Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика семейства Polygonaceae 11
1.2. Ботаническая характеристика горца почечуйного 12
1.3. Заготовка и сушка, хранение травы горца почечуйного 15
1.4. Химический состав горца почечуйного 16
1.5. Стандартизация травы горца почечуйного 18
1.6. Изучение других видов горцев 21
1.7. Фармакологическое действие и применение травы горца почечуйного 24
Выводы к главе 1 26
Глава 2. Материалы и методы 27
Экспериментальная часть 31
Глава 3. Изучение характеристик подлинности лекарственного растительного сырья 31
3.1. Изучение внешних признаков травы горца почечуйного 32
3.2. Микроскопический анализ травы горца почечуйного
3.2.1. Изучение анатомического строения травы горца почечуйного при измельчении 36
3.2.2. Сравнительное изучение анатомического строения горца почечуйного и примесных к нему видов 38
Выводы к главе 3 43
Глава 4. Изучение состава БАВ травы горца почечуйного 45
4.1. Исследование химического состава травы горца с помощью основных качественных реакций 45
4.2. Хроматографический анализ БАВ травы горца почечуйного 47
4.3. ГХМС исследование химического состава травы горца почечуйного 59
4.4. Исследование спектральных характеристик извлечений, полученных разными растворителями 60
4.5. Количественное определение некоторых БАВ в траве горца почечуйного64
Выводы к главе 4 74
Глава 5. Изучение показателей безопасности и минерального состава травы горца почечуйного 76
5.1. Определение в траве горца почечуйного пестицидов, тяжелых металлов и радионуклидов 76
5.2. Определение минерального состава травы горца почечуйного 78
5.2.1. Изучение элементного состава травы горца почечуйного методом хромато-масс-спектроскопии 79
5.3. Определение содержание кальция и магния в водном извлечении 85
из травы горца почечуйного 85
5.3.1. Разработка методики определения содержания кальция и магния в траве горца почечуйного после ее озоления 88
Методика определения содержания кальция и магния в траве горца почечуйного 91
Выводы к главе 5 94
Глава 6. Разработка методик стандартизации травы горца почечуйного 95
6.1. Разработка показателя «Экстрактивные вещества» для травы горца почечуйного 95
6.2. Отработка условий количественного определения флавоноидов в траве горца почечуйного 98
Выводы к главе 6 108
Глава 7. Получение лекарственных форм из травы горца почечуйного 109
7.1. Установление коэффициента водопоглощения 109
7.2. Анализ водных извлечений из травы горца почечуйного 110
7.3. Получение жидкого экстракта (1:1) травы горца почечуйного 111
Выводы к главе 7 115
8.1. Изучение антиоксидантной активности травы горца почечуйного 116
8.2. Изучение мембраностабилизирующего действия препаратов травы горца почечуйного 118
Выводы к главе 8 123
Общие выводы 124
Список сокращений 126
- Химический состав горца почечуйного
- Изучение анатомического строения травы горца почечуйного при измельчении
- Исследование спектральных характеристик извлечений, полученных разными растворителями
- Разработка методики определения содержания кальция и магния в траве горца почечуйного после ее озоления
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Средства растительного происхождения широко используются в лечебно-профилактических целях. Это объясняется сочетанием в фитопрепаратах широкого спектра биологической активности и относительной безопасности. Особый интерес в этом отношении представляют лекарственные растения, содержащие флавоноиды.
Одним из таких растений является горец почечуйный –Polygonum persicaria L., семейства гречишные – Polygonaceae, широко распространенный по всей территории России. Трава горца почечуйного включена в Государственный Реестр как кровоостанавливающие средство, обладающее противогеморроидальным эффектом. В 60-х гг. XX века фармацевтическая промышленность СССР выпускала жидкий экстракт горца почечуйного. В настоящее время в аптечной сети реализуется измельченная трава горца почечуйного, фасованная в пачки, а готовые лекарственные формы из травы горца почечуйного отсутствуют.
Анализ нормативной документации (НД) показал, что действующая на настоящий момент НД на траву горца почечуйного (ст.58 ГФ XI изд.) нуждается в совершенствовании.
В связи с вышеизложенным, углубленные исследования БАВ и стандартизация травы горца почечуйного являются актуальными.
Степень разработанности темы исследования. Фундаментальные
исследования травы горца почечуйного относятся к 50-60 г.г. XX в. (Самарина Г.И., Беликова А.П.). В настоящее время встречаются отдельные работы (Высочина Г.И., Вагабова Р.А., Редкокашин Д.Е., Куркина А.В. и др.), посвященные изучению биохимических аспектов систематики и филогении горца почечуйного, составу флавоноидов и других групп БАВ, в растении, произрастающем в разных регионах России.
Целью настоящего исследования является углубленное фармакогностическое изучение травы горца почечуйного, необходимое для совершенствования НД и получения экстракционных препаратов на его основе.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Провести анализ научной литературы и нормативной документации на траву горца
почечуйного и препаратов из сырья.
-
Провести углубленное изучение анатомического строения цельной, измельченной и порошкованной травы горца почечуйного;
-
Изучить комплекс БАВ травы горца почечуйного с помощью современных физико-химических методов;
-
Определить количественное содержание основных классов БАВ в траве горца почечуйного;
-
Определить содержание экстрактивных веществ в траве горца почечуйного с использованием различных экстрагентов;
-
Разработать методику количественного определения флавоноидов в траве горца почечуйного;
-
Получить из травы горца почечуйного жидкие лекарственные формы (ЛФ) -настой и жидкий экстракт, и провести их анализ;
-
Изучить антиоксидантную и мембранстабилизирующую активности сырья и препаратов горца почечуйного.
Решение задач осуществлялось путем обобщения литературных данных и проведения соответствующих экспериментальных исследований.
Научная новизна результатов исследования. Получены научно-
обоснованные данные по составу БАВ травы горца почечуйного с использованием
современных физико-химических методов анализа (УФ-спектроскопия, ТСХ,
капиллярный электрофорез, фотоэлектроколориметрия, атомно-абсорбционная
спектроскопия, газовая хроматография и др.). Показано присутствие в сырье флавоноидов, полисахаридов, органических и оксикоричных кислот, дубильных веществ, сапонинов, аминокислот, витаминов. Дана качественная характеристика и количественная оценка БАВ, для чего разработаны методики, адаптированные к изучаемому сырью. Предложены показатели, характеризующие содержание БАВ в траве горца почечуйного (содержание экстрактивных веществ и флавоноидов). Выявлены признаки анатомического строения цветков, раструбов и стеблей горца почечуйного и установлены их биометрические характеристики. Разработана методика комплескосометрического определения содержания кальция и магния в траве горца почечуйного после озоления (заявка на изобретение №2015102880 от 28.01.15). Экспериментально показано наличие мембранстабилизирующего и антиоксидантного действия травы, настоя и жидкого экстракта горца почечуйного.
Теоретическая значимость исследования. Использование современных физико-химических методов анализа позволило получить новую информацию о составе БАВ горца почечуйного и дать им количественную оценку. Разработанные комплекс испытаний для подтверждения подлинности травы горца почечуйного (уточненные и расширенные микроскопические характеристики, качественные реакции и хроматографические пробы) и методики количественного определения в сырье суммы флавоноидов и экстрактивных веществ могут использоваться для идентификации и оценки качества сырья. Результаты изучения антиоксидантной активности и мембранстабилизирующего действия могут быть использованы в дальнейших фармакологических исследованиях для расширения области применения сырья и препаратов на основе травы горца почечуйного.
Практическая значимость результатов исследования. Полученные уточненные данные по анатомическому строению травы горца почечуйного и содержанию БАВ использованы при разработке проекта ФС «Горца почечуйного трава» для ГФ РФ ХIII изд., который передан в Центр фармакопеи и международного сотрудничества (24 августа 2015). Проект ФС разработан для травы горца почечуйного разной формы переработки - цельное ЛРС, измельченное, порошок. На основании проведенных исследований разработан проект ФС «Экстракт горца почечуйного жидкий». Полученные экспериментальные данные могут служить основой для разработки новых лекарственных средств из травы горца почечуйного.
Основные положения, выносимые на защиту:
результаты микроскопического изучения цельной и измельчённой травы горца почечуйного;
результаты изучения качественного состава БАВ травы горца почечуйного и их количественная оценка;
результаты разработки методик стандартизации травы горца почечуйного;
результаты изучения лекарственных форм травы горца почечуйного;
результаты изучения антиоксидантной и мембранстабилизирующей активности травы, настоя и жидкого экстракта горца почечуйного.
Методология и методы исследования. Методология исследования основана на анализе литературных данных, оценке степени изученности и актуальности темы исследования. При выполнении работы были использованы методы:
макроскопический, микроскопический, ТСХ, спектрофотометрия, титриметрия, гравиметрия, атомно – абсорбционная спектроскопия, капиллярный электрофорез, хромато-масс-спектроскопия, газовая хроматография. Разработанные методики валидировали согласно ОФС ГФ XIII изд. «Валидация фармакопейных методик» (ОФС.1.1.0012.15). Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ XIII (ОФС.1.1.0013.15), и с помощью компьютерной программы Statistica 7,0.
Достоверность научных положений и выводов. Полученные результаты и
сделанные выводы основаны на достаточном количестве экспериментальных
исследований. В работе использовано современное сертифицированное
оборудование, разработанные методики валидированы. Научные положения, выводы и практические рекомендации обоснованы и логически вытекают из результатов эксперимента. В работе использован достаточный объем литературных источников, как отечественных, так и иностранных авторов.
Апробация результатов исследования. Основные результаты исследований
доложены на пленарном заседании V Всероссийской с международным участием
научно–методической конференции «Фармобразование – 2013» (Воронеж, 2013г.),
II,III,IV научно-практических конференциях «Современные аспекты использования
растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (Москва,2014,
2015, 2016г.), научных конференциях кафедры фармацевтической химии и
фармацевтической технологии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО Воронежского государственного университета (Воронеж, 2012-2016гг.), XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2016 г.). Апробация диссертационной работы проходила на межкафедральной конференции фармацевтического факультета ФГБОУ ВО ВГУ (21 января 2016 г.).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке целей и задач, экспериментальной работе, статистической обработке результатов и анализе полученных данных. Вклад автора является определяющим на всех этапах проводимого исследования. В работах, проводимых в соавторстве, автор принимал непосредственное участие в экспериментальной и аналитической работе, в научном обосновании и обобщении полученных результатов. Диссертация и автореферат написаны автором лично.
Внедрение результатов исследования Результаты изучения состава БАВ травы горца почечуйного, характеристик подлинности сырья использованы в учебном процессе кафедры управления и экономики фармации и фармакогнозии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России (акт от 03.02.2015), предложенная методика комплексонометрического титрования кальция и магния использованы в учебном процессе кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России (акт от 05.12.2014), а так же в работе лаборатории БУ ВО «Воронежский ЦКК и СЛС» (акт от 01.12.2014), методика усовершенствования техники микроскопического анализа растительных объектов, богатых кристаллическими включениями использована в учебном процессе кафедры ботаники и микологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России (акт от 29.11.2014)
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия, пунктам 2,3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтической науки.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом по научной проблеме «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований (№ государственной регистрации 01.2.006 06352.) университета» (Воронеж, 2012-2016 гг.).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 200 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, шести экспериментальных глав, выводов и библиографического указателя, включающего 168 источников, из которых 24 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 29 рисунками, 47 таблицами. Приложение включает проект ФС «Горца почечуйного трава» (от 24.08.2015) г., проект ФС «Экстракт горца почечуйного жидкий», акты внедрения в учебный процесс и работу лаборатории БУ ВО «Воронежский ЦКК и СЛС».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 8 статей в изданиях, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией при Минобрнауки России.
Химический состав горца почечуйного
В качестве лекарственного растительного сырья заготавливают траву горца почечуйного. Сбор проводят в фазу цветения. Срезают верхнюю часть растения длиной до 40 см без грубых нижних частей серпом или секатором, без грубых нижних частей. В густых зарослях траву косят косой. Сразу же очищают от примесей других растений, пожелтевших и пораженных вредителями и болезнями частей растения. Сушат на чердаках под железной крышей или под навесами с хорошей вентиляцией. Сырье раскладывают слоем не толще 5 см и часто переворачивают. Желательно сушку проводить с искусственным обогревом при температуре не выше 40С [32,96,123]. При медленной сушке сырье чернеет.
Хранят в сухих, хорошо проветриваемых помещениях, упаковав в тюки или мешки. Срок хранения 2 года [32,96,130,131].
Фундаментальные исследования травы горца почечуйного относятся к 50-60 годам XX столетия [19]. Определен флавоноидный состав различный частей растения: надземная часть содержит авикулярин, гиперозид, кверцетин (Hnsel, Hrhammer,1954); листья - кверцетин, гиперин, изокверцетин, цианидин, дельфинин (Мухамедьярова, 1968); плоды – гиперин, рутин, кверцетин, два флавон-3-гликозида (Reznik,1956), 5,7-дигидрооксихромон, кемферол, кверцетин, гиперин, 3-галактозид, кемпферол (Romussi, Ciarallo,1974), антрахиноны (Hegnauer,1969); лепестки цветов – цианидин-3-рутинозид (Harborne,1967) [20]. Информация по стандартизации горца почечуйного в доступной отечественной и зарубежной литературе крайне ограничена. По данным [114,131] трава горца почечуйного содержит флавоноиды (1,8 %): гиперозид, авикулярин, кверцитрин, рутин; производные флавона (до 2-3% в сумме), танин (1,5%), галловую кислоту, флобафены, эфирное масло (0,05%), найдены уксусная и масляная кислоты, аскорбиновая кислота, значительное количество витамина К, а также слизи, пектиновые вещества (5,4%), оксалат кальция, сахара. В корнях обнаружены оксиметилантрахиноны.
В настоящее время имеются единичные работы, посвященные изучению травы горца почечуйного.
Высочиной Г.И. в своей работе [20] был изучен состав флавоноидов в траве горца почечуйного методом двумерной хроматографии, обнаружены кемферол, кверцетин, мирицетин и лютеолин. Также данным исследователем приводится содержание других БАВ данного растение: фенолкарбоновые кислоты : кофейная, галловая, хлорогеновая, антоцианы в составе цианидина и дельфинина, дубильные вещества в количестве 24,5%, кумарины, эллаговая кислота. Исследования Вагабовой Ф.А. с соавторами [42] были посвящены изучению количественного содержания флавоноидов травы горца почечуйного произрастающего в Дагестане фотометрическим способом в пересчете на рутин, показано, что максимальное накопление флавоноидов наблюдается в соцветиях (0,08 – 0,11%), а минимальное в стеблях (0,02-0,10). Изучена антиоксидантная активность с помощью амперометрического детектора, по данным исследования выявлено, что содержание антиоксидантов выше в листья и минимально в стеблях.
Абдыкаликова К.А. и Ислямбекова А.Т. [2] изучали зольность различных видов горца заготовленных в Казахстане, а также содержание витамина С (йодометрическим титрование) и дубильных веществ (перманганатометрическим методом).
Куркина А.В. [60] предлагает использовать метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа флавоноидов травы горца почечуйного (обнаружение пиностробина), а также метод спектрофотометрии (максимумы поглощения при длине волны 274±3 нм и 350±3 нм). Ею разработана методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве горца почечуйного с использованием дифференциальной спектрофотометрии в аналитическом максимуме 410 нм в пересчете на изокверцитрин, выявлено, что содержание варьируется от 1,77 до 2,58%.
Ishfaq H. с соавт. изучен состав травы горца почечуйного флоры Пакистана [157]. Исследования показали, что содержание золы составило 14,98% в корнях, 11,24% в цветах, 12,50% в стеблях, и 14,88% в листьях, 14,22% в плодах и 13.20% в семенах. Влажность составляла 7,40% в корнях, 5,40% в стеблях, 6,53% в листьях, 4,80% в плодах, 6,57% в цветках, и 7,30% в семенах. Жиров 2,62% в стеблях, 3,18% в корнях, 2,13% в цветках, 4,50% в листьях, 5,10% в плодах и 6,10% в семенах. Белока 10,48% в корнях, 6,50% в плодах, 7,70% в стеблях, 8,58% в листьях, 10,09% в цветках и 9,50% в семенах. Клетчатки в корнях и стеблях были 11,89% и 13,75%. Лист содержал 15,11% клетчатки. Цветки, плоды и семена содержали 15,50%, 10,73% и 12,19% волокна, соответственно. Углеводов найдено 52,06% в коренях, а в стеблях 57,95%. Листья, цветки и плоды содержали 50,40%, 54,50% и 58,64% углеводов, соответственно. Семена содержали 51,66% углеводов.
Работа Chomenkа Jonas [151] посвящена изучению флавоноидов и фенольных соединений, а также АОА травы горца почечуйного, установлено, что содержание флавоноидов в траве горца почечуйного из разных регионов Литвы варьировала от 0,36 до 1,00%, в листьях от 0,46 до 1,13%, в стеблях от 0,08 до 0,20%. Определение флавоноидов проводилось методом спектрофотометрии растворителем служил 80% спирт этиловый, время экстракции составляло 20 минут. Содержание фенольных соединений составило от 32,12 до 85,63 мг/г в траве, в листьях от от 37,84 до 99,98 мг/г, в стеблях от 18,30 до 59,71 мг/г (спектрофотометрическое определение). АОА колебалась от 36,85 до 81,93 мг/г в траве, от 58,29 до 87,74 мг/г в листьях, в стеблях от22,61 до 77,26 мг/г.
Изучение анатомического строения травы горца почечуйного при измельчении
В ст.58 ГФ XI представлена подробная характеристика внешнего вида цельного сырья (см. литературный обзор, глава 1.2). Описание измельченного сырья представлено следующим образом: кусочки стеблей, листьев, соцветий различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет зеленый и буровато - зеленый. Запах отсутствует. Вкус горьковатый.
Данное описание малоинформативно, поэтому оно было дополнено характеристиками, полученными при изучении травы горца почечуйного под стереомикрокопом (х16): кусочки цветоносов и стеблей, чаще в продольном сечении, желтоватые в изломе, снаружи – от светло-зеленого до коричневого цвета; кусочки листьев от серовато-зеленого до коричневого цвета; части бутонов желтовато-коричневого цвета; лепестки, их кусочки желтого, беловато-желтого и желто-коричневого цвета; отдельные чашелистики и их части, изредка – недозрелые плоды зеленовато-коричневого цвета.
В связи с отсутствием с действующей НД, была дана характеристика внешних признаком крупного порошка травы горца почечуйного: растертое сырье, проходящее сквозь сито с диаметром отверстий 2,0 мм. Цвет зеленовато-бурый. Запах отсутствует. Вкус горьковатый.
При рассмотрении порошка под стереомикроскопом (16) видны: части стеблей, со светлым, почти белым изломом, снаружи – от светло-зеленого до коричневого цвета; кусочки листьев от серовато-зеленого до коричневого цвета; кусочки цветков розоватого цвета; отдельные части венчика желтого, беловато-желтого и желто-коричневого цвета; отдельные чашелистики и их части, изредка – недозрелые плоды зеленовато-коричневого цвета.
Цвет от серовато-зеленого до темно-зеленого и зеленовато-коричневого с многочисленными белыми, желтовато-белыми, желтыми и коричневыми вкраплениями. Запах слабый, вкус водного извлечения горьковатый, слегка вяжущий.
В действующей нормативной документации (ГФ XI, вып. 2 ст. 58) отсутствуют характеристики анатомического строения цветка, стебля, измельченной травы горца почечуйного и крупного порошка. В связи с этим было проведено углубленное изучение диагностически значимых признаков травы горца почечуйного при его измельчении. Размеры основных диагностических признаков устанавливали с помощью окуляра – микрометра.
В соответствии с современными требованиями к микроскопической характеристике травы необходимо было изучить анатомическое строение не только листьев, но также стеблей и цветков. Были исследованы поперечные и продольные срезы стебля растения, поперечные срезы и препараты листа с поверхности [132], препараты с поверхности чашечки и венчика цветка. Приготовление микропрепаратов и их анализ проводился в соответствии с методиками ГФ XI. При изучении стебля травы горца почечуйного, после кипячения в 5% растворе едкого натра готовили давленные микропрепараты.
Установлено, что клетки эпидермиса имеют вытянутую по длине стебля форму. Устьичный комплекс аномоцитного типа (устьица окружены 3-4 клетками эпидермиса). На поверхности эпидермиса находится большое количество пучковых волосков (117,6 мкм; ширина 1,96 мкм), которые плотно прижаты к его поверхности (рис.1. Приложение 1). Волоски состоят из 7-10 плотно прижатых клеток.
В поле зрения микроскопа видно большое количество друз оксалата кальция (d = 6,5 мкм), и железки, имеющие двухклеточную ножку и головку округлой формы, состоящую из 4-8 выделительных клеток (d = 7,8 мкм).
Главным отличием сем. Polygonaceae является присутствие раструбов в междоузлиях стебля. Клетки эпидермиса раструба мелкие, плотно прилегают друг к другу, более или менее правильной, прямоугольной формы, устьичный аппарат аномоцитного типа (рис.2. Приложение 1). По краю раструба располагаются длинные, многоклеточные реснитчатые волоски (длина 219,6 мкм, ширина 4,88 мкм).
Пучковые волоски, имеющие многоклеточное основание, часто остающееся при обламывании волосков (длина 185,4 мкм, ширина 7,32 мкм), располагаются по всей поверхности раструба, также присутствуют трудно различимые пленчатые волоски (длина 23 мкм, ширина 5 мкм). Железки не многочисленные, состоят из 2-4 выделительных клеток и 1-2 клеточной ножки. У основания раструба находится большое количество друз оксалата кальция.
При изучении анатомического строения листа горца почечуйного были даны метрические характеристики диагностических элементов.
«Пучковые» волоски располагаются по всей поверхности и краю листа, они достаточно длинные (длина 59,71 мкм, ширина у основания волоска 17,9 мкм) при основании листа, увеличиваются в своих размерах к середине (95 мкм длиной, 20,1 мкм шириной у их основания) и резко уменьшаются к верхушке листа (27 мкм длиной и 10,2 мкм шириной при основании). Волоски состоят из 2 (на верхушке листа) – 7 (ближе к основанию листа) плотно прижатых клеток. Они могут обламываться и, по краю листа видны места прикрепления волосков.
В мезофилле листа присутствует большое количество друз оксалата кальция, сконцентрированных в большом количестве при основании листа (встречаемость 2560 на см2), кроме того встречаются крупные идиобласты (рис. 3. Приложение 1).
Большое количество друз оксалата кальция в листьях мешало дальнейшему проведению микроскопического исследования.
На следующем этапе были внесены изменения в пробоподготовку сырья -вначале листья горца почечуйного кипятили в растворе 10% соляной кислоты для удаления соединений кальция. Далее, объект промывали водой и для просветления кипятили в 5% растворе натрия гидроксида.
Данная пробоподготовка позволила хорошо визуализировать на верхней стороне листа клетки эпидермиса с крупными мало извилистыми стенками (8,64х3,00 мкм), идиобласты, железки (d=5,8 мкм), состоящие из 2 – 4 клеточной ножки (d=2,1 мкм) и 6-8 выделительных клеток, а также мелкие вместилища с темным содержимым (d=4,9 мкм) (рис. 4. Приложение 1).
Исследование спектральных характеристик извлечений, полученных разными растворителями
При исследовании микропрепаратов порошка видны: фрагменты листовой пластинки с верхним эпидермисом с прямыми стенками, нижним - с извилистыми и устьицами, с 2-4 околоустьичными клетками, иногда они окружены 2 клетками, расположенными вдоль устьичной щели (аномоцитный тип). На поверхности листа имеются железки на 2-4-клеточной ножке с головкой из 8 (12-16) клеток, реже с 2-4 – клеточной головкой с бурым содержимым или бесцветные. По всей поверхности фрагмента пластинки листа и по краю встречаются пучковые волоски, образованные 2-5 сросшимися клетками, которые на верхушке волоска часто слегка расходятся. В мезофилле листа крупные друзы оксалата кальция. Встречаются фрагменты эпидермиса стебля и раструба, которые, кроме вышеперечисленных признаков, имеют пленчатые волоски, состоящие из нескольких рядов клеток и имеющие 2-клеточное основание. Встречаются фрагменты ткани околоцветника с призматическими кристаллами оксалата кальция.
Таким образом, при измельчении травы горца почечуйного все элементы изменяют свою форму, размеры и расположение относительно друг друга. Наиболее вариабильными являются структуры стебля, раструб, фрагменты цветка и плода. Практически в неизменном виде остаются диагностические элементы листа горца почечуйного [44].
К семейству Polygonaceae, помимо горца почечуйного Polygonum persicaria L., относятся такие представители рода Polygonum L., как горец шероховатый (Polygonum scabrum), горец малый (Polygonum minus), горец щавелелистный (Polygonum lapatipholium) (рис. 4.), которые произрастают в тех же условиях обитания, а также являются примесями при заготовке, и, зачастую, ошибочно заготавливаются наряду с травой горца почечуйного. Учитывая проблему полиморфизма представителей данного семейства, было проведено сравнительное изучение анатомо-диагностических признаков травы горца почечуйного и примесных видов рода Polygonum [118]. Горец почечуйный (Polygonum persicaria L.)
Для проведения исследования использовались образцы травы горца почечуйного, горца шероховатого, горца малого и горца щавелелистного, заготовленные в фазу цветения в Воронежской области. Видовая принадлежность изучаемых объектов была установлена совместно с сотрудниками кафедры ботаники и микологии биолого – почвенного факультета Воронежского государственного университета. Для проведения исследования все изучаемые объекты были разделены на основные морфологические составляющие - стебли, раструбы, листья, цветки и плоды. Подготовка микропрепаратов осуществлялась стандартным кипячением объектов в растворе гидроксида натрия, а также, для удаления кристаллических включений, последовательным кипячением в 1% растворе кислоты соляной, промыванием сырья дистиллированной водой до нейтральной реакции среды и просветлением в растворе натрия гидроксида (см. п.3.2.).
В результате проведенного исследования выделены особенности, отличающие официнальный вид горца от примесей. Стебель. Стебель горца почечуйного имеет большое количество пучковых волосков и железок с двухклеточной ножкой и четырьмя выделительными клетками. Друзы мелкие, располагаются по всей поверхности. На стебле горца шероховатого также много пучковых волосков, друзы многочисленные, по всему стеблю. Железки имеют 1-2 клеточную ножку и 2-4 выделительные клетки. Горец малый имеет редкие пленчатые волоски по стеблю, железки редкие, друзы в основном располагаются вдоль проводящих пучков. Отличительной особенностью горца щавелелистного является наличие на стебле длинных пучковых волосков (рис.1-3. Приложение 3).
Раструб. У горца почечуйного клетки раструбов мелкие, прямоугольные, на верхушке располагаются длинные реснитчатые волоски. По всей поверхности присутствуют мелкие пучковые и пленчатые волоски. Железки редкие, имеют 2-4 выделительные клетки. У основания раструба большое количество друз оксалата кальция. Клетки раструбов горца шероховатого прямоугольной формы, с четкими утолщениями. На верхушке и по всей поверхности имеются короткие пучковые волоски с расширенным основанием, а также короткие пленчатые волоски. Железки многочисленные, имеют 6-8 выделительных клеток и хорошо заметную 1 – 2 клеточную ножку. Реснитчатые волоски на верхушке раструба горца малого значительно превосходят по длине реснитчатые волоски горца почечуйного. По всей поверхности имеются сильно вытянутые пучковые волоски, железки преимущественно у основания, которые имеют 2 выделительные клетки. Отличительной особенностью раструба горца щавелелистного является наличие длинных волосков по всей поверхности, железок очень мало, располагаются в основном у основания раструбов (рис. 4-6. Приложение 3).
Лист. Отличительной особенностью листа горца почечуйного является наличие большого количества пучковых волосков по краю и всей поверхности листа. Железки многочисленные, состоят из 6-8 выделительных клеток и 2-4 клеточной ножки. Горец шероховатый на нижней стороне листа имеет большое количество длинных одноклеточных волосков, на верхней стороне листа присутствуют мелкие остроконечные простые волоски. По всей поверхности и краю листа имеются редкие пучковые волоски. Железки более крупные, чем на листе горца почечуйного. При изучении горца малого обнаружены пучковые волоски по краю листа, а также по его поверхности. Однако, большее их количество сконцентрировано на эпидермисе ближе к краю листа. Железки многочисленные, состоят в основном из 4 выделительных клеток. Главной отличительной особенностью горца щавелелистного является наличие по жилкам снизу листа крупных пучковых волосков, а также вытянутых пучковых волосков, состоящих из 1-2 клеток. По всей верхней поверхности листа присутствуют мелкие одноклеточные волоски, а также железки, состоящие из 2-4 выделительных клеток. Все исследуемые объекты имеют большое количество друз оксалата кальция (рис. 7-9. Приложение 3).
Цветок и плод. Строение цветка и плода всех исследуемых объектов схоже. Основным отличительным признаком цветков являлись железки, имеющие от 2 и более выделительных клеток, также объекты различались по их количеству (рис. 10,11. Приложение 3).
Таким образом, в результате проведенной работы были выявлены основные отличительные признаки горца почечуйного и его примесных видов, что может быть использовано в дальнейшем при идентификации сырья.
Разработка методики определения содержания кальция и магния в траве горца почечуйного после ее озоления
Трава горца почечуйного, согласно полученным экспериментальным данным и данным литературы, содержит значительное количество кальция и магния, участвующих в различных жизненно важных процессах организма. В последнее время наблюдается рост заболеваний, связанных с нарушением обмена данных элементов, что обусловливает интерес к лекарственным растениям, являющимися их источниками.
Известен способ количественного определения кальция и магния с использованием атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) [64]. Несмотря на высокую специфичность и чувствительность метода ААС, его существенным недостатком является необходимость приобретения дорогостоящего оборудования, ламп, специфичных для каждого конкретного элемента, необходимость проведения сравнения получаемых спектров со спектрами государственных стандартных образцов изучаемых элементов, а также длительность и трудоемкость исследования.
Близким аналогом предлагаемого способа является способ определения ионов кальция и магния в ЛРС комплексонометрическим титрованием с металлоиндикаторами [23,37]. Он заключается в определении кальция и магния в извлечении, полученном после экстракции сырья раствором хлористоводородной кислоты с последующим комплексонометрическим титрованием трилоном Б с использованием в качестве индикаторов мурексида или хромового темно – синего для кальция и пирокатехинового фиолетового для магния [56,86,87,112,115,119,126,127].
К недостаткам данного способа определения следует отнести выделение связанных элементов. Ионы Са и Mg присутствуют в растении как в свободном виде - растворимые соли, оксалат Са и др., так и в связанном виде: Са – составная часть клеточных оболочек, Mg – входит в состав основного пигмента зеленых листьев – хлорофилла и др. (рис.17).
Выход элементов из ЛРС при использовании экстракции не может считаться полным, так как экстракция БАВ, в т.ч. Ca2+ и Mg2+, из высушенного ЛРС складывается из следующих этапов: смачивания частиц сырья экстрагентом; проникновение экстрагента в клетки; набухание растительного сырья, сопровождающееся растворением БАВ клеточного сока, адсорбированных на клеточных стенках и органеллах клетки; вымывание полученного раствора из клеток и получение собственно экстракта. При этом в экстрагент выходят лишь соединения Ca и Mg, способные растворяться в применяемом экстрагенте. Процесс экстракции не сопровождается полным разрушением клеточных стенок и органелл клетки, в составе которых присутствуют Ca и Mg в качестве строительных элементов клетки. Кроме того, Ca и Mg входят в состав ферментативного аппарата клетки, представляющего собой высокомолекулярные вещества (биополимеры), неспособные проходить сквозь клеточные мембраны в процессе экстракции. Озоление ЛРС при температуре 5000С с последующим прокаливанием приводит к полной минерализации не только соединений Ca и Mg клеточного сока, но и соединений, включенных в клеточные стенки и органеллы. Такая пробоподготовка ЛРС обеспечивает полный количественный переход всех элементов клетки (в том числе Ca и Mg) в неорганические соединения и ионы, так как органические вещества в процессе сжигания полностью переходят в неорганические.
Определение содержания данных элементов можно проводить в извлечении, полученном экстракцией водой и хлористоводородной кислотой 10%, комплексонометрическим титрованием трилоном Б с использованием в качестве индикаторов хромогенного темно-синего и пирокатехинового фиолетового для кальция и магния соответственно [115]. Применив данный способ определения элементов к траве горца, были получены следующие результаты: содержание Ca в солянокислом извлечении из травы горца почечуйного составило 0,237±0,009%, в водном извлечении – 0,011±0,001 %. Ионы Mg обнаружены не были, возможно, концентрация ионов Mg в растворах была ниже предела обнаружения методики. Вероятно, это связано с тем, что Ca, выходя из растительного сырья, тормозит извлечение ионов Mg.
Были проведены исследования, направленные на разработку методики, дающей более полную информацию о содержании изучаемых элементов. Одним из наиболее действенных способов получения полной суммы микро-и макроэлементов из растительного сырья, является его озоление.
Золу травы горца почечуйного получали сжиганием в муфельной печи по методике ГФ XI изд.: 3-5 г измельченного ЛРС (точная навеска) помещали в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый тигель, равномерно распределяя его по дну тигля. Затем тигель осторожно нагревали, давая сначала ЛРС сгореть при более низкой температуре. Тигель с озоленным ЛРС прокаливали муфельной печи при температуре около 600С до постоянной массы, избегая появления пламени, сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждали в эксикаторе и взвешивали [29].
Учитывая способность ионов Са и Mg образовывать соли, растворимые в кислых растворах, полученную золу растворяли в 10% растворе соляной кислоты. Для осаждения ионов Mg, мешающих определению содержания Са, к полученному раствору добавляли натрия гидроксид, при этом выпадал густой осадок гидроксида магния, который отфильтровывали и дальнейший эксперимент проводили с полученным фильтратом.
На субстанциях, содержащих определяемые элементы, были подобраны оптимальные условия проведения анализа, проведен выбор индикатора, наиболее специфичного для определяемых ионов, а также оптимального значения рН среды для проведения эксперимента. При этом оптимальным значением рН было выбрано 9-10, 8-9 для Са и Mg соответственно с использование хромогенного темно-синего и пиракатехинового фиолетового в качестве индикаторов. Результаты приведены в табл. 28 и рис. 18.