Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Анализ литературы по ботанической характеристике, химическому составу и применению хондриллы ситниковидной в народной медицине 15
1.1 Краткая ботаническая характеристика хондриллы ситниковидно.. 15
1.2 Химический состав хондриллы ситниковидной 18
1.3Фармакологические свойства и применение хондриллы ситниковидной в народной медицине
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 27
2.1 Объекты исследования 27
2.2 Исследования биологически активных веществ 28
2.2.1 Приготовление гексановых извлечений 28
2.2.2 Анализ каротиноидов 28
2.2.3 Исследование липофильной фракции 29
2.2.4 Анализ сесквитерпеновых лактонов 30
2.2.5 Анализ жирных кислот 31
2.2.6 Приготовление спирто-водного извлечения и разделение природных соединений 32
2.2.7 Анализ кумаринов 33
2.2.8 Анализ фенолкарбоновых кислот 33
2.2.9 Анализ флавоноидов
2.2.10 Исследование методом ВЭЖХ фенольных соединений 36
2.2.11 Приготовление и исследование водных фракций 37
2.2.12 Анализ углеводных производных 37
2.2.13 Анализ азотсодержащих соединений 38
2.2.13.1 Анализ азотистых оснований 38
2.2.13.2 Анализ аминокислот
2.2.14 Анализ дубильных веществ 40
2.2.15 Анализ органических кислот 40
2.2.16 Анализ тритерпеновых соединений 42
2.2.17 Минеральный состав хондриллы ситниковидной 44
2.3 Изучение углеводов 44
2.3.1 Выделение углеводов по фракциям 44
2.3.2 Проведение кислотного гидролиза 46
2.3.3 Проведение хроматографического анализа 47
2.3.4 Анализ моносахаридного состава фракций полисахаридов 47
2.3.5 Анализ функциональных групп пектинов 49
2.4 Определение показателей качества сырья хондриллы
ситниковидной 50
2.4.1 Определение влажности 50
2.4.2 Определение золы 51
2.4.3 Определение экстрактивных веществ 51
2.5 Изучение морфолого-анатомического строения 51
2.6 Фармакологический скрининг 52
2.6.1 Определение острой токсичности 52
2.6.2 Определение отхаркивающего действия 53
2.6.3 Определение противовоспалительной активности 54
2.6.4 Определение антиоксидантной активности 56
2.6.5 Определение антимикробной активности 57
2.7 Результаты статистической обработки 58
ГЛАВА 3 Результы изучения качественного состава и количественного содержания групп биологически активных веществ хондриллы ситниковидной 59
3.1 Исследование гексанового извлечения 59
3.1.1 Качественное и количественное определение каротиноидов 59
3.1.2 Исследование липофильной фракции
3.2 Результаты анализа сесквитерпеновых лактонов 64
3.3 Результаты анализа жирных кислот 65
3.4 Результаты анализа кумаринов 67
3.5 Результаты анализа фенолкарбоновых кислот 68
3.6 Результаты анализа флавоноидов 69
3.7 Результаты исследования методом ВЭЖХ фенольных соединений... 71
3.8 Результаты анализа углеводных производных
3.8.1 Результаты анализа свободных сахаров 72
3.8.2 Результаты анализа связанных сахаров 72
3.9 Результаты анализа азотсодержащих соединений 73
3.9.1 Результаты анализа азотистых оснований 73
3.9.2 Результаты анализа аминокислот
3.10 Результаты анализа дубильных веществ 76
3.11 Результаты анализа органических кислот 77
3.12 Результаты анализа тритерпеновых соединений 78
3.13 Результаты анализа минерального состава хондриллы ситниковидной 79
3.14 Изучение углеводов 81
3.14.1. Выделение углеводов по фракциям 81
3.14.2 Анализ моносахаридного состава фракций полисахаридов 82
3.14.3 Определение количественного содержания моносахаров во фракциях полисахаридов 85
3.14.4 Исследование функциональных групп пектиновых веществ 86 хондриллы ситниковидной
ГЛАВА 4 Результаты по определению подлинности и показателей качества травы хондриллы ситниковидной 91
4.1 Определение подлинности сырья 91
4.1.1. Определение морфологических признаков травы хондриллы ситниковидной 91
4.1.2 Определение микродиагностических признаков травы хондриллы ситниковидной 92
4.2 Установление числовых показателей 100
4.2.1 Результаты определения влажности 100
4.2.2 Результаты определения золы 101
4.2.3 Результаты определения экстрактивных веществ 102
4.3 Определение содержания суммы фенольных соединений 102
4.3.1 Результаты по разработке методики содержания фенольных соединений 103
4.3.2 Методика количественного определения суммы фенольных соединений 106
4.3.3 Валидация методики определения фенольных соединений в траве хондриллы ситниковидной 107
4.3.4 Содержание суммы фенольных соединений в траве хондриллы ситниковидной
4.4 Установление сроков заготовки сырья 113
4.4.1 Определение сроков годности сырья хондриллы ситниковидной. 113
4.5 Разработка проекта ФСП «Хондриллы ситниковидной трава» 114
ГЛАВА 5 Изучение фармакологической активности и стандартизация настоя травы хондриллы ситниковидной 121
5.1 Результаты определения острой токсичности 121
5.2 Результаты определения отхаркивающей активности 122
5.3 Результаты определения противовоспалительной активности 123
5.4 Результаты определения антиоксидантной активности 126
5.5 Результаты определения антимикробной активности 128 5.6 Стандартизация настоев травы хондриллы ситниковидной 130
Общие выводы 134
Список литературы
- Химический состав хондриллы ситниковидной
- Приготовление спирто-водного извлечения и разделение природных соединений
- Результаты анализа углеводных производных
- Установление числовых показателей
Введение к работе
Актуальность темы. На международном фармацевтическом рынке
наблюдается рост ассортимента препаратов растительного происхождения.
Поэтому по-прежнему актуальным является исследование малоизученных
растений отечественной флоры с целью использования их в качестве источника
растительного сырья и создания на их основе лекарственных препаратов.
Перспективными объектами для изучения являются растения семейства
Астровые (Asteraceae), содержащие в своем составе целый ряд биологически
активных веществ, в том числе фенольные соединения и полисахариды и
использующиеся как в научной, так и в народной медицине. Среди таких
растений научный и практический интерес представляет хондрилла
ситниковидная, широко распространенная в Черноземных областях России.
Основными биологически активными веществами хондриллы ситниковидной
по данным зарубежных ученых являются сесквитерпеновые лактоны и
фенольные соединения (фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, кумарины).
Известно, что фенольные соединения обладают различными видами
биологической активности: противовоспалительной, антибактериальной, а
также проявляют антиоксидантные свойства. При исследовании 27
дикорастущих растений, произрастающих в южной Италии на наличие
антиоксидантной активности установлена высокая ксантинооксидазная
ингибирующая активность экстракта из надземной части хондриллы (Pieroni A.,
2002), что может быть предпосылкой для использования хондриллы
ситниковидной в качестве антиоксиданта. Несмотря на это, химический состав
ее изучен недостаточно, не выявлены действующие вещества, нет методик
качественного и количественного определения действующих веществ. В
литературе не имеется данных по морфолого-анатомическому изучению
хондриллы ситниковидной, что не позволяет определить подлинность е сырья.
В связи с этим фармакогностическое изучение надземной части
хондриллы ситниковидной как нового источника растительного сырья,
обладающего антиоксидантной, противовоспалительной и другими видами активности является актуальным.
Степень разработанности темы исследования. Зарубежными учеными
при проведении хемосистематических исследований в надземной части
хондриллы ситниковидной установлено наличие сесквитерпеновых лактонов и
фенольных соединений: фенолкарбоновых кислот - хлорогеновой,
изохлорогеновой, кофейной, кофеилвинной, протокатеховой, изоферуловой; флавоноидов - лютеолина, 7-гликозид лютеолина, 7-галактозил глюкуронид лютеолина, 3-галактозид кверцетина; кумаринов - эскулетина, цихориина. Имеются публикации зарубежных авторов о наличии в плодах и молодых побегах с листьями высших жирных кислот, некоторых минеральных элементов и витаминов. Другие классы биологически активных веществ надземной части хондриллы ситниковидной практически не изучены. Исследована ксантинооксидазная активность экстракта из надземной части хондриллы ситниковидной. В России изучение химического состава хондриллы ситниковидной не проводилось, так же как и не проводилось комплексного фармакогностического исследования.
Цель и задачи исследования. Цель работы - фармакогностическое изучение травы хондриллы ситниковидной, произрастающей на территории Центрально-Черноземных областей России, разработка диагностики и стандартизации сырья.
Задачи исследования:
-
Изучить состав биологически активных веществ травы хондриллы ситниковидной;
-
Изучить качественный и количественный состав фенольных соединений;
-
Выделить и исследовать полисахаридные комплексы;
-
Провести морфолого-анатомические исследования надземной части хондриллы ситниковидной с целью выявления диагностических признаков сырья;
-
Провести разработку методики количественного определения суммы фенольных соединений в траве хондриллы ситниковидной и в настое, полученном из нее;
-
Изучить динамику накопления фенольных соединений в зависимости от фазы вегетации растения, установить сроки годности сырья;
-
Разработать показатели качества нового источника растительного сырья и проект нормативной документации на траву хондриллы ситниковидной;
-
Провести фармакологический скрининг (изучить отхаркивающую, противовоспалительную, антиоксидантную и антимикробную активности).
Научная новизна. Изучен состав травы хондриллы ситниковидной, произрастающей на территории областей Центрального Черноземья на содержание различных групп биологически активных веществ: каротиноидов, сесквитерпеновых лактонов, жирных кислот, фенольных соединений, углеводов, органических кислот, тритерпеновых соединений, минеральных элементов. Методом эмиссионного спектрального анализа установлено наличие 16 минеральных элементов, отмечено высокое содержание калия, кальция, кремния, фосфора, магния.
Впервые изучен аминокислотный и углеводный состав растения.
Качественный и количественный состав аминокислот изучен методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Суммарное
содержание аминокислот составило 20,12 мг%, преобладающими среди них
были глутаминовая кислота и пролин. Углеводный состав исследован
фракционно: водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые
вещества, гемицеллюлоза А и Б. В состав водорастворимого полисахаридного
комплекса входят арабиноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, рамноза,
глюкуроновая и галактуроновая кислота. Основу пектиновых веществ составляет галактуроновая кислота, преобладающими среди гемицеллюлоз являются галактоза и глюкоза.
Фенольные соединения травы хондриллы ситниковидной исследованы с помощью различных методов хроматографии (тонкослойной, бумажной, газожидкостной-хромато-масс- спектрометрии, ВЭЖХ).
Идентифицировано 20 веществ фенольной природы, из них впервые 17:
кумарины – умбеллиферон, кумарин, скополетин; флавоноиды –
дегидрокверцетин, рутин, катехин; производные дубильных веществ – эпигаллокатехингаллат; фенолкарбоновые кислоты – галловая, цикориевая, феруловая, коричная, фенилуксусная, салициловая, ванилиновая, п-кумаровая, сиреневая, гентизиновая кислоты.
Впервые изучены органические кислоты методами газо-жидкостной хромато-масс-спектрометрии и ВЭЖХ, установлено наличие 10 органических кислот, преобладающими среди которых являются левулиновая, лимонная и яблочная кислоты.
Впервые исследовали морфологические и микродиагностические признаки надземной части (стебля, листа, цветка, обертки) хондриллы ситниковидной, позволяющие установить подлинность сырья.
Показана возможность стандартизации травы хондриллы ситниковидной по содержанию фенольных соединений. Установлены условия количественной экстракции фенольных соединений из сырья и динамика накопления суммы фенольных соединений в зависимости от фазы вегетации.
Фармакологический скрининг показал наличие у настоя хондриллы ситниковидной отхаркивающей, антибактериальной и противовоспалительной активностей. Определена антиоксидантная активность водных и водно-спиртовых извлечений, установлена зависимость антиоксидантной активности от содержания фенольных соединений.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость заключается в расширении сведений о химическом составе травы хондриллы ситниковидной, ее морфологических и микродиагностических признаках. Результаты фармакологического скрининга могут явиться первым экспериментальным обоснованием для использования в научной медицине нового вида сырья – травы хондриллы ситниковидной и разработки на ее основе лекарственных препаратов.
Разработана, апробирована и внедрена методика количественного
определения суммы гидроксикоричных кислот (акт внедрения в работу ОКК
ЗАО фирма «Здоровье»). Разработаны показатели подлинности травы
хондриллы ситниковидной (акт внедрения в работу ОКК ЗАО фирма
«Здоровье»). Результаты данной диссертационной работы используются в
учебном и научном процессе кафедры фармакогнозии и ботаники Курского
государственного медицинского университета. Разработан проект
фармакопейной статьи «Хондриллы ситниковидной трава», который был согласован с ЗАО фирмы «Здоровье».
Методология и методы исследования. Исследования были проведены с 2013 по 2015 год. Теоретической основой исследований явились статьи ГФ XI издания, а также работы зарубежных и отечественных ученых, посвященные фитохимическим исследованиям как хондриллы ситниковидной, так и других видов растительного сырья.
Фармакогностические исследования включали целый комплекс
исследований: физико-химические методы (тонкослойная, бумажная
хроматография, УФ-спектроскопия, ВЭЖХ, газожидкостная хромато-масс-спектрометрия, эмиссионный спектральный анализ, фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия), макроскопический, микроскопический методы анализа.
Основные положения, выносимые на защиту.
результаты изучения химического состава травы хондриллы ситниковидной;
результаты исследования фенольных соединений;
результаты исследования полисахаридов;
результаты разработки методики количественного определения суммы фенольных соединений;
результаты исследования накопления фенольных соединений в зависимости от фазы вегетации растения;
результаты стандартизации сырья и водного извлечения из травы хондриллы ситниковидной;
результаты фармакологического скрининга настоя, водно-спиртовых извлечений из травы хондриллы ситниковидной.
Степень достоверности и апробации результатов. В работе представлен большой объем экспериментальных исследований, проведенных с использованием современных химических, физико-химических, морфолого-анатомических и фармакологических методов исследования, что подтверждает достоверность полученных результатов. Проведена статистическая обработка результатов исследования по требованиям ГФ XII и с использованием программы «Microsoft Exel 2013».
Апробация диссертации. Основные положения диссертационного
исследования представлены и обсуждены на: III Международной научно-
практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-
биологической и фармацевтической промышленности. Развитие
инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (г. Пенза,
2013г.); 79-ой и 80-ой Всероссийских научных конференциях студентов и
молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и
современность (г. Курск, 2014г, 2015г); XII Международной конференции
Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы (г. Минск,
2014г); Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы в химии и жизни (г. Минск, 2015г); Ежегодной межвузовской межрегиональной научно-практической конференции «Ильинские чтения», «Актуальные вопросы развития российской фармации» (г. Санкт-Петербург, 2015г).
Апробация работы проходила на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармацевтического и медико-биологического профиля КГМУ (23 октября 2015, Курск).
Публикации. Результаты диссертационной работы опубликованы в 15 научных работах, из которых 6 – в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 14.04.02 –
фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты исследования
соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2, 3, 6, 7 паспорта специальности «фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-
исследовательских работ Курского государственного медицинского
университета (номер государственной регистрации 01201458399).
Личный вклад автора. Автор участвовал в выборе объекта
исследования, постановке цели и задач исследования. Автором лично
осуществлен информационный поиск литературы по выбранному объекту
исследования и методикам анализа природных биологически активных
веществ, проведены фитохимический, морфолого-анатомический анализы, а
также фармакологические исследования; разработана методика
количественного анализа фенольных соединений. Под руководством научного
руководителя соискатель провел анализ полученных результатов,
статистическую обработку и сделал выводы по проведенным исследованиям.
Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 157 страницах машинописного текста, имеет 74 иллюстрации: 41 рисунок и 33 таблицы. Работа состоит из введения, литературного обзора (1 глава), главы с приведением объекта и методов исследования и трех глав, включающих результаты экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы и приложения. Список литературы содержит 190 источников, из них 30 иностранных авторов.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на
кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет», кафедре микробиологии, вирусологии и
иммунологии КГМУ, НИИ экологической медицины КГМУ, а также в
сотрудничестве с центром контроля качества и сертификации лекарственных
средств центра обеспечения медицинской техникой и имуществом
Министерства обороны Российской Федерации.
Химический состав хондриллы ситниковидной
Хондрилла ситниковидная – относится к семейству Астровые (Asteraceae). Астровые – Asteraceae является крупнейшим семейством цветковых растений, оно включает примерно 1620 родов и более 23600 видов [163]. Семейство распространено во всем мире за исключением Антартики [101]. Многие виды семейства содержат различные классы биологически активных веществ (полисахариды, фенольные соединения, эфирное масло и др.) и широко применяются в медицинской практике [127, 128]. Поэтому поиск новых источников этих соединений является весьма актуальным.
К представителям семейства астровых относятся растения рода Хондрилла, принадлежащего к подсемейству Латуковые [154]. Род хондрилла насчитывает 25-30 видов [154, 179].
Жизненная форма видов рода – это многолетние, реже двулетние травянистые растения. В Европе хондрилла, описывается как двулетнее растение, а в Австралии и Северной Америке как многолетнее [177]. Растения более менее разветвленные от основания или только в верхней части, с более менее развитым войлочком, наиболее густым в нижней части стебля, реже голые, со щетинковидными волосками в нижней части стебля, реже без них, средние и верхние стеблевые листочки очередные, цельные и цельнокрайние, нижние стеблевые листочки и листочки прикорневых розеток (если они имеются) обычно струговидно раздельные. Стебли длинные, двураздельные; ветви их длинные, нитевидные, густо покрытые сосочками. Корзинки многочисленные, собранные по 1-3 на верхушках ветвей, на укороченных боковых веточках или на ножках, с 5-12 обоеполыми язычковыми цветками. Обертки узкоцилиндрические, 10-15 мм длиной, около 2-2,5 мм шириной; листочки обертки кожисто-травянистые, на спинке с паутинистым опушением, в числе 5-9, наружные – очень мелкие, до 1-2 мм длиной, яйцевидные, черепитчато расположенные, внутренние – ланцетно-линейные, заостренные, 10-15 мм длиной, однорядные, по краю пленчатые, иногда со щетинковидными волосками вдоль средней жилки. Цветоложе плоское, голое. Венчик желтый, с длинной трубочкой, покрытой очень короткими, вверх направленными щетинковидными волосками, и пятизубчатым отгибом. Нити тычинок голые; пыльник у основания с очень короткими, плоскими, пленчатыми, цельными или немного рассеченными придатками. Семянки все одинаковые, с более менее длинным носиком и хохолком из многочисленных щетинок одинаковой длины, покрытых, в свою очередь, очень короткими (заметными лишь при сильном увеличении) щетинками второго порядка; расширенная часть семянок 2,5-11 мм длиной и около 1 мм шириной, узкоцилиндрическая, к основанию суженная, с 5 продольными ребрами, покрытая очень короткими (заметными лишь при сильном увеличении) волосками, в верхней части (иногда почти от середины) с мелкими бугорками и чешуйками, на верхушке с коронкой из 5 перепончатых, цельных или трехлопастных чешуек, реже без коронки; носики (включая носиковидную часть семянки ниже сочленения) 0,1-6 мм длиной, совершенно гладкие, с сочленением, располагающимся у них основания (над коронкой) или выше основания (иногда близ их середины или даже немного выше), и тогда легко опадающие по сочленениям вместе с хохолком, или без сочленения (иногда с намечающимся сочленением) и тогда неправильно обламывающиеся [71, 101, 154].
Биологической особенностью растений рода Хондрилла является способность образовывать на корнях и в подземной части стебля каучуконосные наплывы [154]. Родиной хондриллы считаются предгорные области, окружающие Каспийское море, где род хондрилла наиболее разнообразен. Оттуда он распространился в Средиземноморский регион и Центральную Европу [177].
Распространены представители данного рода преимущественно в странах Средиземноморья и на территории Средней Азии [154].
На территории Центрального Черноземья произрастает три вида: хондрилла широколистная (Chondrilla latifolia Beib.), хондрилла ситниковидная (Chondrilla juncea L.), хондрилла злаковая (Chondrilla graminea Beib.) [101].
Наиболее распространена среди них хондрилла ситниковидная [101, 122].
Хондрилла ситниковидная (Chondrilla juncea (L.)) – двулетнее или многолетнее травянистое растение высотой 50-100 см. Растение имеет стержневой корень и ветвистый внизу жестковолосистый стебель. Стебли ветвистые от основания, с прутьевидными зелеными ветвями. Листья прикорневой розетки и нижние стеблевые струговидные, остальные – от узколинейных до ланцетных. Стеблевые листья сидячие, по краю с шипами. Вертикальное расположение листьев – ребром к солнцу – спасает растение от перегрева. Корзинки сидячие, малоцветковые, в каждой 8-12 цветков, все цветки язычковые. Венчик желтый, с длинной трубочкой и пятизубчатым язычковым отгибом. Плоды – семянки с длинным (4-6 мм длиной) тонким носиком и белым хохолком. Цветет в июле-сентябре, семянки созревают в августе-октябре [71, 154].
Широко распространенный в Евразии вид. Распространена в Южной и Центральной Европе, Северной Африке, Юго-Западной Азии [179]. Вид также является сорным в Северной Америке и Австралии [179]. В России встречается довольно часто в южных областях европейской части (в том числе в черноземной полосе Средней России) и на Северном Кавказе, быстро распространяется на север [71].
Приготовление спирто-водного извлечения и разделение природных соединений
Определение отхаркивающей активности проводили с использованием модели изучения моторной функции мерцательного эпителия пищевода лягушек [19, 56, 116]; для чего лягушек фиксировали на корковой пластинке брюшком вверх. Лягушке на кончик языка наносили настой из травы хондриллы ситниковидной, приготовленный в соотношении 1:10 в объеме 0,1 мл. Препаратом сравнения служил раствор мукалтина 1%, представляющий собой комплекс водорастворимых полисахаридов полученных из травы алтея лекарственного.
Регистрацию движения ресничек мерцательного эпителия осуществляли с помощью шелковой нити размером 15 мм, которую после нанесения изучаемого настоя хондриллы ситниковидной помещали у основания языка. Отмечали по секундомеру время, пошедшее на заглатывания нити. Учитывали время, затраченное при движение нити на 10 мм без настоя (контроль) и после добавления изучаемого настоя. Поскольку нами использовались лягушки различной массы, что приводило к значительному разбросу исходных скоростей движения мерцательного эпителия у исследуемых животных, нами был применен коэффициент ускорения (КУ), рассчитываемый как отношение скорости движения, полученной после нанесения испытуемого настоя к исходной скорости [56].
Противовоспалительное действие исследуемого настоя изучали согласно методических рекомендаций по исследованию противовоспалительных препаратов, учитывая их влияние на разные стадии процесса воспаления [36, 38, 129, 130, 134]. Влияние на процессы экссудации Антиэкссудативные свойства настоя из травы хондриллы ситниковидной изучали, используя 0,05 мл водного раствора формальдегида 2,5% с помощью которого моделировали острый воспалительный отек, при субплантарном введении его в заднюю лапу мыши [19, 36, 78, 129, 134].
В опыте участвовали две группы мышей одного веса массой 18,0-20,0 г. Одной группе животных давали внутрижелудочно настои из травы хондриллы ситниковидной, которые готовили в соотношении 1:10, в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье) массы тела (в объеме 0,2 мл на 20 г массы животного) соблюдая временной интервал до введения формальдегида за 2 часа и через 5 часов и 18 часов после его введения. Мыши второй группы получали воду очищенную в те же сроки. Для образования воспаления впрыскивали в толщу бедра 0,05 мл раствора формальдегида 2,5% в одну из задних лапок. Через сутки после введения формальдегида мышей забивали и на уровне тазобедренного сустава у них отрезали воспаленные и невоспаленные задние лапки. Воспалительный отек определяли по приросту веса воспаленных лапок, который устанавливали по разнице в весе между воспаленными и невоспаленными лапками; о противовоспалительном эффекте настоя хондриллы ситниковидной – по разнице между величиной отека лапы, вызванного введением формальдегида у контрольных животных и мышей, которые получали исследуемый настой. Препаратом сравнения служила ацетилсалициловая кислота в дозе 300 мг/кг, которую животные получали в аналогичных условиях. Влияние на пролиферацию
На модели "ватной гранулемы" изучали антипролиферативную активность настоя хондриллы ситниковидной, используя белых беспородных крыс массой 180-220 г [19, 78, 80, 129, 134].
У крыс, в области спины под легким эфирным наркозом, выстригали шерсть и соблюдая асептические условия делали разрез длиной 1-2 см в кожи, подкожной клетчатки. Затем пинцетом формировали полость в подкожной клетчатке, куда помещали простерилизованный точно отвешенный ватный шарик (25 мг), и накладывали 1-2 шва. На протяжении 7 дней животным давали настой хондриллы ситниковидной в дозе 1 г/кг массы тела (в пересчете на сухое сырье - 1 мл), который готовили в соотношении 1:10, далее имплантированный шарик извлекали совместно с грануляционной тканью и высушивали его при t 55-60С до постоянной массы. Далее вычисляли массу грануляционно-фиброзной ткани по разнице между массой высушенной гранулы и имплантированного ватного шарика. Препаратом сравнения служил индометацин, контролем вода очищенная, которые вводили в тех же условиях.
Влияние на проницаемость капилляров у кроликов Капилляроукрепляющую активность изучали, моделируя локальную воспалительную реакцию с помощью ксилола у кроликов-альбиносов массой 3,0-3,5 кг [19, 36, 38, 110].
У кроликов на коже живота предварительно выстригали шерсть (участок 13 см). Настой хондриллы ситниковидной вводили внутримышечно в дозе 1 г/кг (в перерасчете на сухое сырье) за час до введения раствора трипановой сини. Трипановую синь вводили в краевую вену уха в виде 1% раствора на 0,9% растворе натрия хлорида из расчета 2 мл сини на 1 кг массы животного. В качестве показателя проницаемости капилляров выступало время появления на коже сине-окрашенных пятен и их диаметр. О действии на проницаемость капилляров судили по разнице во времени появления пятен и их диаметру до и после введения настоя хондриллы ситниковидной.
Результаты анализа углеводных производных
В результате качественных реакций: пенообразования и реакции Фонтан – Канделя (глава 2, раздел 2.2.16), были определены сапонины в траве хондриллы ситниковидной и установлено их отношение к тритерпеновой природе. Бутанольную фракцию, полученную из водно-спиртового извлечения травы хондриллы ситниковидной исследовали методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil–ПТСХ–АФ–А-УФ» в системе растворителей: этилацетат-хлороформ (1:5) (глава 2, раздел 2.2.16) и установили наличие в исследуемой фракции двух соединений в виде пятен малинового цвета с Rf 0,15, Rf 0,97, отнесенных к тритерпеновым соединениям (рисунок 10). С достоверными образцами в траве хондриллы ситниковидной идентифицирована урсоловая кислота [30].
Количественный анализ тритерпеновых соединений Количественный анализ, проведенный фотоэлектроколориметрическим методом (глава 2 раздел 2.2.16) показал, что содержание тритерпеновых траве хондриллы ситниковидной сапонинов составляет 0,060±0,002 % [30].
Минеральные элементы принимают участие в различных биохимических процессах в организме, стимулируя и нормализуя обмен веществ [100, 118]. Микроэлементы обладают высокой биологической активностью для организм человека [91, 112, 118, 136, 148]: они повышают неспецифическую резистентность организма [118, 148]. В литературе имеются сведения о микроэлементозах как у животных, так и у человека, возникающих при дисбалансе микроэлементов в организме [123]. Поэтому лекарственные растения могут являтся источником минеральных элементов [123].
Для изучения химического состава травы хондриллы ситниковидной было проведено определение минерального комплекса методом эмиссионного спектрального анализа (метод испарения из кратера угольного электрода) (глава 2, раздел 2.2.17) (таблице 7). Таблица 7 – Содержание минеральных элементов в траве хондриллы
В результате анализа установлено (таблица 7), что трава хондрилы ситниковидной богата минеральными элементами, 6 из которых являются эссенциальными и 2 – условноэссенциальными [22].
В траве хондриллы ситниковидной отмечено высокое содержание калия, кальция, магния, фосфора и кремния. Изученный минеральный состав растения указывает на его терапевтическую значимость и показывает, что данный вид может найти применение при недостатке минеральных элементов, а также использовать его в комплексном лечении заболеваний [105].
Содержание свинца находилось ниже предела обнаружения, что соответствует требованиям качества сырья по содержанию тяжелых металлов, регламентированных СанПин 2.3.2. 1078-01 [50].
Выход водорастворимого полисахаридного комплекса из травы хондриллы ситниковидной (глава 2, раздел 2.3.1) составил 3,51±0,15% (таблица 8) [27]. Водорастворимый полисахаридный комплекс, выделенный из травы хондриллы ситниковидной представляет аморфный порошок, имеющий светло-коричневый цвет и образующий при растворении в воде опалесцирующий раствор (рН 1% водного раствора находится в пределах 5-6). Водорастворимый полисахарилный комплекс так же растворяется в растворах щелочей и кислот не растворяется в органических растворителях. При наблюдении фиксируются положительные реакции осаждения полисахаридного комплекса ацетоном, спиртом, а так же положительная реакция с реактивом Фелинга после проведения кислотного гидролиза [26, 41, 97, 141, 142].
Выход пектиновых веществ из травы хондриллы ситниковидной составил 10,52±0,39% (таблица 8) [27]. Выделенный пектиновый комплекс явился аморфным порошком, имеющим светло-кремовый цвет. Пектиновый комплекс хорошо растворяется в воде, при этом образуется вязкий раствор (рН 1% водного раствора находится в пределах 3-4). При добавлении к водному раствору пектиновых веществ раствора алюминия сульфата 1% наблюдали образование осадка пектатов [26, 74, 98].
Выход гемицеллюлозы А из травы хондриллы ситниковидной составил 14,54±0,65%, гемицеллюлозы Б – 5,57±0,21% (таблица 8) [27].
Исследование состава полисахаридного комплекса методом хроматографии на бумаге после кислотного гидролиза
Мономерный состав выделенного полисахаридного комплекса изучали после проведения гидролиза кислотой серной (глава 2, раздел 2.3.2), далее проводили исследование моносахаридного состава с помощью хроматографии на бумаге (глава 2, раздел 2.3.3) [26, 68, 137, 142]. Далее хроматограммы сушили 1 час на воздухе, проявляли раствором анилингидрофталата, снова высушивали и прогревали при температуре 100-105оС в сушильном шкафу. После прогревания в сушильном шкафу наблюдали наличие 7 пятен (веществ) (рисунки 11, 12). После проведенного анализа с достоверными образцами были идентифицированы: арабиноза, ксилоза, галактоза, глюкоза, рамноза, глюкуроновая и галактуроновая кислоты [27].
В гидролизате пектинового комплекса обнаружили 5 соединений (рисунки 13, 14). С достоверными образцами были идентифицировали: галактоза, рамноза, глюкоза, арабиноза и галактуроновая кислота [27].
В гемицеллюлозах А и Б (Гц А, Гц Б) после проведения кислотного гидролиза обнаружили по 4 вещества (рисунок 15), которые были идентифицированы с достоверными образцами как: глюкоза, галактоза, арабиноза и ксилоза [27]. После проведенного исследования установили, что основными моносахаридами в ВРПС хондриллы ситниковидной были арабиноза и галактоза, в ПВ – галактуроновая кислота, а в Гц А и Гц Б - галактоза и глюкоза.
Установление числовых показателей
Исследование острой токсичности изучаемого водного извлечения (настоя) (глава 2, раздел 2.6.1) показало, что в течении эксперимента наблюдали у животных вялость, угнетение двигательной активности, заторможенность. Картина эксперимента показала, что при увеличении дозы вводимого настоя у животных увеличивались и выше описанные симптомы. Но к концу суток было установлено, что поведение животных нормализовалось, не отличаясь от интактных (таблица 26).
Данные таблицы 26 показывают, что внутрибрюшинное введение мышам настоя хондриллы ситниковидной в дозе от 1000 до 5000 мг/кг гибели животных не вызывало, что позволяет считать данный настои не токсичным в испытанном диапазоне доз. В связи с тем, что в ходе эксперимента не наблюдалось гибели животных при введении настоя в максимальной допустимой дозе, LD50 в опытах не устанавливали. Основываясь на полученные данные, можно сказать, что настой травы хондриллы ситниковидной можно отнести к классу практически нетоксичных руководствуясь классификацией К.К. Сидорова.
Отхаркивающую активность настоя из травы хондриллы ситниковидной изучали на модели моторной функции мерцательного эпителия пищевода лягушки (глава 2, раздел 2.6.2). При этом данную активность определяли по величине коэффициента ускорения движения ресничек мерцательного эпителия пищевода лягушки (таблица 27).
Влияние настоя из травы хондриллы ситниковидной на двигательную активность мерцательного эпителия лягушки Вводимый фитопрепарат, растение Коэффициент ускорения Увеличение двигательной активности, % Трава хондриллы ситниковидной (настой) 0,62±0,03 37,80±3,49 Мукалтин 0,62±0,01 38,33±1,35 Примечание: - показывает, что различия статистически достоверны в сравнении с контролем при Р 0,05; в группе 6 лягушек. Основываясь на результаты, полученные в ходе исследований установлено, что настой хондриллы ситниковидной увеличивает активность мерцательного эпителия лягушки на 37,80%, что свидетельствует о его отхаркивающих свойствах [23].
Настой травы хондриллы ситниковидной по величине отхаркивающей активности сопоставим с препаратом «Мукалтин», получаемым из травы алтея лекарственного, который увеличивал двигательную активность на 38,33%.
В настоящее время противовоспалительные свойства лекарственных растений и фитопрепаратов из них, недостаточно широко применяются в медицинской практике. Это по-видимому связано с несколько менее выраженным их эффектом, но при этом имеется ряд преимуществ: лучшая переносимость, меньшая токсичность, полифункциональность.
Противовоспалительную активность настоя хондриллы ситниковидной оценивали по общепринятой схеме, при этом учитывали влияния водного извлечения на различные фазы воспалительного процесса.
Антиэкссудативная активность Изучение антиэкссудативной активности настоя травы хондриллы ситниковидной, проводили, используя модель острого воспаления, возникающего при субплантарном введении в заднюю лапу мыши водного раствора формальдегида (глава 2, раздел 2.6.3), (таблица 28).
Данные таблицы 28 показывают, что величина отека лап мышей в контроле принята нами до 100% и составляет 58,27±2,65 мг. Под действием настоя хондриллы ситниковидной происходило снижение величины отека лап мышей до 28,57±3,38 мг; при этом противовоспалительный эффект изучаемого настоя составил 50,97%, что говорит о выраженной антиэкссудативной активности [23].
Оценивания антиэкссудативную активность настоя хондриллы ситниковидной в сравнении с ацетилсалициловой кислотой было установлено, что настой превосходит действие данного препарата.
Пролиферативная активность
Изучение влияния водного извлечения хондриллы ситниковидной на пролиферативный компонент воспаления определяли на крысах, используя модель "ватной гранулемы" (глава 2, раздел 2.6.3), (таблица 29).
Результаты таблицы 29 показывают, что вес грануляционно-фиброзной ткани в контрольной группе животных равен 140,55±8,07 мг, что составляет 100,00%. У крыс, получавших настой хондриллы ситниковидной величина грануляционно-фиброзной ткани была меньше: 60,52±6,95 мг (настой) на фоне контрольной группы животных, что свидетельствует о достоверном снижении воспалительного процесса, под действием настоя хондриллы ситниковидной.
На фоне приема индометацина вес гранулемы составил 44,27±3,34 мг, антипролиферативный эффект - 68,50% [28].
При анализе полученных результатов проведенного исследования было установлено, что исследуемый настой оказывает влияние на фазу воспаления, которое менее выраженное чем у препарата сравнения (индометацина), но достоверное в сравнение с результатами, полученными в контрольной группе животных. Влияние на проницаемость капилляров у кроликов В возникновении и течении ряда патологических процессов, в том числе и воспаления, проявляющихся в виде геморрагических синдромов, большое значение оказывает фактор сосудистой проницаемости. По методу Ойвина была изучена капилляроукрепляющая активность настоя хондриллы ситниковидной (глава 2, раздел 2.6.3), (таблица 30).