Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Сведения литературы по растениям рода Euphrasia L. – очанка 14
1.1. Ботанико-географическая характеристика растений рода Euphrasia L. семейства норичниковые – Scrophulariaceae L 14
1.2. Современное состояние исследований химического состава растений рода Euphrasia L 18
1.3. Сведения по использованию растений рода Euphrasia в медицине и изучению фармакологического действия 26
1.4. Маркетинговый анализ ассортимента растительных средств, используемых для профилактики и лечения заболеваний глаз 30
Выводы к главе 1 33
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Характеристика объектов исследования 35
2.2. Методики фармакогностического исследования 36 2.3.Методики фитохимического исследования
2.3.1. Качественные аналитические реакции 36
2.3.2. Хроматографические методы 41
2.3.3. Методики количественного определения БАВ 48
2.4. Выделение индивидуальных соединений, методики проведения кислотного и ферментативного гидролиза
2.5. Спектральные исследования 57
2.6. Стандартные образцы веществ сравнения и реактивы 57
2.7. Статистические методы анализа 58
ГЛАВА 3. Фитохимическое изучение euphrasia pectinata, произрастающей в Восточной Сибири 60
3.1. Анализ качественного состава биологически активных веществ с использованием аналитических реакций 60
3.2. Обнаружение биологически активных веществ бумажной и тонкослойной хроматографией 61
3.3. Выделение и идентификация флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и иридоидов E. pectinata 64
3.4. Исследование компонентного состава фенольных соединений E. pectinata методом ВЭЖХ 71
3.5. Исследование компонентного состава эфирного масла E. pectinata методом хромато-масс-спектрометрии 72
3.6. Анализ аминокислот E. pectinata 73
3.7. Элементный состав E. pectinata 74
3.8. Количественное определение биологически активных веществ в надземных органах E. pectinata 77
3.9. Особенности накопления фенольных соединений и иридоидов в E. pectinata, произрастающей на территории Иркутской области и Республики Бурятия 3.9.1. Количественное определение БАВ в различных органах и по фазам вегетации в E. pectinata 78
3.9.2. Исследование динамики накопления фенольных соединений в
E. pectinata методом ВЭЖХ 80
Выводы к главе 3 84
ГЛАВА 4. Стандартизация и разработка нормативной документации на сырье «очанки гребенчатой трава» 87
4.1. Разработка показателей подлинности 87
4.1.1. Макро- и микроскопический анализ травы E. pectinata 87
4.1.2. Разработка методик качественных реакций и ВЭЖХ для
определения подлинности сырья E. pectinata 95
4.2. Адаптация методики количественного определения суммы
флавоноидов в траве E. pectinata 98
4.3. Разработка числовых показателей и определение срока годности сырья E. pectinata 107
4.4. Изучение ресурсов E. pectinata на территории Иркутской области и Республики Бурятия 112
Выводы к главе 4 113
ГЛАВА 5. Разработка и стандартизация сбора «эуфразин» 115
5.1. Разработка рецептуры сбора «Эуфразин» 115
5.1.1. Обоснование состава сбора «Эуфразин» 115
5.1.2. Установление оптимального соотношения компонентов сбора «Эуфразин» 119
5.2. Определение внешних и микроскопических признаков сбора «Эуфразин» 121
5.3. Исследование химического состава сбора «Эуфразин» 128
5.3.1. Товароведческий анализ компонентов сбора «Эуфразин» 128
5.3.2. Изучение компонентного состава эфирного масла травы мелиссы лекарственной и цветков лабазника вязолистного 130
5.4. Исследование химического состава сбора «Эуфразин» 132
5.4.1. Исследование состава биологически активных веществ сбора «Эуфразин» 132
5.4.2. Изучение состава фенольных соединений сбора «Эуфразин» методом ВЭЖХ 133
5.4.3. Исследование компонентного состава эфирного масла сбора «Эуфразин» методом хромато-масс-спектрометрии 134
5.4.4. Анализ состава аминокислот сбора «Эуфразин» 135
5.4.5. Анализ элементного состава сбора «Эуфразин» 136
5.5. Количественное определение основных групп БАВ сбора «Эуфразин» 139
5.6. Стандартизация сбора «Эуфразин» 140
5.6.1.Разработка методик качественного анализа БАВ для определения подлинности сбора «Эуфразин» 140
5.6.2. Адаптация методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов и ее валидация 142
5.6.3.Разработка числовых показателей и определение сроков годности сбора «Эуфразин» 149
Выводы к главе 5 152
Общие выводы 154
Список литературы 156
- Современное состояние исследований химического состава растений рода Euphrasia L
- Хроматографические методы
- Выделение и идентификация флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и иридоидов E. pectinata
- Разработка числовых показателей и определение срока годности сырья E. pectinata
Введение к работе
Актуальность. В последние годы значительно возросла потребность медицинской практики в использовании отечественных лекарственных средств (Леонидов Н.Б., 2014). Актуальны вопросы создания лекарственных средств на основе индивидуального растительного сырья и сборов (Самылина И.А., 2014). Многокомпонентные сборы обладают широким спектром фармакологического действия, мягко и гармонично воздействуют на системы организма при минимальном количестве побочных эффектов в условиях длительного применения.
Растения рода Euphrasia L. сем. Scrophulariaceae на территории России и
сопредельных стран представлены 73 видами. Наибольшее число видов
встречается в Европейской части России (31 вид) и в Сибири (29 видов).
Растения рода Euphrasia содержат комплекс биологически активных веществ
(БАВ), таких как флавоноиды, иридоиды, дубильные вещества,
фенолкарбоновые кислоты, стероиды, кумарины (Гусарова Г.А., 2000). Растения рода Euphrasia перспективны для разработки фитопрепаратов с антиоксидантной, антикоагулянтной, гипотензивной, антимикробной и противовоспалительной активностью (Петриченко В.М., 2005; Кроткова О.А., 2012). В европейских странах некоторые представители рода Euphrasia являются фармакопейными видами (E. rostkoviana Hayne = E. officinalis L., E. stricta D. Wolff ex J. F. Lehm.=E. condensate Jord.) (Blazics B., 2008).
В Восточной Сибири широко распространена и имеет достаточную
сырьевую базу очанка гребенчатая (Euphrasia pectinata Ten.). В народной
медицине настой и спиртовые извлечения из надземных органов применяются
при глазных заболеваниях, гастроэнтеритах, нарушениях памяти, для снижения
кровяного давления, как противовоспалительное средство
(Телятьев В.В., 1987). По сведениям данных литературы, химический состав видов рода Euphrasia сибирского региона изучен недостаточно, кроме того, растения рода Euphrasia представляют собой географо-морфологические расы, и их экологическая пластичность требует изучения видов из разных точек ареала (Гусарова Г.А., 2000).
Применение в народной медицине, недостаточность изученности химического состава E. pectinata, произрастающей на территории Восточной Сибири, является основанием для углубленного изучения этого вида, проведения исследований по стандартизации сырья, а также перспективна разработка на ее основе новых лекарственных средств.
Степень разработанности темы исследования.
В отечественной литературе имеются сведения по изучению отдельных групп БАВ E. pectinata Уральского региона. Зарубежные исследователи (Турция, Италия, Армения) приводят данные о содержании иридоидов и фенилэтаноидов в надземной части E. pectinata. Предварительными фармакологическими исследованиями установлена для экстракта сухого E. pectinata антикоагулянтная и антирадикальная активность.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось
фитохимическое изучение надземной части Euphrasia pectinata,
произрастающей в Восточной Сибири, разработка и стандартизация сбора, обладающего антиоксидантным, ноотропным и противовоспалительным действием.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить состав флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, эфирного
масла, иридоидов, аминокислот, макро- и микроэлементов Е. pectinata,
произрастающей в Восточно-Сибирском регионе.
-
Определить количественное содержание основных групп биологически активных соединений в Е. pectinata, изучить закономерности их накопления по органам, фазам развития, в зависимости от места произрастания и обосновать рациональные сроки заготовки сырья.
-
Установить макро- и микроскопические признаки сырья Е. pectinata и провести его стандартизацию.
4. Разработать состав сбора с антиоксидантной, ноотропной, и
противовоспалительной активностью (условное название «Эуфразин»).
-
Изучить состав флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, эфирного масла, аминокислот и минеральных веществ сбора «Эуфразин».
-
Провести стандартизацию сбора, разработать показатели и нормы качества сбора.
7. Разработать проекты нормативной документации на сырье Е. pectinata
и сбор «Эуфразин».
Научная новизна. Впервые проведено фармакогностическое исследование Е. pectinata, произрастающей на территории Восточной Сибири. В надземных органах Е. pectinata идентифицировано 19 фенольных соединений, в том числе впервые для вида - рутин, гиперозид, лютеолин, диосметин-7-<9-уЗ-/)-глюкуронид, нарингин, актеозид, о-кумаровая кислота, 5-(9-кофеилхинная кислота, о-метоксикумарин, дикумарин, танин, эпигаллокатехингаллат, мальвидин-3-О-І-арабинозид. Показано, что для Е. pectinata характерно накопление глутаминовой, аспарагиновой кислот, фенилаланина, лейцина и лизина. Впервые определен состав эфирного масла Е. pectinata, в котором идентифицировано 20 компонентов. Выявлено, что максимальное содержание флавоноидов, окисляемых (дубильных) веществ, полисахаридов, иридоидов характерно для надземных органов в период цветения.
Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена рациональность состава 5-компонентного сбора «Эуфразин», обладающего антиоксидантным, ноотропным и противовоспалительным действием (патент РФ № 2560077 от 20.05.2015 г.). В химическом составе сбора идентифицировано 16 фенольных соединений (флавоноиды - цинарозид, лютеолин, гиперозид, рутин, дигидрокверцетин; фенолкарбоновые кислоты -галловая кислота, феруловая кислота, изоферуловая кислота, 3-О-кофеилхинная кислота, цикоревая кислота, кофейная кислота), 22 аминокислоты, 23 компонента эфирного масла, 64 элемента.
Практическая значимость. Разработаны методики определения подлинности сырья Е. pectinata с применением метода микроколоночной ВЭЖХ и сбора «Эуфразин» - метода ТСХ. Адаптированы и валидированы
методики спектрофотометрического количественного анализа суммарного содержания флавоноидов в траве E. pectinata в пересчете на цинарозид и в сборе «Эуфразин» в пересчете на рутин. Разработан проект ФС «Очанки гребенчатой трава – Euphrasiae pectinatae herba», инструкция по сбору сырья E. pectinata, установлены места произрастания, пригодные для заготовки сырья на территории Иркутской области и Республики Бурятия. Определены числовые показатели, нормы качества и сроки годности сбора «Эуфразин». Разработан проект ФСП на сбор «Эуфразин». Материалы диссертации вошли в методическое пособие «Определение подлинности цельного лекарственного растительного сырья» (Иркутск, 2014), которое внедрено в учебный процесс на кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии, на факультете повышения квалификации провизоров ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России. Результаты исследований по стандартизации сырья E. pectinata и сбора «Эуфразин» внедрены в работу контрольно-аналитической лаборатории ООО «Иван-чай» (г. Ангарск).
Методология и методы исследования.
Методология исследования заключается в анализе сведений литературы
по теме диссертационной работы, оценке степени разработанности и
актуальности темы. В работе использовались современные физико-химические
методы исследования: тонкослойная и бумажная хроматография,
высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хромато-масс-
спектрометрия, ионообменная хроматография, спектрофотометрия,
титриметрия.
На защиту выносятся:
- результаты фитохимического изучения E. pectinata, исследования
закономерностей накопления БАВ в E. pectinata по органам растения, фазам
развития и в зависимости от места произрастания;
результаты макро- и микроскопического исследования E. pectinata и стандартизации сырья E. pectinata;
результаты по разработке компонентного состава и стандартизации сбора «Эуфразин».
Личное участие автора. Автором самостоятельно проведена работа по
анализу сведений литературы по теме диссертационной работы, запланированы
и выполнены экспериментальные исследования, обработаны и
проанализированы полученные результаты. Соискателем подготовлены доклады, тезисы, статьи, оформлена диссертация и автореферат.
Апробация полученных результатов. Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012); межрегиональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2013, 2014, 2015); Всероссийской Байкальской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с
международным участием «Актуальные вопросы современной медицины»
(Иркутск, 2012, 2013, 2014, 2015); I Всероссийской заочной научно-
практической конференции «Новые технологии в промышленности и сельском
хозяйстве» (Бийск, 2012); пятой международной дистанционной научной
конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2013); научно-методической
конференции «II Гаммермановские чтения» (Санкт-Петербург, 2014);
Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Инновационные технологии в фармации» (Иркутск, 2014, 2015); 80-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых учных с международным участием «Молоджная наука и современность» (Курск, 2015).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных
научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Иркутский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской
Федерации по комплексной теме «Изучение перспективных лекарственных
растений Восточной Сибири» (номер государственной регистрации
01.2.00304320).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пунктам 3 и 6.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 5 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МОиН РФ и 1 патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 50 таблицами и 42 рисунками. Библиографический указатель включает 182 источника, из них 52 - на иностранных языках.
Современное состояние исследований химического состава растений рода Euphrasia L
Содержание каротиноидов в растениях рода Euphrasia варьирует от 0,26 до 0,40 мг/г. Наибольшее их количество обнаружено в Е. parviflora, а наименьшее - в траве Е. х reuteri и Е. tatarica [58, 118].
В гексановых извлечениях, полученных из травы растений рода Euphrasia, произрастающих в Пермском крае, Кротковой О.А. обнаружено 16 липофильных компонентов, доминирующими являются: высшие алканы (октадекан, нонадекан, гексакозан, октакозан, нонакозан, эйкозан), а так же -ситостерол и его предшественник сквален [58, 59].
При изучении количественного содержания окисляемых веществ в траве и органах видов рода Euphrasia (Е. tatarica, Е. х murbeckii, Е. stricta), произрастающих на территории Уральского региона установлено влияние на их содержание экологических условий произрастания. Наибольшее содержание окисляемых веществ определено в траве Е. х murbeckii (9,72%), произрастающей в Свердловской области, а наименьшее (2,83%) в траве Е. х murbeckii, собранной в Пермском крае [54, 109]. В растениях рода Euphrasia, произрастающих в Пермском крае Кротковой О.А. установлено среднее содержание флавоноидов - 6,11%; иридоидов - 0,33%; окисляемых веществ - 7,81%. Наибольшее количественное содержание иридоидов установлено для плодов, стеблей и корней [59]. Шестаковой Т.С. с соавторами изучен элементный состав Е. brevipila. Было установлено содержание 18 элементов, составляющих в порядке убывания следующий ряд: Р Мп Ва Sr Zn Ті Ni Си Zr Cr Co Nb V Pb = Mo Ga Be Ag [76, 125]. Сведения по использованию растений рода Euphrasia в народной медицине относятся к наиболее распространенным видам Е. brevipilla, Е. caucasica, Е. hirtella, Е. pectinata, Е. stricta, Е. rostkoviana. В народной медицине эти виды не различаются и применяются под названием очанка лекарственная [84].
В народной медицине извлечения из растений рода Euphrasia используются наружно при заболеваниях глаз. Делают промывания и компрессы при остром и хроническом конъюнктивите, блефарите, глаукоме, воспалении слезных мешочков, ячмене, а также при слабости зрения [41, 75, 99, 103, 147].
Настои и отвары из травы растений рода Euphrasia применяются наружно при экземах и дерматите, используются для полосканий при ангине, внутрь – при воспалительных заболеваниях верхних дыхательных путей при бронхитах, при гастритах, энтеритах и колитах, при нарушениях памяти, головной боли [84, 130, 149].
Спиртовые извлечения из растений рода Euphrasia оказывают лечебное действие при гипосекреции желудка, анорексии, заболеваниях печени, гипертонической болезни, склерозе, нарушении памяти, при головной боли, истерии и ревматизме, для рассасывания опухолей и нагноений [33, 63, 99].
В литературе имеются данные об использовании травы растений рода Euphrasia как противоопухолевого и гипогликемического средства [12, 61, 172].
В Белоруссии настои из травы растений рода Euphrasia применяют при диатезе и экземе, при лихорадке, моют голову для улучшения роста волос, порошком засыпают раны [61].
В Болгарии растения рода Euphrasia используют при болезнях носа, горла, бронхите, как укрепляющее средство, в Западной Европе – при бронхите с трудно отделяющейся слизью, при коревом катаре, гриппе [33].
В ряде стран E. rostkoviana и E. stricta являются фармакопейными растениями. Они входят в фармакопею Германии, Британии, Польши, Швейцарии и Франции и используются при заболеваниях глаз воспалительного характера, при дегенеративно-дистрофических нарушениях (помутнение хрусталика, возрастная катаракта), для профилактики и начальной стадии глаукомы, как противовоспалительное и антисклеротическое средство [65, 164].
Препараты, полученные на основе E. brevipila, E. reuteri и E. parviflora (водные и спиртовые извлечения), в эксперименте обладают широким спектром фармакологического действия [104]. Благодаря сочетанию разных групп химических соединений, они оказывает вяжущее, противовоспалительное и антимикробное действия. В эксперименте экстракты жидкие и настойки (1:5), полученные на 70% спирте этиловом, подавляли рост Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Экспериментально установлено гипотензивное действие сухих экстрактов этих растений, полученных с помощью воды и 70% спирта этилового [7, 25].
На модели каррагенинового отека задней конечности крыс доказана противовоспалительная активность экстракта сухого спиртового и экстракта жидкого E. brevipila. На пике воспаления экстракт сухой снижал отек на 44-66%, экстракт жидкий на 29-62% дозозависимо [73].
Кротковой О.А. проведена сравнительная оценка антикоагулянтной активности сухих водных и спиртовых экстрактов из долговегетирующих растений рода Euphrasia флоры Пермского края. Результаты исследований показали, что наиболее высокая антикоагулянтная активность отмечается у спиртовых экстрактов из травы E. reuteri, E. stricta (на 21,3%), у водного экстракта из E. murbeckii, а так же водного и спиртового экстрактов из E. parviflora. Также установлена антирадикальная активность у изученных видов рода Euphrasia [59].
Водный экстракт в эксперименте сужает кровеносные сосуды, возбуждает и усиливает деятельность сердечной мышцы, повышает артериальное давление; водный и спиртовой – проявляют гипотензивные свойства, фунгицидную и цитотоксическую активность [90, 98].
Simon J.E. проведены фармакологические исследования фракций иридоидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот E. officinalis. Наибольшей антиоксидантой активностью обладают фенолкарбоновые кислоты и флавоноиды. Противовоспалительную же активность в большей степени проявляли фракции иридоидов и фенолкарбоновых кислот, чем фракция флавоноидов [176]. Антиоксидантная активность иридоидов E. officinalis подтверждена исследованиями Blazics B. с соавт. и Dimitrova M. с соавт. [135, 142].
Сухой экстракт E. brevipila при экспериментальном гепатите индуцирует систему микросомального окисления и стимулирует регенерацию печени. 10% раствор экстракта сухого снижает артериальное давление, урежает ритм сердечных сокращений [38, 128, 129]. Сухой экстракт из E. brevipila, полученный 40% спиртом этиловым обладал противовоспалительной и гипотензивной активностью [73]. Липосомальные глазные капли на основе настоя E. brevipila в эксперименте проявляли противовоспалительное действие, снижая гиперемию коньюктивы глаза, вызванную введением раствора скипидара в растительном масле, в сравнении с контролем в 2 раза [51].
Клинические испытания глазных капель на основе травы растений рода Euphrasia, проведенные офтальмологами Германии и Швейцарии, показали эффективность и безопасность их использования при различных воспалениях конъюнктивы, в том числе при ожогах, покраснении, ощущениях инородного тела, при помутнении хрусталика и потере зрения [173].
В Пермском НПО «Биомед» из E. brevipila по оригинальной технологии разработана биологически активная добавка (БАД) к пище «Уральская очанка» в виде капель и таблеток. Результаты доклинических испытаний БАД «Уральская очанка» свидетельствуют, что она не токсична, не проявляет аллергенных и тератогенных свойств, угнетает рост патогенной флоры, стимулирует рост и функциональную активность полезной флоры кишечника, обладает иммуномодулирующей активностью [72, 90, 120].
Хроматографические методы
Исследование динамики накопления БАВ в E. pectinata в условиях Восточной Сибири ранее не проводилось. Для установления оптимальных сроков заготовки сырья E. pectinata необходимо было изучить распределение основных БАВ, отвечающих за фармакологическую активность, по органам растения и исследовать зависимость их количественного содержания по фазам вегетации растения.
Для изучения накопления БАВ по органам растения исследовали сырье E. pectinata, собранное в период цветения. Максимальное содержание окисляемых (дубильных) веществ отмечается в листьях и цветках с прицветными листьями, стебли и корни накапливают этих соединений в 2 и 5,7 раза меньше, чем листья соответственно. В траве (олиственные стебли длиной до 15 см) E. pectinata накапливается 5,38±0,09% окисляемых (дубильных) веществ (рис. 12).
Максимальное количество флавоноидов и фенолкарбоновых кислот накапливается в листьях и цветках с прицветными листьями. Стебли накапливают этих соединений почти в 2 раза меньше, чем листья. В траве найдено флавоноидов 2,39±0,09%, фенолкарбоновых кислот 2,74±0,1% (рис. 12).
Листья, цветки и корни E. pectinata характеризуются высоким содержанием суммы иридоидов. В стеблевых листьях содержится 3,29±0,12% иридоидов, в цветках с прицветными листьями 3,15±0,15% в корнях – 3,50±0,14%. Стебли накапливают в 1,6 раза иридоидов меньше, чем стеблевые листья (рис. 12). Корни E. pectinata слабо развитые, т.к. это растение полупаразитарное, и поэтому не представляют интереса для заготовки в сырье.
Окис (дубильн ляемые ые) веще :тва Фл аво нои цы Фенолкарбоновые кислоты Иридоиды Рисунок 12 - Содержание фенольных соединений и иридоидов в E. pectinata, произрастающей в Восточной Сибири (Сырье E. pectinata собрано в период цветения, место сбора: Иркутская обл., Иркутский р-он., окр. с. Ново-Грудинино).
Далее мы провели изучение накопления БАВ в траве E. pectinata по фазам вегетации. Установлено, что в фазу вегетации в E. pectinata содержание окисляемых (дубильных) веществ составляло 3,81±0,12%, в период цветения количество окисляемых (дубильных) веществ возрастает до 5,38±0,09%, затем к началу плодоношения количество окисляемых (дубильных) веществ уменьшается. В фазу плодоношения окисляемых (дубильных) веществ содержится 3,55±0,17% (рис. 13).
В фазу вегетации содержание суммы флавоноидов составляло 2,05±0,06%, в период цветения и начала плодоношения 2,39±0,09 и 2,20±0,11% соответственно. В фазе плодоношения количество суммы флавоноидов снижается до 1,82±0,09% (рис.13).
Количественное содержание фенолкарбоновых кислот от фазы вегетации к периоду цветения и началу плодоношения увеличивается в среднем в 1,5 раза. В фазу плодоношения содержание фенолкарбоновых кислот снижается до 1,51±0,06% (рис. 13).
Максимальное содержание иридоидов в траве E. pectinata отмечается в период цветения и начала плодоношения и составляет 3,31±0,13% и 3,15±0,1% соответственно (рис.13).
Таким образом, установлено, что максимальное количество БАВ в E. pectinata накапливается в листьях, цветках с прицветными листьями и траве (олиственные стебли длиной до 15 см) в период цветения и начала плодоношения.
Зависимость распределения фенольных соединений по органам растения, фазам вегетации и в зависимости от места произрастания исследовали также методом ВЭЖХ (условия хроматографирования 2). На рисунке 14 приведен пример хроматограммы спиртового извлечения, полученного из травы E. pectinata, собранной в Иркутской обл., в окрестностях с. Ново-Грудинино.
При анализе не произошло разделение пиков кофейной кислоты и рутина, поэтому в таблицах 11 и 12 приведены данные по содержанию суммы этих соединений в пересчете на кофейную кислоту.
3-О-кофеилхинную кислоту накапливают все надземные органы E. pectinata, наибольшее количество содержится в листьях – 3,99±0,12 мг/г. В них 3-О-кофеилхинной кислоты накапливается на 30% больше, чем в цветках. Стебли содержат 3-О-кофеилхинную кислоту в небольшом количестве – 0,15±0,01 мг/г.
Кофейная кислота и рутин накапливаются у E. pectinata в цветках и в стеблях. В листьях эти соединения не обнаружены. Флавоноловый гликозид гиперозид накапливают все надземные органы E. pectinata в количестве от 0,14±0,03 до 0,22±0,01 мг/г (табл. 11). Изучение накопления флавоновых гликозидов цинарозида и диосметин-7-О--D-глюкуронида показало, что больше всего этих соединений накапливают листья и цветки. В стеблях цинарозида и диосметин-7-О--D-глюкуронида накапливается меньше, чем в листьях
Выделение и идентификация флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и иридоидов E. pectinata
Для определения подлинности 10 г сбора помещали на чистую гладкую поверхность и в ней определяли составные компоненты по внешнему виду, рассматривая их невооруженным глазом и с помощью стереомикроскопа при увеличении Х10.
Внешние признаки. Кусочки листьев, стеблей, бутонов, цветков и плодов, а также отдельные цветки и листья, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет зеленый, буровато-зеленый, с пурпурно-желтыми, оранжевыми и фиолетовыми вкраплениями. Запах ароматный. Вкус водного извлечения (1:10) горьковато-пряный, слегка вяжущий.
Исследование микроскопических диагностических признаков сбора «Эуфразин» проводили в соответствии со статьями «Сборы» (ГФ XI, вып. 1, стр. 266-267) и «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ XI, вып. 1, стр. 277 122 282) и рекомендациями Самылиной И.А. c соавторами по анализу сборов и измельченного сырья [79, 89, 116].
Для каждого компонента сбора выбирали 25-30 однородных по внешнему виду кусочков сырья. Из нескольких отобранных кусочков готовили микропрепараты по методике приготовления микропрепаратов из измельченного лекарственного растительного сырья.
Плоды черники и плоды шиповника входят в состав сбора в виде крупных порошков, т.е. частиц размером 2 мм. Выделяли частицы, соответствующие каждому компоненту и готовили микропрепараты по методике приготовления микропрепаратов из порошка [36].
Из мелких, трудно распознаваемых частиц сбора, проходящих сквозь сито 0,25 мм, готовили микропрепараты по методике приготовления микропрепаратов порошка.
При исследовании микропрепаратов компонентов сбора под микроскопом видны: - фрагменты эпидермиса листа с извилистостенными клетками и устьицами аномоцитного типа, простые одно- и двухклеточные волоски с нежнобородавчатой поверхностью; головчатые волоски с одно- и двухклеточной головкой и одно-, двухклеточной ножкой; железки с одноклеточной головкой на одноклеточной ножке (трава очанки гребенчатой) (рис. 33). - фрагменты листа с извилистостенным эпидермисом и устьицами диацитного типа. Железки 6-8 клеточные округлые. На эпидермисе многочисленные простые волоски с бородавчатой кутикулой, а также сосочковидные и конусовидные волоски. Головчатые волоски на одноклеточной или двухклеточной ножке с одноклеточной головкой (трава мелиссы лекарственной) (рис. 34). эпидермис лепестков слегка извилистостенный, с верхней стороны бугорчатый, а с нижней – гладкий, клетки эпидермиса чашелистиков удлиненные извилистостеннные с бугорчатой поверхностью. На наружной стороне встречаются одноклеточные, остроконечные, извилистые волоски. Многочисленные фрагменты тычинок – пыльники и тычиночные нити (цветки лабазника вязолистного) (рис. 35).
Цветки лабазника вязолистного: А – фрагмент эпидермиса лепестка венчика (Ув.150); Б – фрагмент чашечки с одноклеточными извилистыми волосками (Ув.200), В – фрагмент тычинки (пыльник) (Ув.200), Г – фрагмент тычиночной нити (Ув.200). - фрагменты экзокарпия в виде клеток эпидермиса с неравномерно утолщенными боковыми стенками, редкие устьица аномоцитного типа; во фрагментах мезокарпия встречаются сосуды проводящего пучка с удлиненными волокнообразными остроконечными склереидами, крупные тонкостенные часто деформированные клетки паренхимы с темным зернистым содержимым, каменистые клетки двух типов: тонкостенные овальные и толстостенные пористые разнообразной формы; фрагменты семенной кожуры состоящие из удлиненных клеток с сильно утолщенными пористыми стенками желто-коричневого цвета (плоды черники обыкновенной) (рис 36).
Плоды черники обыкновенной: А - эпидермальные клетки экзокарпия (Ув.200), Б – сосуды проводящего пучка и склереиды (Ув.100), В – тонкостенные каменистые клетки (Ув.200), Г – толстостенные каменистые клетки (Ув.150), Д - пористые каменистые клетки семенной кожуры (Ув.200). - фрагменты гипантия - эпидермальные клетки с утолщенными многоугольными стенками, обрывки мякоти плода, состоящие из тонкостенных паренхимных клеток, содержащих оранжево-красные глыбки каротиноидов и многочисленные друзы оксалата кальция, обрывки проводящих пучков; фрагменты орешков - группы толстостенных каменистых клеток с пористыми стенками; одноклеточные волоски двух типов или их обломки – очень крупные прямые с толстой стенкой и узкой полостью и более мелкие, слегка извилистые с широкой полостью (плоды шиповника) (рис. 37).
Порошок. Диагностическими значимыми признаками для мелкого порошка сбора «Эуфразин» являются фрагменты листьев с простыми одноклеточными и многоклеточными волосками, фрагменты листьев с эфиромасличными железками с головками одноклеточными и состоящими из 6-8 радиально расположенных клеток, фрагменты тычиночных нитей, фрагменты чашечки с одноклеточными извилистыми волосками, каменистые клетки, эпидермис с многоугольными стенками, извилистостенный эпидермис с устьицами диацитного типа, а также фрагменты эпидермиса с аномоцитными устьицами, крупные одноклеточные волоски (рис. 38).
Проведен товароведческий анализ отдельных компонентов сбора «Эуфразин» на соответствие нормативной документации по показателям подлинность и доброкачественность: плоды черники (ГФ XI, ст. 35, стр. 291), цветки лабазника вязолистного (ВФС 42-1777-87), трава мелиссы лекарственной (ФС 42-3645-98), плоды шиповника (ГФ XI, ст. 38, стр. 294), трава очанки лекарственной (проект ФС) [Приложение 2]. В работе использовались образцы сырья собственного сбора: трава очанки гребенчатой, цветки лабазника вязолистного, плоды шиповника, плоды черники. Заготовка сырья производилась в Иркутской области. Траву мелиссы лекарственной приобретали через аптечную организацию.
Разработка числовых показателей и определение срока годности сырья E. pectinata
Микроэлементы являются неотъемлемой частью биохимических процессов, они входят в состав ферментов, гормонов, витаминов и биологически активных веществ в качестве комплексообразователей и других биологических процессов. Дисбаланс микроэлементов способен привести к различным патологическим процессам в организме [46, 108].
Установлено, что у обследованных, с ранее установленной патологий зрительного аппарата, наблюдается дефицит таких элементов, как селен, марганец, хром, кобальт, цинк, ванадий, молибден, медь, калий, кальций, фосфор. Введение легкоусвояемых микроэлементов природного происхождения в комплексную терапию глазной патологии позволяет добиваться более лучших терапевтических эффектов [107]. Сбор «Эуфразин» может быть дополнительным источником легкоусвояемых природных макро-и микроэлементов.
Аскорбиновая кислота. Для анализа использовали титриметрический метод (стр. 49). Содержание аскорбиновой кислоты в сборе составило 0,11 мг±0,005%
Флавоноиды (в пересчете на рутин). Количественное содержание флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом, по методике нами адаптированной для анализа сбора (стр. 50). Содержание флавоноидов в сборе составило 2,14 ±0,06% (табл. 40).
Антоцианы. Методом бумажной хроматографии (стр. 42) в составе сбора были идентифицированы антоциановые соединения, производные мальвидина (цианидин-3-О-глюкозида и мальвидина). Количественное содержание антоцианов, определенное спектрофотометрически (стр. 52) составило 2,17 ± 0,05% (табл. 40).
Окисляемые (дубильные вещества). В сборе «Эуфразин» определено содержание окисляемых (дубильных) веществ 8,25±0,04% (табл. 40).
Сбор «Эуфразин» обладает антиоксидантным, ноотропным и противовоспалительным действием, что определяется присутствием в его составе флавоноидов и антоцианов, поэтому нами предлагаются для определения подлинности качественные реакции на эти группы БАВ; а также хроматографические методы.
Методика обнаружения флавоноидов. Около 1 г измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл 50% спирта этилового и нагревают на водяной бане в течение 15 мин. Затем извлечение фильтруют через бумажный фильтр и упаривают до 1 мл. К полученному извлечению прибавляют 1 мл 95% спирта этилового, 0,1 г порошка магния и 1 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, нагревают на водяной бане 5 мин. Постепенно появляется красное окрашивание.
Методика обнаружения антоцианов. Около 1 г сырья помещают в колбу вместимостью 50 мл, добавляют 20 мл 95 % спирта этилового, содержащего 1% хлористоводородной кислоты концентрированной. Соединяют колбу с обратным холодильником и нагревают на водяной бане в течение 15 мин. Извлечение охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр. Получают извлечение красного цвета. К 1 мл извлечения прибавляют несколько капель 10 % раствора свинца ацетата основного (появляется осадок синего цвета).
Государственного стандартного образца (ГСО) гиперозида. Около 0,025 г (точная навеска) ГСО гиперозида (ФС 42-0106-03), предварительно высушенного при температуре 130-1350С в течение 3 часов, растворяют в 15 мл 95% спирта этилового в мерной колбе вместимостью 25 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают. Срок годности раствора 1 мес.
Проявление: пластинку опрыскивают 1% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревают 2-3 минуты при 1000–1050С. Через 15 мин пластинку просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.
Результаты: Проявляются пятна по значению Rf и окраске совпадающие с лютеолином, рутином и гиперозидом. Допустимо появление других пятен (рис. 39). Верх хроматографической пластины
Лютеолин: зона желтого цвета Гиперозид: зона желтого цвета Рутин: зона желтого цвета Зона желтого цвета Зона желтого цвета Зона желтого цвета Зона желтого цвета
Для анализа сбора «Эуфразин» нами предложена методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом в присутствии алюминия хлорида. В результате изучения спектральной характеристики спиртового извлечения сбора «Эуфразин» в присутствии алюминия хлорида установлено, что максимум поглощения находится при 412 нм (рис. 40).
Спектр поглощения извлечения совпадает с максимумом ГСО рутина в присутствии алюминия хлорида (412 нм), поэтому расчет процентного содержания суммы флавоноидов в сборе «Эуфразин» можно проводить в пересчете на рутин.
Далее были установлены оптимальные параметры экстракции сырья: степень измельчённости сырья, характер экстрагента, соотношение сырья и экстрагента, продолжительность экстракции и кратность экстракции.
. МаксимальноеУстановлено оптимальное количенство комплексообразователя 1% спиртового раствора алюминия хлорида – 1 мл, время комплексообразования – 40 мин. Первоначально был проведен подбор экстрагента, извлекающего максимальное количество флавоноидов. Исследования проводились с сырьем со степенью мелкости 1 мм. Как видно из таблицы 41 максимальное количество флавоноидов извлекается 50% спиртом этиловым. Дальнейшее увеличение концентрации этанола ведёт к снижению выхода суммы флавониодов. Установлено, что оптимальным экстрагентом является 50% спирт этиловый. На выход БАВ в значительной степени оказывает влияние степень измельчения сырья. Оптимальный размер частиц сырья для сбора составляет 1 мм. Увеличение размера частиц снижает выход БАВ (табл. 41). Время экстракции, при котором извлекается максимальное количество флавоноидов, составляет 60 минут. Далее исследовали влияние на экстракцию флавоноидов соотношения сырья и экстрагента количество флавоноидов извлекается при соотношении сырья и экстрагента 1:100 и соответствует исчерпывающей экстракции (табл. 41).