебля с поверхности.

Для сочных плодов (рябины обыкновенной, аронии черноплодной, черники обыкновенной, жостера слабительного, лимонника китайского) готовили микропрепараты: экзокарпия с поверхности, мезокарпия «давленный» препарат, семенной кожуры с поверхности.

Исследование внешних признаков сырья животного происхождения и грибов проводили в соответствии со статьей «Методы анализа лекарственного растительного сырья» (ГФ ХI изд., вып.1, с.256). Сырье исследовали невооруженным глазом, с помощью лупы (10х) или стереомикроскопа (8х, 16х).

Микроскопическое исследование сырья животного происхождения и грибов. В анализе грибов целесообразно использовать цельное сырье (делают срезы) или сырье с размером частиц менее 1 мм. Более крупные фрагменты мало пригодны для микроскопического исследования (получаются темные и толстые препараты).

Для приготовления микропрепаратов грибов использовалась фармакопейная методика общей статьи ГФ XI "Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья" для порошков [169]. Однако более качественные микропрепараты были получены согласно методике, разработанной и апробированной нами в предыдущих исследованиях [24]:

Около 0,1 г порошка помещали в химический стакан на 50 мл, приливали 5-10 мл 1 или 2,5 %-ного раствора NaOH и кипятили в течение 30-60 секунд, после чего порошок дробно промывали 100-150 мл дистиллированной воды методом декантации при условии практически полного осаждения частиц сырья. Последний раз воду осторожно сливали, лопаточкой или скальпелем порошок переносили в каплю включающей жидкости (раствор глицерина (1:1) или раствор хлоралгидрата), накрывали покровным стеклом, слегка надавливали на него обратной стороной препаравальной иглы для равномерного распределения жидкости под стеклом и рассматривали под микроскопом.

Микроперапараты порошка бадяги готовили по следующей методике: несколько кусочков сырья (размером 3-5 мм) или около 0,1 г порошка помещают в химический стакан на 50 мл, приливают 10 мл 2,5 % раствора NaOH и кипятят в течение 1 минуты. Затем 3-4 раза промывают дистиллированной водой методом декантации до исчезновения окраски жидкости (при промывании порошка необходимо добиваться его полного осаждения). Кусочек просветленного сырья или порошка помещают в каплю включающей жидкости (глицерин-вода (1:1) или раствор хлоралгидрата), накрывают покровным стеклом, слегка надавливают на него обратной стороной препаравальной иглы и исследуют под микроскопом.

Для приготовления микропрепаратов порошка грудного щита сепии использовалась фармакопейная методика ОФС ГФ XI "Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья" для порошков [169]. Однако более качественные микропрепараты были получены согласно методике, разработанной и апробированной нами в предыдущих исследованиях [24]:

Около 0,1 г порошка помещали в химический стакан на 50 мл, приливали 5-10 мл 1 или 2,5 %-ного раствора NaOH и кипятили в течение 30-60 секунд, после чего порошок дробно промывали 100-150 мл дистиллированной воды методом декантации при условии практически полного осаждения частиц сырья. Последний раз воду осторожно сливали, лопаточкой или скальпелем порошок переносили в каплю включающей жидкости (раствор глицерина (1:1) или раствор хлоралгидрата), накрывали покровным стеклом, слегка надавливали на него обратной стороной препаравальной иглы для равномерного распределения жидкости под стеклом и рассматривали под микроскопом.

Проводились гистохимические и микрохимические реакции на запасные полисахариды (слизь, крахмал, инулин, целлюлозу, гликоген), одревесневшие (лигнифицированные) элементы, липофильные вещества (эфирное и жироное масло), дубильные вещества (гидролизуемые и конденсированные).

Использовали следующие реактивы: глицерин (чда, ГОСТ 6259-75), раствор Люголя специальный, для гистологических работ, кислота хлористоводородная (ГОСТ 14261-77), натрия гидроксид гранулированный (хч, ГОСТ 4328-77 изм. 1,2), флороглюцин (CAS № 108-73-6, ТУ 6-09-3741-79), Судан III 0,3% раствор (чда, ТУ 609323478), П-нафтола спиртовой раствор 20%, серная кислота концентрированная, серной кислоты раствор 25%, хлоралгидрата раствор.

Характеристика биометрических параметров оценивалась по абсолютной величине признаков и частоте их встречаемости на единицу площади. Измерения проводились с помощью окуляр-микрометра.

Статистическую достоверность влияния размера частиц ЛРС на его диагностичность оценивали методом дисперсионного анализа для однофакторных комплексов.

Микроскопические исследования проводились на микроскопах: БИОЛАМ-С11, МБИ-6 (окуляры х7, х15, объективы х8, х40), «ЛОМО МИКМЕД - 1» (окуляр 7х и объективы: 3,7х, 10х, 20х, 40х), «МИКМЕД - 6» (окуляр 10х и объективы: 4х, 10х, 40х, 100х); фотосъемка - с использованием пленочной фотонасадки (фотопленки "Тасма", "Свема" (ФН-32, ФН-64, "Микрат-орто"), Kodak Gold 100) и цифровой фотокамеры Canon Digital IXUS 80 IS; обработка снимков проводилась с использованием программы Microsoft Office Picture Manager.

Включение в состав комплексных лекарственных средств сырья природного происхождения предполагает наличие достоверных способов оценки подлинности и постоянства состава подобных препаратов. Доступным и надежным методом стандартизации растительного сырья и препаратов на его основе является микроскопический анализ. Он позволяет дифференцировать сырье от растительных экстрактов, смол, компонентов иного происхождения (животного, минерального); а также доказать наличие тех или иных морфологический групп сырья, и при наличии высоко специфичных диагностических признаков – биологических маркеров - подтвердить присутствие в препарате отдельных компонентов.

Использование в медицине сырья природного происхождения не ограничивается только растительными объектами. И в европейской, а особенно в восточной медицине находят применение грибы и животные организмы. Характеристики подлинности подобного сырья, безусловно, должны присутствовать в нормативной документации, несмотря на определенные особенности и трудности проведения микроскопического анализа. Микроскопическая идентификация сырья животного и грибного происхождения многократно возрастает в случае включения его в многокомпонентные лекарственные средства.

В настоящее время микроскопическая идентификация актуальна и для идентификации сырья в так называемых курительных смесях («спайсах») при проведении судебно-биологической экспертизы.

Сравнительный анатомический анализ растительных порошков, полученных традиционным способом и с использованием криотехнологии

Для определения основных биологических маркеров микроскопической идентификации 5 видов цветков различной измельченности были использованы материалы собственных исследований, научных публикаций и нормативные документы [40, 151]. Результаты представлены в таблице 12 и документально подтверждены фотоиллюстрациями, часть из которых представлена в работе, остальные опубликованы в печатных трудах [152].

Вариабельность микроскопических биологических маркеров ЛРС морфологической группы «цветки» Название ЛРС Биологические маркеры (специфические анатомо-диагностические признаки) ЛРС

Цветки ромашки Нижний эпидермис язычковых и трубчатых цветков состоит из удлиненных клеток с извилистыми стенками; верхний – с сосочковидными выростами; в мезофилле трубчатых и язычковых цветков - мелкие друзы оксалата кальция; эпидермис листочков обвертки со складчатой кутикулой и состоит из клеток с извилистыми тонкими стенками, устьичный комплекс аномоцитного типа; у листочков обвертки под эпидермисом виден слой механических клеток -склереид с толстыми пористыми стенками, вдоль центральной жилки -секреторный ходы с коричневато-желтым маслянистым содержимым; на поверхности язычковых, трубчатых цветков и листочков обертки видны эфирномасличные железки, состоящие из 6-8 клеток, расположенных в 2 ряда и в 3-4 яруса, сверху они видны в виде овальных образований с поперечной перегородкой (длиной 20-60 мкм) Дополнительное диагностическое значение приобретают фрагменты цветоложа, состоящие из крупных тонкостенных клеток с густой разветвленной сетью проводящих пучков; эпидермис цветоножки и листьев с удлиненными клетками, простыми волосками (длина 58-160 мкм) с многоклеточной ножкой и одноклеточной удлиненной головкой; фрагменты покровной ткани незрелых семянок с эпидермисом из тонкостенных клеток и мезокарпием из удлиненных клеток с толстыми извилистыми стенками; многочисленные круглые пыльцевые зерна с шиповатой экзиной и тремя порами

Цветки календулы Эпидермис язычковых цветков состоит из вытянутых тонкостенных клеток с заостренными или прямыми поперечными стенками и многочисленными оранжевыми хромопластами; кутикула имеет четко выраженную продольную складчатость; эпидермис трубчатых цветков состоит из удлиненных клеток Дополнительное диагностическое значение приобретают эпидермис цветоножки и цветоложа с простыми и головчатыми волосками с 4-, 8-клеточной головкой на многоклеточной двурядной ножке или места их прикрепления; обломки тычиночных нитей, состоящих из Цветки бессмертника с прямыми или слабоизвилистыми стенками; продолговатые эпидермальные клетки на верхушке венчика имеют сосочковидные выросты; основания язычковых цветков опушены простыми многоклеточными двурядными волосками (дина до 1100 мкм); основания трубчатых цветков опушены короткими головчатыми волосками с 8-клеточными железистыми головками на многоклеточных двурядных ножках длина до 416 мкм); в мезофилле мелкие друзы оксалата кальция (диаметр около 6 мкм); эпидермис листочков обвертки состоит из клеток со слабоизвилистыми или прямыми клеточными стенками, устьичный комплекс аномоцитного типа; опушен волосками: простыми многоклеточными одно-, двурядными, иногда с длинной терминальной клеткой со спавшимися стенками; разнообразными ветвистыми волосками, представляющими собой сросшиеся основаниями простые и железистые волоски; головчатыми волосками с 2-, 4-, 8-клеточными железистыми головками на многоклеточных одно-, двурядных ножках Эпидермис листочков обвертки состоит из удлиненных веретеновидных клеток: тонкостенных по краю и толстостенных, с пористыми стенками центральной части. У основания листочки обвертки опушены бичевидными волосками с несколькими короткими базальными и длинной терминальной клетками (длиной до 4500 мкм) и головчатыми железистыми волосками длиной около 120 мкм (овальная одноклеточная головка на короткой 8-14-клеточной двурядной ножке). Завязь трубчатых цветков имеет кольцеобразное основание, гладкую или покрытую многочисленными вздутыми волосками поверхность, хохолок из щетинистых волосков. Зубчики венчика имеют выросты эпидермиса по краю и практически квадратных клеток с утолщенными стенками; округло треугольные шиповатые трехпоровые пыльцевые зерна диаметром около 50 мкм (рис. 7). Дополнительное диагностическое значение приобретают: эпидермис цветоносов и стебля, фрагменты пыльниковых трубок тычинок цветка, пыльцевые зерна (рис. 7). Эпидермис цветоносов и стебля обильно опушен простыми бичевидными и железистыми волосками на многоклеточной двурядной ножке с одно-, многоклеточной головкой (длиной до 460 мкм). Пыльцевые зерна округло трехгранные, шиповатые около 30 мкм. опушены железистыми волосками, в мезофилле - оранжево-желтые хромопласты с каротиноидами. 4. Цветки пижмы Эпидермис трубчатых цветков, состоящий из клеток с прямыми или слабоизвилистыми, иногда четковидно утолщенными стенками, с желтоватыми округлыми хромопластами на верхушке венчика; эфирномасличные железки, состоящие из 4-6 клеток, расположенных в 2 ряда и 3-4 яруса; в мезофилле -многочисленные друзы оксалата кальция размером 2-6 мкм, сосредоточенными обычно в местах срастания лепестков и на границе венчика и завязи; листочки обвертки с секреторными ходами вдоль центральной жилки, с крупными почти прямостенными и с узкими сильно вытянутыми эпидермальными клетками иногда с заметной складчатой кутикулой, устьицами аномоцитного типа и бичевидными волосками, встречающимися по центральной жилке или по краю листочков обвертки (встречаемость 0-13 на мм2) Дополнительное диагностическое значение приобретают: эпидермис цветоносов и стебля, цветоложа и пыльцевые зерна. Клетки эпидермиса цветоносов и стебля вытянутые, прямоугольные, устьица аномоцитного типа, характерные железки и бичевидные волоски с частотой встречаемости 0-35 на мм2.Пыльцевые зерна округлые, шиповатые, трехпоровые диаметром около 30 мкм.

Комплексные многокомпонентные препараты с растительными порошками

Как видно из таблицы 14, в морфологических группах «плоды» и семена» имеет место вариабельность анатомо-диагностических признаков в цельном сырье и порошке (измельчение как таковое в плодах практически не используется).

В плодах изменчивость зависит от типа околоплодника. В сочных плодах диагностически значимыми будут не только фрагменты экзокарпия с характерными формой клеток, трихомами, хромопластами, не только клетки мезокарпия с включениями оксалата кальция и механическими элементами, но и строение эндокарпия, семенной кожуры и клетки эндосперма.

Порошок плодов с сухим околоплодником будет характеризоваться наличием участков экзокарпия, мезокарпия и эндокарпия в продольном сечении, в отличие от цельных плодов, из которых готовят поперечные срезы.

Вариабельность признаков у соплодий хмеля показала схожие закономерности с морфологическими группами «листья» и «травы», так как основную часть в соплодиях (или шишках) хмеля составляют чешуи, которые имеют листовое происхождение.

В порошках семян анатомо-диагностическая картина также будет отличаться от цельного сырья сечением признаков, обусловленным техникой приготовления микропрепаратов – поперечный срез и давленный препарат.

Для определения основных биологических маркеров микроскопической идентификации 3 видов кор различной измельченности были использованы материалы собственных исследований, научных публикаций и нормативные документы [40, 115, 151, 196, 198, 214, 220]. Результаты представлены в таблице 15 и документально подтверждены фотоиллюстрациями, часть из которых представлена в работе, остальные опубликованы в печатных трудах [152].

Название ЛРС Биологические маркеры (специфические анатомо-диагностические признаки) ЛРС

Кора дуба На поперечном срезе виден серо-коричневый слой пробки, состоящий из нескольких слоев прямоугольных клеток, под ней – несколько слоев пластинчатой колленхимы. В первичной коре располагается механический пояс – тангентальное скопление чередующихся групп механических В «давленных препаратах» измельченного сырья и порошке встречаются фрагменты коровой паренхимы, пробки и волокнистых пучков, а также групп каменистых клеток, отличающихся лишь размерами.Коровая паренхима представляет собой комплекс клеток прямоугольной и округлой формы, в которых одиночно или группами встречаются друзы оксалата кальция, значительно реже - призматические волокон и каменистых клеток, встречаются и отдельные группы каменистых клеток диаметром около 50 мкм.Во вторичной коре располагаются многочисленные группы лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой (рис. 23А), образующие параллельные слои, через которые радиально проходят преимущественно однорядные сердцевинные лучи. Клетки паренхимы и первичной и вторичной коры содержат друзы оксалата кальция диаметром 8-25 мкм и флобафены в виде буроватого содержимого. кристаллы. В паренхиме коры можно наблюдать клетки-идиобласты с коричневым содержимым (флобафенами). Волокнистые пучки состоят из толстостенных волокон, окруженных кристаллоносной обкладкой, кристаллы в которой имеют форму призм с неравными гранями (рис. 23Б). В пучках встречаются небольшие островки округлых паренхимных клеток однорядных серцевинных лучей. Кроме того, в порошке присутствуют многочисленные группы каменистых клеток желтоватого цвета, представляющие собой прочные конгломераты склереид округлой или неправильной формы размером около 50 мкм с сильно утолщенными пористыми клеточными стенками. Иногда скопления каменистых клеток прикреплены к волокнистым пучкам и могут быть окружены призматическими кристаллами оксалата кальция. В поле зрения микроскопа видны также коричневые, практически непросветляющиеся кусочки пробки, на расслоившихся участках которых различимы составляющие их изодиаметричные полигональные клетки.

Кора крушины На поперечном срезе виден красно-бурый слой пробки, под ней – несколько слоев пластинчатой колленхимы. В первичной коре клетки паренхимы крупнее, друзы оксалата кальция многочисленнее, чем во вторичной; там же могут располагаться одиночные или небольшие скопления механических волокон со слабо утолщенными стенками. Сердцевинные лучи 1-2-рядные, часто проходящие сквозь группы лубяных волокон. Диаметр друз оксалата кальция варьирует от 4 до 25 мкм. Анатомо-диагностическая картина «давленных препаратов» измельченного сырья и порошка практически идентична и состоит из фрагментов коровой паренхимы, пробки и механических волокон, отличающихся лишь размерами.Клетки первичной коры более крупные, почти прямоугольной формы, без межклетников, с неравномерноутолщенными клеточными стенками. Фрагменты вторичной коры отличаются наличием остатков серцевинных лучей (одно-, двурядных), клетки которых в очертании округлые, с межклетниками. В клетках вторичной и первичной коры встречаются друзы оксалата кальция, расположенные одиночно или в виде цепочек; фрагменты групп лубяных волокон с толстыми одревесневшими оболочками, окруженные кристаллоносной обкладкой. Кристаллы оксалата кальция в обкладке имеют преимущественно кубическую форму. В наиболее толстых пучках лубяных волокон видны группы округлых паренхимных клеток 1-2 рядных серцевинных лучей, имеющих веретеновидную форму. Встречаются также одиночные волокна и фрагменты многослойной пробки красно-коричневого цвета.

Кора корицы На поперечном срезе виден буровато-коричневый неширокий слой пробки, состоящей из прямостенных, слегка вытянутых в тангентальном направлении клеток прямоугольной формы с утолщенными стенками; слой колленхимы узкий окрашен в красновато коричневый цвет. Клетки наружной коры несколько тангентально вытянуты с красновато-коричневыми стенками обильно заполнены крахмальными зернами округлой формы (5-10 мкм). Среди клеток коровой Анатомо-диагностические признаки измельченного сырья и порошка в микропрепаратах находятся в продольном сечении и отличаются только размером частиц.В поле зрения микроскопа видны: участки коровой паренхимы коричневатого цвета, состоящие из прямоугольных, плотно прилегающих друг к другу клеток, иногда с мелкими игольчатыми кристаллами оксалата кальция и крупными эфирномасличными клетками; фрагменты лубяных волокон одиночных и группами с пористым вторичным утолщением клеточных стенок; каменистые клетки: крупные (d=50-70 мкм) округлые или слегка вытянутые с толстыми пористыми стенками, одиночные или в группах по 2-3 и мелкие (d=20 мкм), расположенные паренхимы встречаются идиобласты, содержащие капли эфирного масла, клетки-идиобласты со слизью и изредка с рафидами оксалата кальция. Некоторые клетки наружной и внутренней коры содержат флабофены и окрашены в красновато-коричневый цвет. Ближе к центру располагается механический пояс, сотоящий из групп склеренхимных волокон и каменистых клеток. Каменистые клетки вытянуты в тангентальном направлении, стенки их утолщены и пронизаны многочисленными порами. Во внутренней коре видны 2-х и 3-хрядные сердцевинные лучи. группами с тонкими пористыми стенками; крупные волокна веретеновидной формы с толстыми пористыми стенками, узкой полостью и неровным контуром длиной до 300 мкм.