Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 12
1.1 Исторический очерк 12
1.2 Ботаническая характеристика чистеца крупноцветкового 14
1 - 1 Современное состояние исследований в области систематики рода чистец 14
1.2.2 Морфология чистеца крупноцветкового 16
1.2.3 Ареал. Места обитания 16
1 ,, Литературные данные по изучению и накоплению основных биологически активных веществ рода чистец 18
1.3.1 Алкалоиды 19
1.3.2 Эфирное масло и его компонентный состав 20
1.3.3 Иридоиды 21
1.3.4 Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты 22
1.3.5 Другие биологически активные вещества 23
1 Применение представителей рода чистец в медицине и на родном хозяйстве 24
ВЫВОДЫ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ 31
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 32
ГЛАВА II Объекты и методы исследования 32
2.1 Объект исследования 32
2.2 Методы исследования 32
2.2.1 Химические реакции 32
2.2.2 Хроматографические методы 32
2.2.2.1 Методы бумажной и тонкослойной хроматографии 32
2.2.2.2 Метод ВЭЖХ 34
2.2.2.3 Метод хромато-масс-спектрометрии 35
2.2.3 Спектральные методы 35
2.2.3.1 Метод УФ-спектрофотометрии 35
2.2.3.2 Атомно-абсорбционная спектрография 35
2.2.4 Методы количественного определения 36
2.2.4.1 Титриметрические методы 36
2.2.4.2 Гравиметрические методы 36
2.2.5 Методы стандартизации сырья 36
2.2.5.1 Методы морфолого-анатомического исследования 36
2.2.5.2 Методы определения числовых показателей качества сырья.. 37
2.2.5.3 Определение микробиологической чистоты сырья 37
2.2.5.4 Определение содержания радионуклидов 37
2.2.5.5 Определение сроков хранения сырья 38
2.2.6 Фармакологические методы исследования 38
2.2.7 Статистическая обработка данных з
ГЛАВА III Качественное и количественное определение основных
групп биологически активных веществ (БАВ) в траве
чистеца крупноцветкового 40
3.1 Качественные реакции 40 Хроматографическое изучение БАВ травы чистеца крупно
цветкового 42
3.2.1 Хроматографический анализ тритерпеновых соединений 43
3.2.2 Хроматографический анализ иридоидов Хоматографический анализ флавоноидов и оксикоричных кислот 47
3.2.4 Хроматографический анализ органических кислот 53
3.2.5 Хроматографический анализ моносахаридов 54
3.2.6 Хроматографический анализ аминокислот 55
3.2.7 Хроматографический анализ кумаринов 56
3.2.8 Хроматографический анализ витамина К 58 - Количественное определение БАВ травы чистеца крупно цветкового 59
3.3.1 Количественное определение дубильных веществ 59
3.3.2 Количественное определение флавоноидов 60
3.3.3 Количественное определение хлорофилла 64
3.3.4 Количественное определение тритерпеноидов ,, Количественное определение аскорбиновой кислоты и свободных органических кислот 67
3.3.6 Количественное определение полисахаридов 70
3.3.7 Количественное определение иридоидов 75
3.3.8 Количественное определение полифенолов 76
3.3.9 Количественное определение галловой кислоты 78
3.3.10 Количественное определение белка . Изучение состава эфирного масла травы чистеца крупно цветкового 82
3.3.12 Изучение аминокислот травы чистеца крупноцветкового 87
3.3.13 Изучение макро- и микроэлементного состава 89
ВЫВОДА ПО ГЛАВЕ 93
ГЛАВА IV Фармакологические исследования биологически активного комплекса чистеца крупноцветкового 95
4.1 Изучение острой токсичности 96
4 2 Изучение желчегонной активности экстракта чистеца крупноцветкового , Оценка противовоспалительной и ранозаживляющей активности 100
ВЫВОДА ПО ГЛАВЕ 103 ГЛАВА V. Определение запасов и интродукция травы чистеца
крупноцветкового 104
5.1.3 Расчёт объёма возможных ежегодных заготовок 107
5.2 Интродукционные исследования 108
5.2.1 Место проведения работы и методики исследования 108
- Морфологическая характеристика семян травы чистеца крупноцветкового 109
Изучение лабораторной всхожести семян чистеца крупно цветкового ПО
5.2.4 Определение всхожести семян при разных сроках хранения 112
5.2.5 Определение полевой всхожести 113
5.3 Фенологические наблюдения 113
Содержание флавоноидов в интродукционных образцах травы чистеца крупноцветкового 118
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 119
ГЛАВА VI Стандартизация травы чистеца крупноцветкового 121
1 Морфолого-анатомическое исследование травы чистеца крупноцветкового 121
Макроскопические признаки травы чистеца крупноцветкового 121
Микроскопические признаки травы чистеца крупноцветкового 122
6.2 Определение товароведческих показателей 129
6.2.1 Определение влажности 129
2 Определение содержания общей золы и золы, нерастворимой в растворе кислоты хлористо-водородной 10 % 129
6.2.3 Определение содержания примесей и измельченности 130
Методы качественного анализа основных групп биологически активных веществ в траве чистеца крупноцветкового 131
Метод количественного определения суммы флавоноидов в траве чистеца крупноцветкового 133
Установление сроков годности травы чистеца крупноцветкового 140
Определение микробиологической чистоты травы чистеца крупноцветкового 140
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 141
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 144
ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение к работе
Перед современной фармацевтической наукой стоит задача - увеличить поисковую работу по созданию новых эффективных растительных лекарственных препаратов. В настоящее время в России, как и в большинстве других стран, большой процент взрослого населения страдает острой и хронической патологиями печени и желчевыводящих путей. В связи со значительным распространением этих заболеваний, тяжестью их течения, наличием гепато-токсических свойств широко применяющихся синтетических препаратов, в настоящее время предпочтение отдается лекарственным средствам растительного происхождения.
Отмеченная в последние годы тенденция к росту патологий желчевыводящих путей и постепенное истощение природных ресурсов традиционных желчегонных лекарственных растений (бессмертник песчаный, пижма обыкновенная, барбарис обыкновенный и др.) делают актуальным поиск новых сырьевых источников лекарственных средств для лечения заболеваний печени и желчевыводящих путей. По литературным данным некоторые растения рода чистец (ч. лекарственный - Stachys officinalis L., ч. буквицецветный - S. betonicaeflora Rupr. и ч. болотный - S. palustris L.), сем. яснотковые (Lami-асеае) в традиционной медицине многих стран, используются в качестве желчегонных средств и проявляют фармакологическую активность схожую с известным препаратом «Фламин». В конце 70-х годов на Украине из травы ч. вздутого (S. inflata Benth.) был предложен препарат «Стахихол», отнесенный к группе истинных холеретиков. Однако, из-за отсутствия достаточной сырьевой базы некоторых видов рода чистец и вследствие геополитических изменений, произошедших в последние годы, поиск новых растительных источников желчегонных средств продолжает оставаться актуальным.
В этой связи наше внимание привлек чистец крупноцветковый (Stachys macrantha С. Koch), известный также как буквица крупноцветковая (Betonica macrantha С. Koch). Наличие значительной надземной фитомассы по сравнению с другими видами чистеца и достаточная распространенность на терри 7 тории Северного Кавказа, прогнозируют перспективность его использования в качестве нового сырья для получения лекарственных средств. Однако, для внедрения в медицинскую практику необходимы исследования по изучению химического состава его биологически активных соединений и разработке методов стандартизации сырья. Поэтому фармакогностическое изучение чис-теца крупноцветкового является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.
Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования - фармакогностическое изучение травы чистеца крупноцветкового, разработка нормативной документации на сырьё (трава), как потенциального источника получения БАВ, обладающих желчегонным и противовоспалительным действием.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выявить характерные места произрастания и определить ориентировочные запасы сырья чистеца крупноцветкового в некоторых регионах Северного Кавказа: в Ставропольском крае и в Карачаево-Черкесской Республике.
2. Изучить возмояшость интродукции чистеца крупноцветкового в ботаническом саду Пятигорской ГФА.
3. Провести фитохимическое изучение травы чистеца крупноцветкового (полифенольных соединений, иридоидов, эфирного масла, полисахаридов, органических кислот, аминокислот, макро- и микроэлементного состава).
4. Изучить оптимальные условия извлечения флавоноидов из травы чистеца крупноцветкового и разработать методику их количественного определения.
5. Изучить морфолого-анатомическое строение надземной части растения и выявить диагностические признаки травы чистеца крупноцветкового. 6. Провести стандартизацию травы чистеца крупноцветкового, разработать нормативную документацию на данный вид сырья.
7. Провести фармакологические исследования экстракта чистеца кругло-цветкового.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01200112164) и соответствует проблеме «Фармация» Ученого совета МЗ РФ, секция № 38.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Впервые были определены места произрастания и ориентировочные ресурсы травы чистеца крупноцветкового на Северном Кавказе (в Предгорном районе Ставропольского края и в Карачаевском районе Карачаево-Черкесской Республики). В Ставропольском крае (Предгорный район) эксплуатационный запас травы чистеца крупноцветкового составил 4,07 т воздушно-сухого сырья, а в Карачаевском районе Карачаево-Черкесской Республики - 3,52 т воздушно сухого сырья.
В результате проведенных фотохимических исследований установлено содержание в траве ч. крупноцветкового основных групп биологически активных соединений: эфирное масло, флавоноиды, дубильные вещества, окси-коричные кислоты, кумарины, иридоиды, полисахариды, аминокислоты, ранее в литературе не описанные для этого вида.
Методом ВЭЖХ в сырье чистеца крупноцветкового впервые идентифицированы и количественно определены шесть фенольных соединений: флавоноиды (гиперозид, дигидрокверцетин и изосалипурпозид), фенолокислоты (галловая кислота), кумарины (дикумарин и умбеллиферон). Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в траве чистеца крупноцветкового идентифицированы иридоиды: гарпагид, гарпагидацетат, аюгозид и аюгол. Впервые изучен фракционный состав полисахаридного комплекса травы чистеца крупноцветкового. Обнаружены: водорастворимые полисахариды (0,78-0,83%), пектиновые вещества (0,36-0,55%), гемицеллюлоза А (3,00-3,21%), гемицеллюлоза Б (2,45-3,26%).
Охарактеризованы свободные органические кислоты, которые представлены: винной, лимонной и аскорбиновой кислотами.
Методом газовой хромато-масс-спектроскопии (ГЖХ-МС) изучен состав эфирного масла чистеца крупноцветкового. Впервые идентифицировали 56 соединений, преобладающими компонентами эфирного масла чистеца крупноцветкового являются сесквитерпеноиды, из которых доминирующими являются - д-кадинен, L-каламенен, 1,5,5,8-тетраметил-[Ш-(Ш,ЗЕ,7Е,11К)]-12-оксабицикло [9.1.0]додека-3,7-диен, диэпицедрен-1-оксид, т-кадинол, а -кадинол, оксид кариофиллена, цис-- а-бисаболена эпоксид, 6,10,14-триме-тил-2-пентадеканон.
Найдены оптимальные условия анализа флавоноидов - качественного (методом ТСХ) и количественного (методом дифференциальной УФ-спектро-фотометрии) в траве чистеца крупноцветкового. Изучена динамика накопления флавоноидов по органам растения в основные фазы его развития и в зависимости от фазы вегетации. Установлено, что максимальное количество флавоноидов накапливается в фазу цветения - начало плодоношения в листьях и траве; в соцветиях - в фазу цветения.
Установлен аминокислотный состав, который представлен 14 аминокислотами, 8 из которых являются незаменимыми: метионин, треонин, гисти-дин, аргинин, лейцин, валин, фенилаланин, изолейцин.
Впервые изучен макро- и микроэлементный состав травы чистеца крупноцветкового, представленный 24 элементами, из которых доминирующими являются: калий, кальций, кремний, магний, фосфор и железо.
Проведена стандартизация сырья чистеца крупноцветкового с учетом современных требований предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного растительного сырья. Впервые проведены фармакологические исследования и установлена желчегонная, противовоспалительная и ранозаживляющая активность экстракта травы чистеца крупноцветкового.
Практическая значимость
Выявлена возможность использования нового вида отечественного сырья- травы чистеца крупноцветкового для получения биологически активных соединений, включающих флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, ири-доиды, фенолокислоты, эфирные масла, полисахариды, органические кислоты, аминокислоты, обладающие желчегонным, противовоспалительным и ра-нозаживляющим действием.
Для травы чистеца крупноцветкового разработаны методики качественного и количественного анализа флавоноидов, иридоидов, дубильных веществ, органических кислот, эфирного масла, аминокислот и др. соединений с использованием методов БХ, ТСХ , ВЭЖХ, ГЖХ-МС, спектрофотометрии.
На основании макро- и микроскопических исследований установлена совокупность анатомо-диагностических признаков, по которым можно проводить идентификацию сырья. •
В результате проведенных ресурсных исследований определена ориентировочная урожайность травы чистеца крупноцветкового и выявлены два района, пригодные для промышленной заготовки сырья этого вида на Северном Кавказе. Выявлена также возможность выращивания в условиях культуры чистеца крупноцветкового на КМВ.
Внедрение результатов исследования
По результатам исследования биологической активности сухого экстракта травы чистеца крупноцветкового получен акт внедрения ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (акт о внедрении от 15 июня 2007 г.). Сухой экстракт рекомендован для дальнейшего углубленного фармакологического исследования.
Подготовлена ФСП «Чистеца крупноцветкового трава» (подтверждена актом внедрения от 19 июня 2007 г.), принятая ЗАО «Вифитех» (Россия), позволяющая использовать в дальнейшем траву чистеца крупноцветкового как новый вид сырья для получения лекарственных препаратов желчегонного и противовоспалительного действия.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Результаты изучения химического состава травы чистеца крупноцветкового физико-химическими методами.
2. Результаты качественного и количественного определения флавоноидов в траве чистеца крупноцветкового с помощью предложенных методик.
3. Результаты ресурсоведческих исследований травы чистеца крупноцветкового на территории Карачаево-Черкесской Республики и Ставропольского края.
4. Результаты изучения фармакологической активности экстракта травы чистеца крупноцветкового.
5. Нормы качества, необходимые для стандартизации травы чистеца крупноцветкового.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на 60-й межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005 г.). По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 43 таблицы, 32 рисунка и 13 расчётных формул. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 250 источников, в том числе 54 иностранных, и приложения.
Фармакологические исследования травы крупноцветкового проводили под руководством профессора кафедры фармакологии, доктора биол. наук Погорелого В.Е. и ассистента кафедры фармакологии, к.ф.н. Макаровой Л.М., за что выражаем им глубокую благодарность и признательность.