Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фармакогностическое описание, химический состав и методы анализа основных действующих веществ 17
1.1. Ботаническая и фармакологическая характеристика сырья 17
1.1.1. Морфологические признаки исследуемого растения 17
1.1.2. Места обитания, ареал, заготовка сырья 17
1.1.3. Химический состав исследуемого растения 18
1.2. Звездчатка средняя как средство фитотерапии. 19
1.3. Физико - химические свойства, методы анализа основных действующих веществ травы звездчатки средней 20
1.3.1. Общая характеристика углеводов и аминокислот 20
1.3.2. Качественный и количественный анализ углеводов в растительном сырье 22
1.3.3. Определение аминокислот в сырье и фитопрепаратах 26
1.3.4. Методы анализа флавоноидов в сырье и фитопрепаратах 29
1.3.5. Определение сапонинов в сырье и фитопрепаратах 34
1.3.6. Методы определения аскорбиновой кислоты. 37
Выводы к I главе. 41
Глава 2. Объекты и методы исследования 43
2.1. Объекты исследования. 43
2.2. Методы исследования. 43
2.2.1. Анализ аминокислотного состава. 43
2.2.2. Анализ углеводного состава. 44
2.2.3. Методы анализа флавоноидов. 45
2.2.4. Экстрактивные вещества. 47
2.2.5. Количественное определение сапонинов спектрофотометрическим методом. 48
2.2.6. Определение влажности сырья. 48
2.2.7. Определение золы общей 49
2.2.8. Определение золы, нерастворимой в 10 % хлористоводородной кислоте 50
2.2.9. Статистическая обработка. 51
2.2.10. Морфолого-анатомическое исследование. 51
Глава 3. Исследование анатомо-диагностических признаков травы звездчатки средней 53
3.1. Изучение анатомического строения травы звездчатки средней 53
3.2. Анатомо - диагностические признаки стебля. 56
3.3. Анатомо - диагностические признаки листа. 57
3.4. Анатомо - диагностические признаки цветков. 59
Выводы к III главе. 61
Глава 4. Исследование качественного состава и количественного содержания основных действующих веществ в траве звездчатки средней . 62
4.1. Исследование качественного состава звездчатки средней (мокрицы) методом ВЭЖХ 62
4.2. Исследование качественного состава флавоноидных соединений в траве звездчатки средней. 67
4.3. Количественное определение флавоноидов в траве звездчатки средней. 74
Выводы к IV главе. 82
Глава 5. Определение углеводов, аминокислот, витаминов и сапонинов в траве звездчатки средней (мокрицы) 84
5.1 Определение углеводов. 84
5.1.1. Исследование качественного состава углеводов в траве звездчатки средней 84
5.2. Исследование аминокислотного состава звездчатки средней 91
5.3. Количественное определение витамина С и витамина В1 в траве звездчатки средней методом ВЭЖХ. 94
5.4. Подбор условий и разработка методик определения сапонинов в траве звездчатки средней 99
5.4.1. Установление присутствия сапонинов в траве звездчатки средней 99
5.4.2. Разработка методики количественного определения сапонинов в траве звездчатки средней 101
Выводы к V главе. 123
Глава 6. Разработка технологий и методик стандартизации гомеопатических матричных настоек из травы звездчатки средней 124
6.1. Разработка технологии гомеопатических матричных настоек 124
6.1.1. Настойка гомеопатическая матричная из свежего сырья. 124
6.1.2. Настойка матричная гомеопатическая из высушенного сырья. 126
6.2. Стандартизация гомеопатических матричных настоек из свежей и высушенной травы звездчатки средней . 126
Выводы к VI главе. 134
Общие выводы 134
Литература 137
Приложение 154
- Качественный и количественный анализ углеводов в растительном сырье
- Исследование качественного состава звездчатки средней (мокрицы) методом ВЭЖХ
- Разработка методики количественного определения сапонинов в траве звездчатки средней
- Стандартизация гомеопатических матричных настоек из свежей и высушенной травы звездчатки средней
Качественный и количественный анализ углеводов в растительном сырье
Определение углеводов по методу Бертрана. Растворимые углеводы извлекаются из растительного материала горячей дистиллированной водой. В одной части фильтра определяют моносахариды, в другой - после гидролиза соляной кислотой ди- и трисахариды, которые распадаются при этом до глюкозы. Метод Бертрана основан на способности альдегидной группы сахаров взаимодействовать с реактивом Фелинга и восстанавливать окись меди до закиси меди, выпадающей в виде осадка красного цвета. Определение растворимых углеводов фотометрически с пикриновой кислотой (модификация Соловьева). Моносахариды имеющие альдегидную или кетонную группировку, могут восстанавливать динитросоединения, при этом образуются интенсивно окрашенные соединения. Окраска пропорциональна количеству углеводов в реакции, поэтому возможно их колориметрическое определение. Используют реакцию восстановления пикриновой кислоты в пикраминовую [53, 56]. Подлинность лекарственного растительного сырья подтверждают качественными реакциями. Фармакопейными (ГФ ХI, вып. 2) являются следующие:
- на инулин: 1) альфа-нафтол и конц. серная кислота окрашивает корни одуванчика в фиолетово-розовый цвет; 2) альфа-нафтол и конц. серная кислота окрашивает корневища и корни девясила. красно-фиолетовый цвет, тимол и конц. серная кислота - в оранжево-красный цвет.
- на слизь: 1) раствор аммиака (NH3) или едкого натра (NаОН) окрашивает корни алтея в желтый цвет; 2) при смачивании водой цветки липы ослизняются; 3) на порошок семян льна выполняют гистохимическую реакцию с раствором туши. Полисахариды листьев подорожника большого и слоевищ ламинарии осаждаются из водного извлечения 95% спиртом. Образующиеся после кислотного гидролиза восстанавливающие сахара ламинарии дают реакцию с реактивом Фелинга, образуется оранжево-красный осадок. В листьях подорожника большого образующаяся после кислотного гидролиза галактуроновая кислота дает реакцию с карбазолом, появляется красно-фиолетовое окрашивание. При помощи качественных реакций чаще выявляются слизи. Под влиянием раствора NaOH они приобретают лимонно-желтоватый цвет, пoд воздействием метиленового синего - голубой. На фоне черной туши слизь имеет вид бесцветных сгустков. Количественное определение полисахаридов ГФ ХI, вып. 2 предлагает для листьев подорожника большого и слоевищ ламинарии. Метод определения гравиметрический (весовой), основанный на осаждении полисахаридного водного извлечения 95% спиртом. Стадии анализа: 1) экстракция полисахаридов водой; 2) осаждение полисахаридов из водного извлечения 95% спиртом; 3) высушивание осадка и доведение его до постоянной массы. В слоевищах ламинарии, кроме того, определяют содержание йода после сжигания навески бром йодометрическим методом. Там же определяют содержание песка (SiO2). В сырье алтея, липы, льна, мать-и-мачехи, подорожника блошного количественного определения биологически активных веществ и экстрактивных веществ не проводят [89,111].
При исследовании качественного и количественного состава углеводов в плодах бархата амурского было установлено, что в качестве свободных сахаров присутствует фруктоза и глюкоза: содержание фруктозы колеблется (от 15,7 до 16,1%), глюкозы (от 15,1 до 18,3%). Связанные сахара представлены глюкозой и ксилозой: содержание глюкозы от 1,1 до 1,8%, ксилозы от 0,83 до 0,95% [62, 65].
В нашей работе определено содержание свободных сахаров в траве звездчатки средней прямофазной ВЭЖХ, а связанных углеводов методом капиллярного электрофореза. Установлено, что связанных сахаров больше (8,18%), чем свободных (0,84%). Свободные сахара представлены глюкозой 0,32% и фруктозой 0,52%. Связанные сахара арабинозой 2,10%, ксилозой 0,70%, глюкозой 3,28%, галактозой 2,10% [79].
При определении в почках черной смородины свободных сахаров методом прямофазной ВЭЖХ, связанных сахаров методом капиллярного электрофореза установлено, что связанных сахаров больше (9,55 %), чем свободных (6,85%). Связанные сахара представлены арабинозой, глюкозой и галактозой. Свободные сахара – глюкозой и фруктозой [86].
В листьях и корневищах с корнями валерианы лекарственной методом ВЭЖХ определено, что свободные сахара представлены глюкозой, фруктозой и сахарозой. Связанные сахара – арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой [38].
Исследование качественного и количественного состава углеводов в цветках, листьях, корневищах с корнями первоцвета лекарственного показало, что свободные сахара содержатся только в цветках (фруктоза, глюкоза, сахароза). Общая сумма свободных сахаров 9,24 %. Связанные сахара содержатся во всех частях растения (арабиноза, ксилоза, глюкоза, галактоза). Наибольшее содержание связанных сахаров в корневищах и корнях первоцвета [10].
В листьях и настое крапивы двудомной определены полисахариды гравиметрическим и спектрофотометрическим методом с применением раствора пикриновой кислоты. Стандартным раствором служила глюкоза. Содержание полисахаридов в листьях крапивы при определении гравиметрическим методом составляло 5,62%, спектрофотометрическим методом – 4,07%. В настое из листьев крапивы полисахаридов гравиметрическим методом найдено 0,21%, а спектрофотометрическим методом – 0,31% [77].
Методом фракционирования полисахариды выделяли из хамериона узколистного. Количественное содержание фракций определяли гравиметрическим методом. Моносахаридный состав комплексов после гидролиза раствором серной кислоты определяли методом восходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей: н-бутанол – пиридин вода (6:4:3); этилацетат – уксусная кислота – муравьиная кислота – вода (8:3:1:4); н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5). Хроматограмму обрабатывали анилинфталатным реактивом и 1 % раствором резорцина. В составе моносахаридов обнаружено 17 веществ, из которых идентифицированы: арабиноза, ксилоза, глюкоза, сахароза, фруктоза, D-глюкуроновая кислота, рамноза [15].
После гидролиза устанавливали качественный углеводный состав травы очанки коротковолосчатой методом распределительной бумажной хроматографии в системе растворителей: н-бутанол – пиридин – вода (6:4:3) нисходящим способом. В составе углеводов доминируют моносахариды (3,9 %). Моносахаридными компонентами углеводных фракций являются: глюкоза, галактоза, арабиноза и ксилоза [8]. Для гравиметрического определения полисахаридов в листьях подорожника предложена модифицированная фармакопейная методика. Методика использована для анализа листьев подорожника большого, подорожника среднего и подорожника ланцетного. Во всех образцах подорожника содержание полисахаридов составляет от 11 до 22 % [37].
В водном комплексе мать-и-мачехи и во всех других фракциях (ПВ) и (Гц, А, В) определяли содержание уроновых кислот спектрофотометрическим методом по реакции с карбазолом (с добавлением сульфониловой кислоты). Установлено суммарное содержание полисахаридов и полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот составило 30,8 % [72].
Исследование качественного состава звездчатки средней (мокрицы) методом ВЭЖХ
Согласно данным литературы в траве звездчатки средней содержатся биологически активные вещества: каротин, следы эфирного масла, синаловую кислоту, аскорбиновую кислоту, витамин Е, тритерпеновые сапонины, флавоноиды, дубильные вещества и высшие алифатические спирты [118].
Ранее методом ТСХ и с помощью цветных реакций установлено, что в траве мокрицы содержатся углеводы, аминокислоты, стероидные тритерпеноиды, флавоноиды, дубильные вещества, аскорбиновая кислота. Установлен компонентный состав и количественное определение углеводов и аминокислот в траве звездчатки средней.
Задачей настоящих исследований было: идентифицировать основные биологически активные вещества (БАВ) в траве звездчатки средней с помощью ВЭЖХ, что позволяет объективно и достоверно установить компонентный состав данного сырья.
Предварительно для идентификации БАВ травы звездчатки приготавливали извлечение на 70 % этаноле в соотношении (сырье-экстракт) 1:50 (раствор А).
При определении оптимальных условий хроматографирования устанавливали длину волны детектирования. Известно, что существование форм соединений предопределяет исследование спектральных характеристик и хроматографических характеристик водно-спиртовых извлечений исследуемого объекта. При этом для качественной оценки достаточно, чтобы спектральные характеристики БАВ, в основном, совпадали со спектром стандартных образцов.
Спектры поглощения растворов стандартных образцов представлены на рис. 8
Из анализа спектров поглощения растворов стандартных образцов и водно-спиртовых извлечений из травы звездчатки средней, что представлены на рис. 8 и 9, имеют место совпадения характеров спектров в области от 200 до 360 нм. Это позволяет полагать, что при детектировании хроматографического процесса при длине волны 210 – 300 нм можно идентифицировать соединения как высокополярные, так и малополярные.
В то же время детектирование при длине волны 255 нм позволяет выявить и качественно оценить содержание витамина В1, аскорбиновой, галловой, эллаговой кислот, суммарное содержание флавоноидов, кумаринов.
Сущность методики состоит в том, что предварительно проводят очистку водно-спиртового извлечения травы звездчатки (раствор А) путем фильтрования через микропористый фильтр, отбрасывая первые миллилитры фильтрата.
Очищенный испытуемый раствор и раствор модельной смеси РСО витамина В1, аскорбиновой, галловой, эллаговой кислот, рутина, ксантоксина и кверцетина хроматографируют на жидкостном хроматографе высокого давления, укомплектованном системой градиентной подачей элюента, УФ диодноматречным детектором или с перестраиваемой длиной волны, а также компьютерной системой сборки и обработки данных. Вычисляют площади пиков растворов стандартных образцов и площади пиков испытуемого образца. Получают не менее пяти хроматограмм для каждого из растворов в следующих условиях:
- колонка 250 на 4,6 мм; сорбент Сromosil 100-5C18 с размером частиц 5 мкм;
- температура термостата 380 С;
- длина волны детектирования 255 нм;
- подвижная фаза: ацетонитрил (А), 0,1 % раствор фосфорной кислоты (В);
На рис. 10, 11 представлены хроматограммы водно-спиртового извлечения из травы звездчатки средней и РСО модельной смеси.
Идентификацию компонентов проводят по характеру совместимости спектров поглощения каждого хроматографического пика и по времени удерживания РСО стандартных образцов.
В результате проведенных исследований идентифицированы основные биологически активные вещества травы звездчатки средней: витамин В 1; аскорбиновая кислота; галловая кислота; эллаговая кислота; рутин; кверцетин; ксантотоксин.
Разработка методики количественного определения сапонинов в траве звездчатки средней
Количественное определение сапонинов проводили спектрофотометрическим методом, в основе которого лежит способность сапонинов давать окрашивание с кислотой серной концентрированной.
При снятии спектров поглощения продуктов реакции стандарта эсцина и извлечения из травы звездчатки средней с кислотой серной концентрированной на регистрирующем спектрофотометре Cary – 50 установлено, что максимум поглощения находится при длине волны 325 нм. Результаты представлены на рис. 25.
Спектры поглощения сапонинов с кислотой серной концентрированной
Из рис. 25 следует, что максимумы спектров поглощения раствора эсцина и извлечения из травы звездчатки средней совпадают.
Выбор рабочих концентраций осуществляли путем построения калибровочного графика стандарта эсцина. С помощью калибровочного графика установили, что калибровочная кривая зависимости между концентрацией и оптической плотностью носит линейный характер в пределе концентраций от 0,00025 до 0,001 %. Наименьшее определяемое количество эсцина 0,0025 мг/мл.
Установлено также, что максимум оптической плотности анализируемого раствора достигается через 20 мин и сохраняется неизменным в течение 20 мин.
Удельный показатель поглощения продуктов реакции эсцина с кислотой серной концентрированной 222,45 нами взят из литературы [13].
Оптимальные условия экстракции сапонинов из сырья были изучены путем анализа: степень измельченности сырья, экстрагент, соотношение сырья и экстрагента, температура и время экстракции.
Результаты представлены в табл. 13.
Из табл. 13 видно, что оптимальными условиями экстракции являются: экстрагент – 70 % этанол; соотношение сырья и экстрагента – 1:50; измельченность сырья – 2 мм; температурный режим экстракции – кипящая водяная баня; время экстракции – 60 мин, (двукратно: 45 и 15 мин).
Для очистки извлечения применен метод смены растворителей и колоночная хроматография с оксидом алюминия.
Полученные результаты были использованы для создания методики количественного определения сапонинов в траве звездчатки.
Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.
Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 60 мл 70 % этанола, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин. Извлечение охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы сырье не попало на фильтр. В колбу с сырьем опять отмеривают 40 мл 70 % этанола, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу и доводят объем раствора в колбе 70 % этанолом до метки, перемешивают (раствор А).
2 мл раствора А помещают в выпарительную чашку и выпаривают досуха на кипящей водяной бане. Сухой остаток помещают в стеклянную колонку диаметром 1 см и длинной 25 см с 3 г алюминия оксида. Выпарительную чашку промывают 5 мл воды и помещают раствор в ту же колонку. Когда раствор пройдёт через колонку, выпарительную чашку с элюентом ставят на кипящую водяную баню и выпаривают элюент досуха. Сухой остаток количественно перенося 96 % этанолом в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем раствора в колбе доводят 96 % этанолом до метки и перемешивают (раствор Б)
В пробирку с притертой пробкой отмеривают 2 мл раствора Б, осторожно по стенке пробирки прибавляют 8 мл кислоты серной концентрированной и перемешивают. Через 30 минут измеряют оптическую плотность полученного раствора с помощью спектрофотометра при длине волны 325 ± 5 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь 2 мл 96% этанола с 8 мл кислоты серной концентрированной.
Содержание сапонинов (Х) в пересчете на эсцин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
С помощью разработанной методики возможно определить тритерпеновые сапонины с достаточной точностью относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает + 5 %.
Для определения систематической ошибки был использован метод добавок стандарта эсцина. Полученные результаты представлены в табл. 15.
Систематические ошибки отсутствуют, т.к. относительная ошибка метода добавок меньше относительной ошибки единичного определения.
Построение калибровочного графика.
Количественное определение сапонинов методом спектрофотометрии.
Валидация методики проведена по параметрам линейности, повторяемости воспроизводимости и правильности методики.
Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций. Был приготовлен исходный раствор эсцина (Fluka, 02320) (точная навеска) с концентрацией 0,1% затем из него готовили разбавленный раствор А.
Для приготовления раствора А точную навеску эсцина растворяют в 90 мл 70% этанола в мерной колбе вместимостью 100 мл. После полного растворения доводят объем раствора в колбе 70% этанолом до метки и перемешивают (раствор А).
Используют 5 мерных колб вместимостью 50 мл. Переносят раствор А в соответствующие колбы согласно табл.16.
Объем раствора в колбе доводят 70% этанолом до метки и перемешивают. Берут пять пробирок с притертыми пробками. В первую пробирку отмеривают 2 мл содержимого первой колбы, во вторую- 2мл содержимого второй колбы, в третью- 2 мл содержимого третьей колбы, в четвертую- 2 мл содержимого четвертой колбы, в пятую- 2 мл содержимого пятой колбы. В каждую пробирку добавляют по 8 мл с кислоты серной концентрированной и тщательно перемешивают.
Через 30 мин измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра при длине волны 325 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют кислоту серную концентрированную.
Стандартизация гомеопатических матричных настоек из свежей и высушенной травы звездчатки средней
Анализ проводили по нормативной документации, разработанной нами.
Определяли следующие показатели: «описание», «подлинность», «сухой остаток», «плотность», «тяжелые металлы», «микробиологическая чистота», «количественное определение», «хранение», «срок годности».
Определение подлинности настойки гомеопатической матричной проводили методом тонкослойной хроматографии. В качестве подвижной фазы использовали смесь: н-бутанол – кислота ледяная уксусная – вода (50:10:40); в качестве неподвижной фазы – готовые хроматографические пластинки со слоем силикагеля типа «Сорбфил». В качестве сравнения – раствор эсцина. Обнаружение зон на хроматограмме осуществляли 10 % раствором кислоты серной в 40 % этаноле.
Определение содержания тяжелых металлов проводили в соответствии с требованиями ГФ ХII, ч. 1, с. 121, ОФС 42-0059-07.
Сухой остаток определяли в соответствии с требованиями ГФ ХI, ч. 2, с. 149. Определение плотности осуществляли в соответствии с требованиями ГФ ХII, ч. 1, с. 38, ОФС 42-0037-07.
Определение микробиологической чистоты проводили в соответствии с требованиями ГФ ХII, ч. 1, с. 160, ОФС 42-0067-07.
Для количественного определения сапонинов использовали метод спектрофотоколориметрии. Метод основан на свойстве сапонинов - давать окрашивание с кислотой серной концентрированной.
В качестве стандарта был выбран эсцин, спектр поглощения которого с кислотой серной концентрированной совпадает со спектром поглощения настойки в указанных условиях и находится при длине волны 325 + 3 нм
После валидации была проведена стандартизация настоек гомеопатических матричных.
Плотность и сухой остаток настоек гомеопатических матричных из свежей травы звездчатки проводили по методикам ГФ ХI издания.
Результаты представлены в табл. 18.
Раздел «Хранение» представлен в соответствии с требованиями современной нормативной документации. Срок годности настойки гомеопатической матричной предложен на основании результатов изучения стабильности при хранении.
Из табл. 19 видно, что образцы настоек изменялись незначительно после 2,5 хранения и удовлетворяли требованиям проекта ФС.
По результатам изучения стабильности при хранении по показателям, предложенным в проекте ФС, предлагаем установить срок годности 2 года.
По разработанной технологии были приготовлены и проанализированы три образца настойки гомеопатической матричной из высушенной травы звездчатки средней. Полученные результаты представлены в табл. 20.
Из табл. 20 видно, что плотность гомеопатической матричной настойки из высушенного сырья колеблется от 0,9146 до 0,9202; сухой остаток от 2,00 до 2,52 %; содержание сапонинов от 0,41 до 0,43 %.
Для установления срока годности настойки, образцы после проверки по всем показателям, указанным в проекте ФС, были поставлены на хранение в условиях и упаковке, предусмотренных проектом ФС. Образцы периодически анализировали. Полученные результаты представлены в табл. 21
На основании полученных данных рекомендуем установить срок годности настойки 2 года.
На следующем этапе были проведены исследования по сопоставлению качества гомеопатических матричных настоек из свежего сырья, полученных методом мацерации и настоек гомеопатических матричных, полученных из высушенного сырья методом перколяции. Полученные результаты представлены в табл. 22.