Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. современное состояние исследований представителей рода solidago 12
1.1. Ботанико-географическая характеристика представителей рода SOLIDAGO L 12
1.2. Сведения о применении в медицине, химическом составе 17
Выводы к главе 1 29
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1 Характеристика объектов исследования 30
2.2. Методики исследования 30
ГЛАВА 3. Фитохимическое изучение solidago dahurica kitag 36
3.1. Установление основных групп биологически активных веществ 36
3.2. Изучение флавоноидов и фенолкарбоновых кислот методом бумажной хроматографии 38
3.3. Выделение фенольных соединений методом колоночной хроматографии и их идентификация 39
3.3.1. Результаты идентификации флавоноидов 42
3.3.2 Результаты идентификации фенолкарбоновых кислот 49
3.3.3. Результаты идентификации кумаринов 55
3.4. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ 57
3.5. Изучение сапонинов S. dahurica 59
3.6. Изучение состава и количественного содержания углеводного комплекса 61
3.7. Изучение состава и количественного содержания аминокислот методом спектрофотометрии 64
3.8. Изучение элементного состава травы S. dahurica 65
3.9. Изучение эфирного масла цветков S. dahurica 67
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 3 69
ГЛАВА 4. Определение содержания действующих веществ по органам и фазам развития solidago dahurica kitag 72
4.1. Разработка методики количественного содержания флавоноидов в траве Solidago dahurica 72
4.2. Установление количественного содержания дубильных веществ 79
4.3. Определение содержания фенолкарбоновых кислот
4.4. Определение содержание кумаринов 81
4.5. Динамика накопления действующих веществ S. dahurica 84
Выводы к главе 4 85
ГЛАВА 5. Стандартизация и разработка нормативной документации на сырьё solidago dahurica kitag 87
5.1. Ресурсные исследования S. dahurica в Иркутской области 87
5.2. Установление показателей подлинности и доброкачественности сырья S. dahurica 88
5.3. Установление анатомо - диагностических признаков вегетативных органов S. dahurica 93
Выводы к главе 5 96
ГЛАВА 6. Разработка способа получения и стандартизация экстракта сухого solidago dahurica kitag 97
6.1. Получение экстракта сухого S. dahurica 97
6.2. Стандартизация экстракта сухого S. dahurica 104
6.3. Лабораторная схема получения экстракта сухого из травы Solidago dahurica 108
Выводы к главе 6 110
Общие выводы 112
Список литературы
- Сведения о применении в медицине, химическом составе
- Методики исследования
- Результаты идентификации флавоноидов
- Определение содержания фенолкарбоновых кислот
Сведения о применении в медицине, химическом составе
Виды рода золотарник представляют собой многолетние растения c одиночными не ветвистыми или ветвящимися только в соцветии стеблями. Нижние листья черешковые, верхние сидячие, продолговато-эллиптические, большей частью пильчатые. Корзинки мелкие (от 3-20 мм в диаметре), собраны в верхушечные метельчатое или щитковидное соцветие. Обертка продолговатая или цилиндрическая из многочисленных черепитчато расположенных голых листочков. Ложе корзинки голое. Цветки желтые, немногочисленные, краевые ложноязычковые, срединные трубчатые, семянки цилиндрические, с буроватым хохолком и 8 - 12 ребрами. В странах СНГ, включая Россию, около 20 видов [104, 107]. Наиболее распространёнными и популярными в народной медицине Сибири являются виды золотарник даурский – Solidago dahurica Kitag., золотарник обыкновенный – S. virgaurea и золотарник канадский – S. canadensis (являющийся официнальным растением) [109].
Золотарник даурский–Solidago dahurica Kitag.–S. gebleri Juz.–S. virgaurea var. alpestris Krylov. non. ДС.–З. даурский. Растение до 1 м высотой (иногда более), простое, крепкое, ветвистое лишь в соцветии, в нижней части голое, в верхней – коротковолосистое. Прикорневые листья на длинных, стеблевые–на коротких черешках; пластинки их от 2-5 до 13 см длиной и от 1-2 до 5 см шириной, яйцевидные, продолговатые или ланцетные, на верхушке острые, по краю более или менее пильчато-зубчатые (только самые наружные прикорневые иногда почти округлые Рис 1. Золотарник даурский – Solidago dahurica Kitag. или широкояйцевидные, на верхушке закругленные), коротковолосистые, главным образом по краям и жилкам, или почти голые. Корзинки довольно мелкие, обычно многочисленные, собраны в простую кисть или узкометельчатое соцветие. Обертка 5- 8 мм длиной, 4-рядная (реже 3-рядная), черепитчатая, колокольчатая, зеленовато- желтоватая. Листочки обертки продолговато-яйцевидные или яйцевидные, 1,5-2,5 мм длиной, острые или приостренные, по краю негусто реснитчатые, сверху рассеянно опушенные, до голых, внутренние – ланцетно-линейные, 5, 5-7 мм длиной, острые или приостренные, слегка килеватые, по краю пленчатые и зазубренные, вверху слабо опушенные. Язычки краевых цветков 5-8 мм длиной, желтые. Семянки 4-5 мм длиной, узкие, палочковидные, в нижней половине или целиком голые (рис. 1). Произрастает в лесах, зарослях кустарников, на полянах, по долинам рек, встречается на лугах, каменистых и щебнистых склонах, прирусловых галечниках, в редколесьях.
Ареал: Западная Сибирь – Кемеровская область, Алтайский край, Таймыр, Хакасия, Тува. Восточная Сибирь – Иркутская область: Ангаро Саянский флористический район, Приленско-Катангский флористический район; Республика Бурятия, Читинская область: Даурия, Якутия: Вилюйско- Верхнеленский флористический район. Другие районы: Средняя Азия, Монголия, Китай (Маньчжурия) Золотарник обыкновенный – Solidago virgaurea 1753, Sp. Pl. 880.– з. обыкновенный, золотая розга. Растение 15-100 см высотой. Стебель прямой или слегка извилистый, в нижней части голый, в верхней голый или слабо опушенный, реже более или менее почти весь густо коротко опушенный. Стебли часто красноватые, особенно в нижней части. Листья голые или слабо и коротко опушенные по краям и по жилкам; прикорневые листья яйцевидные, продолговато-яйцевидные, лопатчатые или эллиптические, быстросуженные в крылатый черешок, по длине равный листовой пластинке или немного длиннее ее, грубопильчатые; стеблевые листья постоянно уменьшающиеся в размерах, верхние – сидячие, эллиптические или ланцетные, на верхушке острые, пильчатые или почти цельнокрайные. Соцветие узкое кистеобразное, со сравнительно короткими и малоцветковыми веточками или широкое метельчатое с удлиненными и многоцветковыми веточками, реже короткое и головчатое. Цветочные корзинки многочисленные, среднего размера –от 7 до 15 или 18 мм длиной, 10-15 мм шириной; обертка колокольчатая, 4-8 мм длиной, 4-6 рядная, листочки обертки острые, цельнокраенные, реснитчатые, самые наружные из них в 3 раза короче самых внутренних, средние листочки килеватые. Семянки 3-4 мм длиной, по всей поверхности опушенные; хохолок 4-5 мм длиной, беловатый (рис. 2).q
Методики исследования
Область «отпечатков пальцев» выделенного вещества и достоверного образца рутина совпадали, что подтверждало их идентичность. Вещество ФГ-3 – кристаллы жёлто-лимонного цвета, хорошо растворимы в воде, этаноле низкой концентрации, нерастворимы в хлороформе и этиловом эфире. Температура плавления 239-2420С, состава С21Н20О11, значения Rf в 15% уксусной кислоте – 0,17, БУВ (4:1:2) – 0,32. В ИК-спектре соединения ФГ-3 были отмечены следующие характерные полосы поглощения: 3520 -3333 см-1 - валентные колебания ОН-групп, 2908 см-1 - валентные колебания - С - Н сахарного компонента; 1710 см-1 - валентные колебания карбоксильной группы; 1654 см-1 валентные колебания С = С групп ароматического кольца; 1100, 1070, 1031 см-1 -пиранозный цикл сахарного компонента; 890 см-1– конфигурация гликозидной связи; 840 см-1– внеплоскостные деформационные колебания С – Н группы пиронового кольца флавона; 824 см-1 – замещение в бензольном кольце. Кислотный гидролиз проводили при нагревании до температуры 1000С и в присутствии кислоты серной 6% . Процесс гидролиза контролировали хроматографически, нанося пробы через каждые 30 минут. После охлаждения смеси осадок агликона отфильтровывали. В УФ-свете агликона имелись максимумы 255, 270 плечо, 291, 351 нм. Агликон по УФ-спектральной характеристике, хроматографическому поведению был идентичен лютеолину. В фильтрате, после осаждения сульфат-ионов бария карбонатом, хроматографически обнаружили глюкозу.
Кроме того, в результата ферментативного гидролиза препаратом «Пектавомарин Г10х» были также получены лютеолин и глюкоза.
Для определения положения присоединённого сахарного компонента использовали влияние на хромофорную систему флавоноида в УФ-спектре различных реагентов. В УФ-спектре соединения ФГ-3 в присутствии натрия этилата наблюдался сдвиг I полосы на 50 нм, что обусловлено свободной ОН-группой в 41 положении. По батохромному сдвигу на 42 нм максимума I полосы под влиянием алюминия хлорида и кислоты хлористоводородной судили о присутствии свободной 5-оксигруппы. Наличие плеча во II полосе УФ-спектра соединения ФГ-3 было обусловлено ортодиоксигруппой в 3I и 4I положениях кольца Б. При добавлении натрия ацетата наблюдали гипсохромный сдвиг максимума I полосы, что говорило о наличии заместителя в 7 положении. В пробе смешения соединения ФГ-3 с достоверным образцом лютеолин-7--D-глюкозидом депрессии температуры плавления не наблюдали. 1Н –ЯМР спектральные характеристики вещества ФГ-2: 7,38 (дд, 9 и 2 Гц, Н-6 ), 7,36 (д, 2,5 Гц, Н-2 ), 6,87 (д, 9 Гц, Н-5 ), 6,80 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,59 (c, Н-3), 6,43 (д, 2 Гц, Н-6), 5,09 (д, 7,2 Гц, Н-1 ), 3,9–3,3 (м, 6Н-глюкозы).
Таким образом, исследуемое соединение ФГ-3 идентифицировали как 7-О--D-глюкопиранозид лютеолина (цинарозид). В результате, выделили и идентифицировали следующие флавоноидные соединения: агликоны (ФА 1 – 3) – кверцетин, кемпферол, нарингенин; гликозиды, производные кверцетина (ФГ 1-3) – гиперозид, рутин, а также производное лютеолина (ФГ 4) – цинарозид.
Вещество ФК-1– представляло собой светло-жёлтые кристаллы (перекристаллизация из абсолютного этанола), состава С9Н8О4 с температурой плавления 190-1940С. Проявлялось в УФ-свете в виде пятен с голубой или синей флуоресценцией, которая под действием паров аммиака становилась ярче, что характерно для оксикоричных кислот (таблица 1). Зелёное окрашивание с железа III хлоридом и положительная реакция с аммиачным раствором серебра свидетельствовали о наличии в его структуре свободной ортодиоксигруппировки в бензольном кольце. Щелочное расщепление исследуемого вещества ФК-1 привело к образованию протокатеховой кислоты.
Данные ИК-спектроскопии свидетельствовали о наличии в структуре исследуемого вещества фенольных гидроксилов и фрагментов коричной кислоты (полосы поглощения при 3650-3300 см-1 и 1650-1500 см-1 соответственно).
В УФ-спектрах раствора этого вещества в абсолютном этаноле наблюдался максимум поглощения при 332-241 нм, подтверждало его принадлежность к оксикоричным кислотам. Под действием натрия этилата и алюминия хлорида происходили батохромные сдвиги максимумов обеих полос.
Пробы смешения этого вещества с достоверным образцом кофейной кислоты депрессии температуры не дали.
Таким образом, на основании хроматографического поведения и результатов физико-химического исследования указанное вещество ФК-1 идентифицировали как 3, 4 -диоксикоричную или кофейную кислоту. Вещество ФК-2 – кристаллы белого цвета с температурой плавления 200-204 С, состав C16H18O9. Проявлялось в УФ-свете в виде пятна с голубой флуоресценцией, изменяющейся в парах аммиака в жёлто-зелёную, что характерно для оксикоричных кислот. Результаты реакций – с железа III хлоридом (зелёный цвет), положительная с серебра аммиачным раствором - свидетельствовали о наличии в структуре выделенного вещества ФК-2 свободной ортодиоксигруппировки в бензольном кольце. При сплавлении со щёлочью была получена протокатеховая кислота. В ИК-спектрах выделенного вещества ФК-2 имелись полосы поглощения, характерные для оксикоричных кислот. При щелочном гидролизе вещества обнаружили кофейную и D-хинную кислоты.
В УФ-спектрах раствора этого вещества в абсолютном этаноле отмечались максимумы поглощения в длинноволновой области спектра при 326, 328 и 345 нм и в коротковолновой – при 245, 240 и 243 нм. Смещение максимумов поглощения I полосы в длинноволновую область спектра, а также отсутствие гипсохромии при добавке натрия ацетата, указывало на замещение карбоксильной группы. Добавка кислоты борной вызывала усиление батохромии, что указывало на наличие свободного ортодиоксизамещения. При добавлении натрия этилата и алюминия III хлорида происходили значительные батохромные сдвиги I полосы.
На основании вышеизложенного исследуемое вещество ФК -2 идентифицировали с изомером кислоты 3-кофеилхинной или хлорогеновой кислотой. Вещество ФК-3 – бело-жёлтые кристаллы состава С10Н10О4. Температура плавления 170-174 С. Проявлялось в виде УФ-свете в виде пятен синей флуоресценции, изменяющих окраску в парах аммиака, что характерно для оксикоричных кислот. Соединение не восстанавливало серебра нитрата аммиачный раствор и не давало зелёного окрашивания с железа (III) хлоридом, что свидетельствует об отсутствии ортодиоксигруппировки в бензольном кольце.
Результаты идентификации флавоноидов
Для установления возможности использования в медицинской практике золотарника даурского провели ресурсные исследования с целью оценки запасов сырья, достаточных для организации промышленных заготовок в различных районах Иркутской области.
Места произрастания растения, доступные для заготовок сырья, установливали по литературным данным, а также путём опроса лесников, местного населения и в ходе экспедиционного обследования территории районов. Для исследования задействовали следующие районы – Аларский, Ангарский, Баяндаевский, Боханский, Заларинский, Зиминский, Иркутский, Куйтунский, Нукутский, Ольхонский, Осинский, Слюдянский, Тулунский, Усть-Кутский, Эхирит-Булагатский. С точки зрения эколого-ценотической характеристики исследуемое растение зарекомендовало себя как типичный лугово-лесной вид, обитающий на разнотравных лугах, в основном суходольных, а вдоль побережья озера Байкал – в разнотравных редколесьях.
Учёт запасов сырья проводили на конкретных зарослях по общепринятой методике [16, 70]. Урожайность оценивали методом учётных площадок. Площадь закладываемых площадок составила 1 м2. Учётные площадки закладывали равномерно на расстояние 5-7 м равномерно друг от друга в количестве от 15 до 30. Ошибка метода не превышала 15%. С учетом заготавливаемого вида сырья – трава, а также принимая во внимание, что золотарник даурский – многолетнее травянистое растение, установили период восстановления заросли и оборот заготовки 2 года. Результаты оценки сырьевой базы S. dahurica в Иркутской области представлены в таблице 30.
Для внедрения в медицинскую практику новых лекарственных растений необходимо провести установление показателей подлинности и критериев доброкачественности, которые являются гарантией безопасности и эффективности сырья [4, 5, 32, 33, 89]. Разработанные показатели составили основу нормативного документа – проекта фармакопейной статьи предприятия. Для изучаемого объекта проводили определение микробиологической и радиологической чистоты и установили, что эти показатели соответствуют требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01 п.п.1.6.10 (, и загрязнители отсутствуют) и ГФ XIII [18, 29, 32, 80, 81, 93]
Оценку количественного содержания флавоноидов проводили по методике, разработанной в гл. 4, пп. 4.1. Разработанную методику применили для оценки стабильности содержания флавоноидов в процессе хранения. Было отмечено, что содержание флавоноидов в сырье оставалось стабильным на протяжении всего срока наблюдения (табл. 31). Для определения показателя влажности сырьё закладывали на хранение в 2010 году в июле-августе месяце. Условия хранения отвечали требованиям, регламентированным ГОСТ 6077-80 и ГФ XIII [32]. Потеря в массе при высушивании сырья составила от 8,47 до 9,84%. Предложено внести в проект ФСП норму содержания влаги не более 11% (прил. 1).
Результаты определение содержания золы, а также золы, не растворимой в хлористоводородной кислоте 10% позволили предложить следующие критерии содержания показателей доброкачественности: золы общей не более 3%, золы, не растворимой в хлористоводородной кислоте 10% – не более 2%.
В качестве лекарственного растительного сырья предлагается использовать надземную часть – траву, содержащую наибольшее количество действующих веществ (ДВ), заготовленную в фазу начала цветения (для уменьшения количества плодов с буроватыми хохолками, которые затрудняют дозирование и уменьшают количество действующих веществ в навеске).
В состав сырья входят стебли, листья и цветки. Морфологические признаки (подлинность сырья): цельное сырье – смесь олиственных стеблей, листьев цельных и частично измельчённых, соцветий цельных или частично осыпавшихся, недоразвитых плодов и хохолков. Стебли цилиндрические зелёные. Листья двух типов на длинных и коротких черешках, длиной от 5-13 см, шириной от 2-5 см, продолговатые, яйцевидные или ланцетные, заостренные, встречаются широкояйцевидные (округлые) с закруглённой верхушкой, по краю пильчато-зубчатые, коротко-опушённые, часто опушение встречается по жилкам или практически отсутствует. Жилкование перистонервное. Цвет листьев – зелёный. Корзинки – 5-8 мм в диаметре, отдельные или в кистевидных, либо узкометёльчатых соцветиях, язычковые краевые цветки жёлтые, золотисто–жёлтые, внутренние трубчатые-жёлтые, обёртка 2-3(4) рядная, листочки зелёные, наружные 1,5-2 мм длиной линейно-ланцетные, внутренние 5,5-7мм, по краям шероховатые, на верхушке коротко приострённые или притуплённые. Плод – семянка, узкая палочковидная, в нижней половине или полностью голая; измельченное сырье – кусочки листьев, стеблей, отдельных корзинок или цветков язычковых и трубчатых, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм. Цвет зелёный, беловато–зелёный с жёлтыми (золотисто–жёлтыми) вкраплениями; порошкованное сырьё – при рассматривани сырья под лупой (10х) и стеремикроскопом (16х) видна смесь кусочков травы зелёного или серовато-зелёного цвета с вкраплениями белого, жёлтого (золотисто–жёлтого) цвета, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.
Установление показателей доброкачественности (числовых показателей): массовая доля стеблей до 3 мм (включительно) в диаметре составляет от 4,89 до 7,34%. При анализе проб сырья обнаружены части других (не ядовитых) растений – злаковые, тысячелистник и другие, а также семянки с хохолком – в границах от 0,5 до 1,32%, пожелтевших и побуревших стеблей и листьев растения – от 1,26 до 4,16%, минеральных примесей – камешки, песок – от 0 до 0,12%. Кроме того, следует обратить внимание на содержание отдельных корзинок и высыпавшихся цветочных корзинок, содержание которых варьировало от 3,12 до 5,78%. отдельных корзинок и высыпавшихся цветочных корзинок не более 7%; а также стеблей более 3 мм в диаметре, содержание которых в пробах установлено от 1,76 до 2,33%. В сырье не допускается плесени, гнили, поверхностной влаги и амбарных вредителей. Полученные результаты позволили установить требования и нормы для сырья золотарника даурского, включенные в проект ФСП (табл. 31, 32).
Определение содержания фенолкарбоновых кислот
Для установления экстрагента нужной концентрации, обеспечивающего макисмальный выход из сырья ДВ, использовали спирт в концентрациях 30, 40, 50, 60, 70, 80 и 90%. Для контроля присутствия флавоноидов 25 мл всех полученных извлечений упаривали под вакуумом до 10 мл. Затем к полученному раствору добавляли 25 мл воды очищенной и снова выпаривали до 10 мл. Смесь охлаждали, экстрагировали флавоноиды из водных извлечений троекратно (по 10 мл) этилацетатом. Качественный состав флавоноидов изучали методом БХ. По результатам качественного анализа максимальное количество пятен флавоноидов на хроматограммах наблюдали при использовании спирта 70 % (табл. 33).
Примечание - среднее из трех определений Вытяжка, полученная спиртом 70%, содержала максимальную сумму экстрактивных веществ (метод гравиметрии) и сумму флавоноидов (метод спектрофотометрии).
Для изучения влияния степени мелкости сырьё измельчали до размеров частиц 0,5 -1 мм, 1 - 2 мм, 2 - 3 мм и более 3 мм. В извлечениях 1:10 [31, 32], полученных из сырья, обладающего различным фракционным составом, определяли концентрацию флавоноидов. При этом установили, что максимум выхода флавоноидов (метод спектрофотометрии) в пересчете на кверцетин, достигается при использовании сырья в степени измельчения 1 – 2 мм и 2 – 3 мм. В связи с тем, что в процессе экстрагирования для уменьшения энергозатрат на процесс измельчения следует использовать растительное сырье – золотарника даурского траву – с размером частиц не менее 2 мм и не более 3 мм (табл. 34).
На выход экстрактивных веществ и, соответственно, целевых БАВ, оказывает влияние фактор соотношения сырье-экстрагент. Оптимальное соотношение лекарственного растительного сырья и экстрагента обеспечивает необходимый для процесса экстракции градиент концентрации. Изучено влияние этого параметра на полноту извлечения экстрактивных веществ и флавоноидов из золотарника даурского травы и рассчитана эффективность экстракции в %. Полученные результаты приведены в таблице 35, из которой следует, что оптимальное соотношение составляет 1:14. Дальнейшее увеличение количества экстрагента нецелесообразно, так как содержание флавоноидов существенно не отличалось.
Выход суммы экстрактивных веществ и флавоноидов из сырья S. dahurica в зависимости от соотношения сырьё : экстрагент
Соотношение сырье-экстрагент (спирт 70%) Содержаниеэкстрактивных веществ,% Содержание флавоноидов, %
Важную роль на процесс выхода веществ из растительного сырья оказывают время и кратность экстракции. С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций установили время наступления равновесной концентрации в системе «сырье:экстрагент» по методике: навеску из 50,0 г сырья (золотарника даурского трава, степень измельчения – 2-3 мм), помещали в экстрактор, заливали спиртом 70%, экстрагировали при перемешивании на магнитной мешалке при температуре 600С (оптимальная температура выбрана на основании экспериментальных исследований). Экстрагирование проводили в три ступени через определенные промежутки времени – 30 минут – каждого контакта фаз извлечения сливали, сушили в сушильном шкафу при температуре 40-450С и анализировали по содержанию экстрактивных веществ и флавоноидов. Оставшиеся профильтрованнные извлечения объединяли, отстаивали при температуре +40С в течение 3-4 суток, вновь фильтровали и подвергали сушке при температуре 40-450С до получения сухой массы (табл. 36).
Результаты показали, что равновесное состояние при первом контакте фаз достигается за 60 минут, при втором – 60 минут и третьем – за 30 минут. При этом трёхкратная экстракция обеспечивала достаточно полное истощение сырья.
Определение качественного состава и количественного содержания БАВ. В полученном экстракте сухом подтверждено наличие дубильных веществ (реакция с железа (III) хлоридом, флавоноидов (цианидиновая реакция, реакция с алюминия хлоридом раствором 2%, БХ), фенолкарбоновых кислот (БХ, ВЭЖХ), кумаринов (с диазореактивом, ВЭЖХ), углеводов (осаждение спиртом 96%, реакция с серной кислотой концентрированной), сапонинов (реакция пенообразования), аминокислот (спектрофотометрия).