Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Этиология и патогенез ишемической болезни сердца
1.2. Фармакотерапия ишемической болезни сердца
1.3. Применение растительных средств в терапии ишемической болезни сердца
1.4. Современное состояние научных исследований в области разработки новых методов анализа растительных сборов
Заключение
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методы морфологического и микроскопического исследования
2.2.2. Методы определения доброкачественности
2.2.3. Методы фитохимического анализа
2.2.3.1. Методы идентификации основных групп БАВ
2.2.3.2. Методы количественного определения биологически активных веществ
2.2.4. Методы исследования биологической активности
2.2.5. Методы технологических исследований
2.2.6. Статистические методы анализа
Экспериментальная часть
Глава 3. Обоснование состава сбора «кардиофит»
3.1. Этапы и подходы к формированию состава сбора «Кардиофит»
3.2. Разработка состава сбора
Выводы к главе 3 5
ГЛАВА 4. Фитохимическое исследование сбора «кардиофит» 55
4.1. Макро- и микроскопический анализ сбора «Кардиофит» 55
4.2. Исследование химического состава сбора «Кардиофит»
4.2.1. Качественные реакции 64
4.2.2. Хроматографическое исследование сбора
4.2.2.1. Анализ фенольных соединений методом тонкослойной хроматографии 64
4.2.2.2. Анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ 70
4.2.2.3. Исследование химического состава сбора методом ГХ/МС
4.2.3. Изучение химического состава сбора рентген-флуоресцентным методом 73
4.2.4. Количественное определение БАВ в сборе «Кардиофит» 75
Выводы к главе 4 78
ГЛАВА 5. Исследования по стандартизации сбора «кардиофит» 79
5.1. Разработка методики качественного анализа сбора 79
5.2. Разработка числовых показателей сбора «Кардиофит» 86
Выводы к главе 5 101
Глава 6. Разработка лекарственной формы на основе сбора «кардиофит» 102
6.1. Разработка густого экстракта из сбора «Кардиофит» 102
6.2. Разработка показателей качества густого экстракта 107
6.3. Исследования по разработке лекарственной формы из густого
экстракта сбора «Кардиофит» 109
Выводы к главе 6 113
Глава 7. Исследование биологических свойств сбора «кардиофит» 114
7.1. Исследование острой токсичности сбора 1 1 4
7.2. Исследование биологических свойств сбора 115
Выводы к главе 7 118
Общие выводы 119
Список сокращении 121
Список литературы
- Применение растительных средств в терапии ишемической болезни сердца
- Методы фитохимического анализа
- Разработка состава сбора
- Анализ фенольных соединений методом тонкослойной хроматографии
Применение растительных средств в терапии ишемической болезни сердца
Лечение ИБС должно складываться из нескольких задач: снизить нагрузку на сердце и, тем самым, снизить потребность в кислороде; повысить адаптивные возможности миокарда; улучшить реологию крови. В терапии больных с ИБС используется несколько групп лекарственных препаратов, относящихся к различным фармакотерапевтическим группам [70, 71].
Для восстановления баланса между поступлением и потребностью миокарда в кислороде используется группа антиангиналъных лекарственных средств. Они классифицируются по патогенетическому принципу: I группа - вещества, уменьшающие работу сердца за счёт: а) уменьшения частоты сердечных сокращений и силы сокращений миокарда: Р-адреноблокаторы, антагонисты кальция; б) снижения притока крови к сердцу путем расширения вен: нитраты, сиднонимины; в) уменьшения выброса крови и снижения давления в артериальных сосудах: антагонисты кальция, р-адреноблокаторы, ингибиторы конвертирующего фермента. II группа - улучшающие доставку крови к миокарду - коронаролитики: нитраты, антагонисты кальция, производные хромена, пурина, изохинолина и другие группы препаратов, увеличивающие коронарный кровоток. III группа - вещества, улучшающие метаболические процессы в миокарде: антигипоксанты, антиоксиданты, рибоксин, карнитина хлорид и другие [102, 178].
Главной причиной возникновения ИБС является атеросклероз, который представляет собой хроническое заболевание артерий крупного и среднего калибра, характеризующееся постепенно развивающимся очаговым накоплением в интиме сосудов липидов, преимущественно холестерина и его эфиров, белков, сложных углеводов с последующим разрастанием соединительной ткани. Он выявляется у 90-97% больных ИБС, поэтому целесообразно проводить лечение ИБС и препаратами, применяемыми при атеросклерозе [60, 178]. В качестве антштеросклеротических средств используют следующие группы лекарственных препаратов: I. Гиполипидемические средства: - препараты, тормозящие всасывание холестерина в кишечнике (р ситостерин, холестирамин, диоспонин, трибуспонин); препараты, тормозящие синтез липопротеидов (ингибиторы гидроксиметилглютарил-коэнзим А-редуктазы: мевастатин, ловастатин, симвастатин, эптастатин); - вещества, ускоряющие метаболизм и выведение липидов из организма (препараты ненасыщенных жирных кислот: линетол, арахиден, желчегонные средства) [34]. П. Ангиопротекторы: - природные и синтетические антиоксиданти (токоферолы, флавоноиды, аскорбиновая кислота); - вещества, влияющие на тромбогенный фактор (антиагреганты): пармидин, ксантинола никотинат, дипиридамол. III. Липотропные вещества: липостабил, холина хлорид, метионин, липоевая кислота, инозитол [60, 101].
Для ишемической болезни сердца и атеросклероза различной локализации характерны гиперкоагуляционные изменения за счет повышения адгезивной и агрегационной активности тромбоцитов, а также эритроцитов, увеличение плазменных прокоагуляционных факторов (уровня фибриногена, фибринстабилизирующего фактора, появления фибрин-мономерных комплексов), снижения активности антикоагулянтов и угнетения фибринолиза. Эти процессы особенно ярко проявляются при дестабилизации коронарного кровотока - при нестабильной стенокардии и инфаркте миокарда. Для лечения тромбозов и состояний гиперкоагуляции используют средства, ингибирующие свертывание крови [101, 178]. Противосвертывающие (антитромботические) средства делят на три группы: фибринолитические (стрептокиназа, стрептодеказа, фибрино лизин), антикоагулянты прямого (гепарин) и непрямого действия (неодикумарин, фепромарон, синкумар) и антиагреганты. К антиагрегантам относятся средства, угнетающие циклооксигеназу (ацетилсалициловая кислота, индометацин); средства, угнетающие фосфодиэстеразу (дипиридамол) и стимуляторы синтеза простациклина (пентоксифиллин) [69, 178, 198].
Антиагреганты способны не только предупреждать агрегацию, но и вызывать дезагрегацию уже агрегированных кровяных пластинок. Антиагреганты ингибируют агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, уменьшают их способность к склеиванию и прилипанию к эндотелию кровеносных сосудов. Снижая поверхностное натяжение мембран эритроцитов, они облегчают их деформирование при прохождении через капилляры и улучшают «текучесть» крови [92, 102]. Длительный прием этих препаратов способен уменьшить количество сосудистых ишемических катастроф [178].
Если стенокардия сопровождается сердечной недостаточностью, то назначение сердечных гликозидов ведет к более экономному расходованию миокардом кислорода [89, 189].
Для лечения ИБС пациентами используются от 3 до 5-6 препаратов одновременно, что ведет не только к суммированию или потенцированию их фармакологической активности, но и повышению токсичности и развитию побочных эффектов. Надо отметить, что лекарственные препараты больной ИБС принимает пожизненно. Поэтому, несмотря на достаточно большой перечень используемых средств, поиск новых эффективных и менее токсичных лекарственных препаратов является перспективным направлением современной фармации.
Методы фитохимического анализа
Рациональная и безопасная фитотерапия предусматривает изучение химического состава растительных средств с целью разработки методов их стандартизации, исследование фармакологических свойств содержащихся в них биологически активных веществ [46]. Важным условием достижения фармакологического эффекта при использовании лекарственных растительных средств является их соответствие требованиям нормативной документации - фармакопейной статьи. В настоящее время фармакопейные статьи имеются только на те немногочисленные сборы, которые включены в Государственный реестр лекарственных средств и выпускаются промышленностью [93, 134].
Одним из актуальных направлений современной фармакогнозии является создание новых методов стандартизации исследуемого лекарственного растительного сырья и препаратов на их основе. Это позволяет оптимизировать применение лекарственных растений для терапии различных заболеваний, и что особенно важно, осуществить разработку лекарственных форм промышленного производства на основе растительного сырья [46]. Для решения задачи о разработке объективных методов стандартизации необходимо введение комплекса фи-тохимических и фармакологических исследований по выявлению веществ, доминирующих не только в количественном отношении, но и определяющих фармакотерапевтический эффект растительных препаратов. Стандартизация лекарственных средств растительного происхождения имеет свои особенности, связанные с большим комплексом содержащихся в них биологически активных веществ. Качественные и количественные характеристики растительных сборов в настоящее время несовершенны и сводятся чаще всего к определению внешних признаков, микроскопии компонентов, таких числовых показателей, как содержание фармакологически активных соединений, измельченность, влажность, зольность и наличие примесей, проведению качественных реакций.
Проведение качественных реакций в растительных объектах вообще является не очень объективным, так как, например, флавоноиды, дубильные вещества, полисахариды или сапонины содержатся практически во всех высших растениях и будут давать положительные реакции на данные группы БАВ. Поэтому более объективную оценку подлинности сборов даёт проведение хроматогра-фических проб и измерение УФ-спектров различных извлечений из сборов. Что касается количественной оценки, то определение содержания суммы доминирующих биологически активных веществ, обусловливающих терапевтический эффект, является достаточно объективной характеристикой. Только она должна разрабатываться исходя из того, в каком виде будет использоваться сбор или сырье: в виде водного или спиртового извлечения, или какого-либо другого. Разработка оптимальных методик качественного и количественного определения различных групп биологически активных веществ, проведение их валидации позволяет оценить подлинность и качество растительных композиций и препаратов на их основе, вести контроль за технологическим процессом, устанавливать сроки годности [17, 33, 98, 134].
На основе исследования химического состава и свойств отдельных компонентов лекарственных растений рядом авторов разработаны различные методы определения подлинности сборов, а также методы количественного определения групп биологически активных веществ. Так наиболее популярным и широко используемым методом стандартизации в последнее время становится определение суммы такой группы веществ, как флавоноиды, в пересчете на превалирующий компонент спектрофотометрическим методом с добавлением или без добавления комплексообразующей добавки - хлористого алюминия [10, 30, 78, 170].
Большинство используемых методик состоят в основном из двух этапов. Сначала получают извлечения из растительного сырья с использованием различных растворителей: этилового спирта различной концентрации, метилового спирта, ацетона или этилацетата. Впоследствии измеряют оптическую плотность непосредственно полученного раствора или после разделения/очистки с использованием различных методов хроматографии (колоночной или ТСХ), с применением спектрофотометрии, с добавлением или без добавления комплексообразовате-ля [15, 18, 43, 117].
Перспективным методом, позволяющим проводить стандартизацию лекарственных сборов и фитопрепаратов, является флуоресцентный анализ. Флуориметрия характеризуется высокими показателями чувствительности, селективности, экспрессности и точности качественного и количественного обнаружения биологически активных веществ, не требуя при этом дорогостоящего оборудования, а в ряде случаев, и проведения предварительного хроматографического разделения [42, 46].
Данными достоинствами обладает и метод хроматоденситометрии, позволяющий использовать для исследований одно извлечение (зачастую для качественного анализа получают одно извлечение, а для количественного - другое) и сочетать определение подлинности ЛРС методом ТСХ с последующим сканированием зон компонентов на пластинах и их количественной оценкой. Хромато-граммы, полученные при сканировании, позволяют определить также соотношение индивидуальных веществ в анализируемых объектах [161].
Разработка состава сбора
Одним из факторов риска развития ИБС являются изменения в работе анти-оксидантной системы, маркерами нарушения которой являются, в первую очередь, продукты перекисного окисления липидов. Инициация ПОЛ при ИБС обусловлена снижением активности естественных антиоксидантних ферментов и дефицитом антиоксидантов. Поэтому введение в сбор лекарственного растительного сырья, обладающего антиоксидантными свойствами, является весьма актуальным [89, 139, 183].
Для выбора компонентов сбора у видов ЛРС, отобранных в процессе информационно-литературного поиска, определена антиоксидантная активность согласно методике 1 по спосoности ингибиpовать аутоокисление адренaина in vitro (см. главу 2, п. 2.2.4.). Результаты исследования представлены на Результаты определения антиоксидантной активности ЛРС Антиоксидантной активностью, согласно полученным данным, обладают все исследуемые виды ЛРС в той или иной степени. Наиболее сильные антиокси-данты имеют значения АОА более 50% (плоды рябины, трава донника, плоды аронии черноплодной, трава золототысячника). Поэтому эти виды сырья в состав разрабатываемого сбора включены обязательно.
В разрабатываемый сбор необходимо ввести растения с учетом влияния на отдельные звенья этиопатогенеза ИБС: атеросклеротическое поражение сосудов, нарушения в системе гемостаза, спазм венечных артерий, артериальная гипертен-зия, гиперхолестеринемия, гипоксические синдромы, лежащие в основе нарушения деятельности антиоксидантных ферментов; нарушение трофики миокарда; тахикардия; развитие системных функциональных и эмоционально-волевых расстройств; синдром полиорганной недостаточности [26, 178, 179]. Также преследуются задачи создания «круговой обороны» организма путем введения в состав сбора компонентов антитоксического, седативного, тонизирующего действия [12, 47].
Учитывая данные патологические процессы, мы провели анализ выбранных видов ЛРС по следующим видам фармакологической активности: антиангиналь-ной, антиатеросклеротической, гипотензивной, седативной, спазмолитической, кардиотонической, антигипоксической, антиоксидантной, капилляроукрепляю-щей, улучшающей коронарное кровообращение, антикоагулянтной, диуретической и другие в соответствии с рисунком 3. Рисунок 3 - Результаты информационно-литературного поиска лекарственного растительного сырья с прогнозируемыми видами фармакологической активности.
Исходя из полученных данных (рисунки 1, 2, 3), мы отобрали 14 видов ЛРС, одновременно обеспечивающих максимальное количество необходимых фармакологических эффектов: плоды боярышника, листья мяты перечной, столбики с рыльцами кукурузы, трава мелиссы лекарственной, трава донника, листья земляники лесной, трава золототысячника, плоды рябины, плоды аронии черноплодной, корневища и корни девясила, соплодия хмеля, траву пустырника, траву полыни обыкновенной.
Для усиления седативного и добавления стресспротективного действия в состав сбора вошли корневища и корни девясила, соплодия хмеля и трава пустырника. Антистрессорное и антигипоксическое действие девясила связывают с его антиоксидантними свойствами, которые реализуются благодаря наличию в его составе селена, флавоноидов, сапонинов и витамина Е [109].
Также в состав сбора включена трава полыни обыкновенной, проявляющая мочегонное, желчегонное, антиагрегантное, седативное, спазмолитическое действие и плоды тмина, содержащие эфирные масла, в качестве спазмолитического, желчегонного, седативного компонента [81, 96, 98].
При подборе соотношений компонентов сбора учитывалась важность каждого из них для оказания терапевтического эффекта. Поэтому травы донника лекарственного, обладающего антикоагулянтной, гипотензивной, кардиотониче-ской, улучшающей коронарное кровообращение, антиатеросклеротической и ан-тиоксидантной активностью [81], и травы мелиссы лекарственной, обладающей гипотензивным, спазмолитическим, антидепрессивным, антиоксидантным и анти-гипоксическим действием [21, 208], взяли по 2 части. Всех остальных компонентов в прописи - по 1 части. К листьям мяты перечной у пациентов часто бывает повышенная чувствительность [81], поэтому она нами взята в количестве /4 части.
Составленный сбор предполагается для лечения и профилактики ИБС у людей, часто имеющих в анамнезе атеросклероз, гипертонию, гиперхолестерине-мию, сахарный диабет. Поэтому в сборе, помимо вышесказанного, учтены и компоненты, предотвращающие и смягчающие стресс (трава мелиссы лекарственной, соплодия хмеля, корневища и корни девясила), обладающие гипогликемическими (листья земляники лесной) и гипохолестеринемическими (плоды боярышника, столбики с рыльцами кукурузы, трава золототысячника) свойствами [142, 179].
Также при разработке состава сбора учитывалось то, что использоваться он будет в комплексной терапии совместно с синтетическими лекарственными средствами. Для обеспечения безопасности фармакотерапии при лечении ИБС в сборе повышают содержание лекарственных растений, смягчающих или устраняющих побочные эффекты данных препаратов. Так, при лечении Р-блокаторами целесообразно применить ЛРС с бронхолитическими (трава мелиссы лекарственной, трава донника, корневища и корни девясила, плоды тмина, листья мяты перечной), десенсибилизирующими (соплодия хмеля), мочегонными (столбики с рыльцами кукурузы, листья земяники лесной) и сосудорасширяющими свойствами (листья мяты перечной, трава мелиссы лекарственной, корневища и корни девясила,трава полыни обыкновенной, трава пустырника, соплодия хмеля, плоды тмина). Безопасность применения антагонистов кальция повышается при сочетании их с ЛРС, стабилизирующим АД, устраняющим отеки (столбики с рыльцами кукурузы, соплодия хмеля, плоды тмина), тошноту и зуд (трава мелиссы лекарственной) [97, 140]. Таким образом, биологически активные вещества сбора в разработанном составе должны обеспечить ожидаемый фармакологический эффект и фитопрофилактику побочных действий фармакопрепаратов [96,98].
Анализ фенольных соединений методом тонкослойной хроматографии
Исследование метанольного извлечения (1:10) сбора «Кардиофит» (глава 2, п.2.2.3.1) проводили методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС) с использованием газового хроматографа «Agilent» (США) модели 6890 N с масс-селективным детектором модели 5973 (глава 2, п.2.2.3.1) (рисунок 28). Рисунок 28 - Хроматограмма метанольного извлечения из сбора «Кардиофит»
При анализе полученных данных ГХ/МС было обнаружено 26 соединений, из которых идентифицированы по сравнению с библиотечными масс-спектрами 12 веществ, из них 5 фенольной природы, относящихся к группе кумаринов: кумарин, гидрокумарин, 5-метоксипсорален, эскулетин, аммоидин (таблица 4).
Анализируя данные таблицы видно, что суммарное содержание производных кумарина в пробе составило более 16%. По данным литературы, высокое содержание кумарина может обусловливать антикоагулянтные, антиагрегантные свойства разработанного сбора [76, 122, 141].
С использованием различных хроматографических методов и способов детектирования в сборе «Кардиофит» обнаружены следующие соединения феноль-ной природы: рутин, физетин, нарингин, гиперозид, кверцетин, апигенин, цинна-розид, кофейная кислота, кумарин, эскулетин, гидрокумарин, 5-метоксипсорален, аммоидин.
Согласно полученным данным, в сборе были определены такие товароведческие показатели, как влажность и общая зола, а также содержание первичных метаболитов - белков, липидов и углеводов (глюкозы, клетчатки и крахмала), ка-ротиноидов, некоторых макро- и микроэлементов и аминокислот.
Анализируя данные таблицы 5, можно сказать, что полученные результаты влажности и общей золы сопоставимы с экспериментальными данными таблицы 17, где данные показатели определялись с использованием фармакопейных методик.
Обычно в фармакогностическом анализе практически не исследуется содержание первичных метаболитов, но на наш взгляд это является актуальным, так как данные группы веществ могут выступать не только как сопутствующие или балластные соединения, но и как действующие.
Аминокислоты, содержание которых установлено в данных исследованиях, могут участвовать в различных обменных процессах, влияющих на работу сердца и сосудов. Известно, что метионин и лейцин способны стимулировать ослабленную сердечную деятельность, улучшая обменные процессы. Снижение уровня серотонина и L-аргинина создает условия для вазоконстрикции кровеносных сосудов, что ведет к повреждению сосудистой стенки и активации адгезии тромбоцитов [180].
Всего было идентифицировано 14 аминокислот, девять из которых являются незаменимыми, две - частично заменимыми и три - заменимыми [165]. Согласно полученным данным (таблица 5), сбор «Кардиофит» может являться дополнительным источником незаменимых аминокислот.
В ходе проведенных исследований в сборе «Кардиофит» установлено наличие aличных мaкро- и микoлементов. Такие макро- и микроэлементы как, например, калий, марганец и др., используются в терапии сердечно-сосудистых заболеваний [57, 71], поэтому сбор может рассматриваться с точки зрения их природного источника.
Нарушения сердечно-сосудистой системы (тахикардия, аритмия, экстрасис-толия и т.п.) очень часто являются клиническими проявлениями заболеваний щитовидной железы. Поэтому лечение нарушений ритма сердца заодно может сопровождаться и профилактикой, лечением тиреотоксикоза [26].
С этой целью проведена оценка количественного содержания йода в сборе (см. главу 2, п. 2.2.3.2). Биологическая роль йода заключается в обеспечении нормального состояния и функционирования щитовидной железы. Без гормонов щитовидной железы невозможно нормального функционирования нервной, сердечно-сосудистой, опорно-двигательной систем. Иодсодержащие средства растительного происхождения легче усваиваются организмом человека, и в растениях, помимо йода, содержится большое количество биологически активных веществ, которые помогают усвоить йод. Содержание йода в сборе составило 0,061±0,002 мг% в пересчете на абсолютно сухое сырье [150]. Следовательно, сбор может рассматриваться как дополнительный источник йода.
Сборы обычно выпускаются в виде фасованной продукции или в фильтр-пакетах, следовательно, их использование предполагается в виде водного извлечения. В состав сбора «Кардиофит» входят различные морфологические группы ЛРС, следовательно, в соответствии с ГФ XI возможно получение водных извле 76 чений 2 типов: настои и отвары [42]. Проведенными нами ранее экспериментальными исследованиями установлено, что сухой остаток и содержание таких групп БАВ, как флавоноиды, дубильные вещества и аскорбиновая кислота в настое выше, чем в отваре сбора [169]. Поэтому количественное содержание обнаруженных в ходе проведения качественных реакций и хроматографического исследования групп БАВ определяли не только в сборе, но и водном извлечении из сбора по методикам, описанным в главе 2, п. 2.2.3.2.