Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. F. Uniflorum перспективное экдистероидсодержащее растение
1.1. Адаптогены растительного происхождения 12
1.2. Характеристика растений рода Fornicium семейства Asteraceae 17
1.2.1. Ботаническая характеристика F. Uniflorum 19
1.3. Химический состав растений рода Fornicium 20
1.4. Фитоэкдистероиды 22
1.5. Лекарственные средства на основе растений рода Fornicium и их 27
применение
Выводы к главе 1 29
Экспериментальная часть 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
ГЛАВА 3. Фармакогностическая характеристика F. Uniflorum
3.1. Определение урожайности и запасов лекарственного растительного сырья F. uniflorum на конкретных фитоценозах
3.2. Характеристика внешних признаков F. uniflorum 43
3.3. Микроскопический анализ F. uniflorum 45
3.3.1.Анатомо-диагностические признаки F. uniflorum травы 46
3.3.2 Анатомо-диагностические признаки F. uniflorum корневищ с 50
корнями
3.4. Товароведческий анализ F. uniflorum травы и корневищ с корнями
Выводы к главе 3 53
ГЛАВА 4. Химическая характеристика f. uniflorum травы и корневищ с корнями
4.1. Обнаружение основных групп биологически активных веществ с помощью качественных реакций
4.2. Обнаружение биологически активных веществ методом бумажной хроматографии
4.3. Идентификация биологически активных веществ методом тонкослойной хроматографии
4.4. Идентификация фенольных соединений методом 58
высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.5. Идентификация жирных кислот F. uniflorum травы и корневищ с корнями
4.6. Идентификация аминокислот, органических кислот, витаминов группы В, свободных сахаров методом капиллярного электрофореза
4.7. Минеральный состав F. uniflorum травы и корневищ с корнями 73
4.7.1. Идентификация йода в F. uniflorum траве и корневищах с 75 корнями
4.8. Углеводный комплекс F. uniflorum корневищ с корнями 76
4.9. Количественное определение биологически активных веществ F. uniflorum травы и корневищ с корнями
4.9.1. Определение содержания флавоноидов в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
4.9.2. Определение содержания суммы органических кислот в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
4.9.3. Определение содержания дубильных веществ в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
4.9.4. Определение содержания аскорбиновой кислоты в F. uniflorumтраве и корневищах с корнями
4.9.5.Определение содержания аминокислот в F. uniflorum траве и 84
корневищах с корнями
4.9.6. Определение содержания общего белка в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
Выводы к главе 4. 89
ГЛАВА 5. Разработка методик количественного определения биологически активных веществ В F. Uniflorum траве и корневищах с корнями
5.1. Разработка методики количественного определения суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
5.1.1. Обоснование методики количественного определения суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
5.1.2.Оптимальные условия экстрагирования суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон из F. uniflorum травы и корневищ с корнями
5.1.3. Валидация методики количественного определения суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
5.2. Разработка методики количественного определения суммы полисахаридов и свободных сахаров в пересчете на глюкозу в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
5.2.1. Обоснование методики количественного определения суммы полисахаридов и свободных сахаров в пересчете на глюкозу в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
5.2.2. Оптимальные условия экстрагирования суммы полисахаридов и свободных сахаров в пересчете на глюкозу из F. uniflorum травы и корневищ с корнями
5.2.3. Валидация методики количественного определения суммы полисахаридов и свободных сахаров в пересчете на глюкозу в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
5.3. Исследование динамики накопления суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон и суммы полисахаридов и свободных сахаров в пересчете на глюкозу в различных органах и по фазам вегетации в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
Выводы к главе 5 124
ГЛАВА 6. Разработка экстракта сухого из f. uniflorum корневищ с корнями и его стандартизация
6.1. Оптимизация условий экстрагирования F. uniflorum корневищ с корнями
6.2.Технологическая схема получения F. uniflorum экстракта сухого
6.3. Минеральный состав F. uniflorum экстракта сухого 133
6.4. Количественное содержание биологически активных веществ в F. uniflorum экстракте сухом
6.4.1. Определение содержания аскорбиновой кислоты 134
6.4.2. Определение содержания дубильных веществ 135
6.4.3. Определение содержания суммы органических кислот 136
6.5. Разработка показателей качества F. uniflorum экстракта сухого 136
Выводы к главе 6 145
Общие выводы 146
Список литературы
- Ботаническая характеристика F. Uniflorum
- Характеристика внешних признаков F. uniflorum
- Идентификация биологически активных веществ методом тонкослойной хроматографии
- Валидация методики количественного определения суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
Ботаническая характеристика F. Uniflorum
Необходимость широкого применения в медицинской практике адаптогенных лекарственных средств обусловлено тем, что одним из самых распространенных неблагоприятных факторов в настоящее время являются многочисленные стрессовые ситуации, которые существенно снижают качество жизни человека, ухудшают общее самочувствие, могут приводить к нервному и физическому истощению. Мобилизация функционирования адаптивного механизма возможна лишь при одновременном воздействии на все напряженные и нарушенные звенья метаболизма. Этому требованию наилучшим образом могут отвечать препараты природного происхождения, что обусловлено полифункциональностью их фармакологического действия [69].
Адаптогены обладают особым сочетанием своеобразных фармакологических свойств: будучи нетоксичными веществами, эти препараты проявляют анаболические свойства, которые обусловливают физиологическую стимуляцию функций защитных систем организма, т.е. вводят организм в состояние неспецифически повышенной сопротивляемости. Адаптогены оказывают стимулирующее действие и способствуют возрастанию сопротивляемости по отношению к разным неблагоприятным воздействиям. Важно подчеркнуть, что адаптогенными свойствами обладают главным образом препараты природного происхождения или соединения, представляющие собой естественные метаболиты. Определенными адаптогенными свойствами, проявляющимися в регуляции функции системы иммунитета, обладают некоторые полисахариды, вакцины, а также синтетические препараты-стимуляторы «экономизирующего» типа действия. Однако наиболее отличительными признаками типичных адаптогенов (кроме достаточно выраженных антистрессорных свойств) следует считать, определенные стимулирующие свойства, а также профилактическое действие, проявляющееся в подготовке систем организма к нагрузкам [97, 129].
Адаптация или приспособление к условиям существования – одно из основополагающих качеств живого организма. Начиная с момента рождения, человек попадает в совершенно новые для себя условия и вынужден приспособить к ним деятельность всех своих органов и систем. В дальнейшем в ходе индивидуального развития факторы, действующие на организм, непрерывно видоизменяются, порой приобретая необычайную силу или характер, что требует постоянных функциональных перестроек. Таким образом, процесс приспособления организма к природным, производственным и социальным условиям представляет собой универсальное явление [100]. Современный период развития общества сопровождается ухудшением экологической обстановки, психоэмоциональными стрессами, которые оказывают негативное влияние на состояние здоровья человека и являются причиной роста так называемых «болезней цивилизации». В условиях воздействия неблагоприятных факторов, особое значение приобретают проблемы, связанные с разработкой способов сохранения неспецифической сопротивляемости организма, позволяющие обеспечить высокий уровень работоспособности и здоровья в современных условиях жизни. Из большого числа применяемых в профилактических и лечебных целях лекарственных препаратов большое значение приобретают природные адаптогены [9, 12].
По мнению Н.В. Лазарева (2012 г), адаптогенное действие лекарственных средств обусловлено развитием в организме «состояния неспецифически повышенной сопротивляемости» (СНПС) [129]. Оно выявляется, как правило, в тех случаях, когда необходимо напряжение компенсаторно-защитных механизмов организма, причём СНПС выражается двояким образом: в виде повышения устойчивости к дополнительным нагрузкам (например, повышение работоспособности) и в виде регулирующего эффекта, симптомом последнего можно считать более быструю нормализацию возникших при различных состояниях сдвигов, независимо от того, в какую сторону эти отклонения направлены. Важным свойством веществ, обладающих адаптогенным действием, является их регулирующий, нормализующий эффект, наступающий независимо от направленности предшествующих сдвигов [1, 31]. Н.В. Лазаревым и его учениками доказано, что в состоянии неспецифически повышенной сопротивляемости организм в значительной степени защищен не только от физических и химических повреждений, но и от различных заболеваний, в том числе и тех, которые являются основными причинами смертности -сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [129]. Адаптогены способны, с одной стороны, защищать организм от разного рода разрушающих воздействий, а с другой - потенциировать приспособительные и восстановительные процессы, усиливая фазу следовой адаптивной суперкомпенсации и соответствующие ей изменения обмена веществ в организме [100]. Основными свойствами адаптогенов считают следующие: безвредность; широта терапевтического действия; свойство действовать независимо от направленности сдвигов и тем выраженнее, чем глубже изменения (конечно, до определенных пределов); увеличение работоспособности; способность вводить организм в СНПС или по возможности приближать организм к этому состоянию путем:
Характеристика внешних признаков F. uniflorum
В мерную колбу, вместимостью 25 мл помещали 1 мл раствора А и доводили объем раствора 70% спиртом до метки и перемешивали.
Приготовление ванилин-серного реактива: 3,0 г ванилина помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 30 мл спирта 96 %, прибавляли 0,5 мл серной кислоты концентрированной и доводили до метки спиртом 95%. Срок годности раствора – 1 месяц.
Приготовление реактива Бредфорда: в мерную колбу вместимостью 500 мл помещали 0,05 г кислотного синего 90 (Кумасси брилиантовый синий R-250), растворяли в 25 мл спирта 96 %, прибавляли 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводили объем раствора водой до метки и тщательно перемешивали. Раствор фильтровали. Хранят в банках темного стекла при комнатной температуре. Срок годности раствора – 1 месяц.
Приготовление СО альбумина: около 0,05 г (точная навеска) СО альбумина растворяли водой очищенной в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора до метки водой, перемешивали. Срок годности раствора 10 дней.
Приготовление растворов сравнения для высокоэффективной жидкостной хроматографии фенольных соединений: по 0,05 г рутина, кверцетина, лютеолина, цинарозида, аскорбиновой, галловой кислоты, кофейной кислоты, цикориевой кислоты, хлорогеновой кислоты, гиперозида,, апигенина, феруловой кислоты, изоферуловой, неохлорогеновой кислоты, о-метоксикумарина, кумарина, дигидрокверцитина, катехина, экдистерона, эпигаллокатехина, кемпферола помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в 30 мл спирта 70%, доводили объемы растворов до меток тем же растворителем и перемешивали. Срок годности растворов – 3 мес.
Приготовление растворов РСО туркестерона, СО экдистерона, РСО интегристерона, РСО 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона для высокоэффективной жидкостной хроматографии: по 0,004г (точная навеска) туркестерона, 0,01г (точная навеска) экдистерона, 0,0082г (точная навеска) интегристерона, 0,0085г (точная навеска) 2-дезокси-20 гидроксиэкдизона помещали в мерные колбы вместимостью 10 мл, растворяли в 5 мл спирта 95 %, доводили объем растворов до метки тем же растворителем и перемешивали. Срок годности раствора 1 мес.
Электронные спектры соединений в УФ- и видимой областях записывали на приборе CФ-2000 (Россия) и ПЭ-5400 УФ в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Для регистрации УФ – спектров исследуемых веществ готовили 0,05-10 % растворы в 96 % спирте, а также в 70 % спирте.
Спектрофотометрическое определение БАВ проводили с помощью спектрофотометра CECIL CE 2011 (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 cм.
Капиллярный электрофорез
Количественное определение аминокислот, органических кислот, свободных сахаров и витаминов группы B проводили методом капиллярного электрофореза с использованием методик [130]:
1. M-04-38-2009. Методика измерений определения протеиногенных аминокислот в комбикормах и сырье, методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ-105/105М». Данный метод основан на извлечении свободных форм аминокислот из образцов, разделении, идентификации и определении массовых концентраций аминокислот методом капиллярного электрофореза.
Использовали капилляр Lэфф/Lобщ = 75/65, внутренний диаметр – 50 мкм; напряжение – 25 kV; полярность – положительная; ввод пробы – 300мбар с; температура – 30 C; фосфатный буфер с добавкой -циклодекстрина; объем пробы – 50 мкл. Детектирование аминокислот проводили по их собственному поглощению при длине волны 254 нм.
2. М-04-74-2012. Методика определения органических кислот и их солей в кормах и кормовых добавках методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ-105/105М». Данный метод основан на извлечении кислот из твердых проб или разбавлении жидких проб водой очищенной, разделении и количественном определении компонентов методом капиллярного электрофореза.
Использовали капилляр Lэфф/Lобщ = 40/50, внутренний диаметр – 50 мкм; напряжение – 17 kV; полярность – отрицательная; ввод пробы – 300мбар с; температура – 20 C; объем пробы – 50 мкл. Детектирование органических кислот проводили по их собственному поглощению при длине волны 190 нм.
3. М-04-69-2011. Напитки. Плодовоовощная продукция. БАД. Мед. Определение фруктозы, глюкозы и сахарозы методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ 105/105М". Метод основан на экстракции сахаров из твердых проб водой очищенной и последующим разделении и количественном определении анализируемых компонентов методом капиллярного электрофореза.
Использовали капилляр Lэфф/Lобщ = 65/75, внутренний диаметр – 50 мкм; напряжение – 25 kV; полярность – отрицательная; ввод пробы – 150мбар с; температура – 20 C; сорбат калия с добавкой цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ), pH 12,1; объем пробы – 50 мкл. Детектирование сахаров проводили косвенным способом, регистрируя поглощение при длине волны 254 нм.
4. M-04-72-2011. Методика измерений содержания свободных форм водорастворимых витаминов в премиксах, витаминных концентрах, смесях и добавках, в том числе жидких, методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ-105/105М». Данный метод основан на извлечении свободных форм водорастворимых витаминов из образцов, разделении, идентификации и определении массовых концентраций витаминов методом капиллярного электрофореза. Использовали капилляр Lэфф/Lобщ = 65/75, внутренний диаметр - 50 мкм; напряжение - 25 kV; полярность - положительная; ввод пробы - 600мбар с; температура - 30 C; боратный буфер с рН 8,9; объем пробы - 50 мкл. Детектирование витаминов проводили по их собственному поглощению при длинах волн 200 нм и 267 нм, используя программируемое переключение длин волн.
Идентификация биологически активных веществ методом тонкослойной хроматографии
Таким образом, определены запасы F. uniflorum травы в шести ценопопуляциях в двух районах Республики Бурятия и трех районах Забайкальского края, корневищ с корнями – в одной ценопопуляции в Иволгинском районе Республики Бурятия. Урожайность воздушно-сухого сырья травы этого вида в шести ценопопуляциях составила от 23,84 до 42,88 г/м2, а для корневищ с корнями составила 91,87 г /м2. Эксплуатационный запас F. uniflorum травы в исследуемых фитоценозах составил 1277,84 кг, а возможный объем заготовки – 255,58 кг. Для F. uniflorum корневищ с корнями эксплуатационный запас сырья в Иволгинском районе составил 603,76 кг, а возможный объем заготовки - 120,75 кг.
Внешние отличительные признаки устанавливали для цельного и измельченного сырья F. uniflorum травы и корневищ с корнями в соответствии с ОФС 1.2.1.0005.15 «Травы» [78]. Для описания внешнего строения взяты особи F. uniflorum из разных районов Республики Бурятия и Забайкальского края. Анализ образцов проводили путем визуального осмотра, с помощью лупы и бинокуляра. Плоды растения собраны в период плодоношения в конце августа 2014-2015 г.
Из данных (таблица 2) следует, что размеры органов растения варьируют. Предлагается установить норму размеров органов для цельного сырья: стебли до 60 см, листья – длина от 5 см до 27 см, ширина от 2 до 7 см, цветки – ширина от 2 см до 5 см, длина от 2 см до 4,4 см.
Цельное сырье. Стебель 45-50 см длиной, простой, прямой, плотный серовато-войлочно опушенный. Листья непарно-перистораздельные на 8-12 пар не совсем супротивных долек, опушенные с обеих сторон, шершавые, с нижней стороны со слабым прижатым, паутинистым опушением, усиливающимся по жилкам по направлению к черешку. Цвет верхней стороны листа зеленый, нижней стороны листа светло-зеленый.
Цветочная корзинка – крупная, одиночная до 3-4 см в диаметре, полушаровидная. Придатки листочков обвертки мягкопленчатые, бурые, яйцевидные, 5-8 мм шириной, с несколько удлиненным, отстающим и загнутым концом. Цветки розовато-лиловые.
Плод – четырехгранная, немного конусовидная, ребристая, коричневая семянка длиной 4-6 мм, шириной 2-3 мм, с хохолком из перистых щетинок.
Корневище удлиненное, более или менее вертикальное, мощное, 1-3 см в диаметре с рыхлой бугристо-волокнистой поверхностью и немногочисленными тонкими корнями. Цвет темно-коричневого. Измельченная трава. Кусочки стеблей, листьев зеленого, светло-зеленого цвета, цветков, чашелистиков различной формы и плодов, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Запах специфический. Вкус водного извлечения горьковатый.
Измельченные корневища с корнями. Кусочки корневищ с корнями, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм. Цвет темно-коричневый. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения горький.
Одним из показателей подлинности лекарственного растительного сырья являются анатомо-диагностические признаки строения органов растения. Микроскопические исследования проводили согласно ОФС
1.5.3.0003.15 «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов». Лекарственное сырье исследовали при помощи микроскопа. Работу с микроскопом проводили при естественном освещении, а также с использованием электрической лампы. Исследуемый объект помещали в капле глицерина и покрывали предметным стеклом. Каждый препарат рассматривали сначала при малом увеличении (в 300 раз) для общей ориентации, а затем при большом увеличении (в 600 раз). 3.3.1. Анатомо-диагностические признаки F. uniflorum травы Микроскопия листовой пластинки. Препараты для микроскопического анализа готовили из сырья предварительно просветленного в растворе щелочи. Для этого несколько листочков кипятили в пробирке в 5% водном растворе щелочи. Клетки верхнего и нижнего эпидермиса многоугольной формы с прямыми стенками и неравномерно четковидными утолщениями, устьица аномоцитного типа присутствуют на обеих сторонах листовой пластинки, характерно наличие трех типов волосков: простых многоклеточных, располагающихся на верхнем и нижнем эпидермисе, головчатых волосков с многоклеточным основанием, многоклеточных бичевидных волосков и железок, встречающихся только на верхнем эпидермисе (рисунок 4).
Микроскопия стебля. При подготовке стебля использовали холодное размачивание объекта. Помещали кусочки стеблей в банку с жидкостью (вода очищенная: глицерин 2:11 с добавлением кристаллика карболовой кислоты). Через 4 суток объекты помещали в 70% этанол. Готовили несколько тонких поперечных срезов (перпендикулярных к оси стебля), захватив все ткани от периферии до центра, а также продольные срезы.
При малом увеличении на поперечном срезе хорошо различается первичная кора и центральный цилиндр. В состав первичной коры входит основная паренхима, состоящая из крупных тонкостенных клеток. Снаружи от основной паренхимы хорошо видна эпидерма - слой плотносомкнутых клеток, покрытых тонким слоем кутикулы.
Валидация методики количественного определения суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон в F. uniflorum траве и корневищах с корнями
Качественное определение экдистерона проводили в системе растворителей 3 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil».
На линию старта пластины наносили по 0,05 мл 70% спиртового извлечения F. uniflorum травы и корневищ с корнями и хроматографировали в соответствующей системе параллельно с достоверным образцом раствора СО экдистерона. Когда фронт проходил около 10 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 минут и обрабатывали хроматограмму ванилина реактивом, прогревали в сушильном шкафу при 105-110C и наблюдали изменение окраски пятен. На хроматограмме раствора СО экдистерона обнаружили зоны адсорбции желто-зеленого цвета (Rf = 0,39).
Качественное обнаружение аскорбиновой кислоты проводили в водных извлечениях F. uniflorum травы и корневищ с корнями в системе растворителей 4 и 5 на пластинах «Silufol UV254».
На линию старта пластины микропипеткой наносили 0,5 мл водного извлечения F. uniflorum травы, корневищ с корнями (1:10) и рядом 0,003 мл РСО аскорбиновой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами помещали в камеру со смесью растворителей этилацетат – ледяная уксусная кислота (80:20) и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил около 10 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 минут и обрабатывали 0,04% раствором 2,6 57 дихлорфенолиндфенолята натрия. При просмотре хроматограммы наблюдали белое пятно на розовом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой (Rf =0,90). Также водное извлечение исследовали на содержание аскорбиновой кислоты в системе растворителей 5 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в темной камере. При достижении фронта растворителя 15 см, пластину вынимали, высушивали при комнатной температуре и обрабатывали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 95% спирте. При просмотре хроматограммы наблюдали синие зоны на желтом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой (Rf = 0,75).
Качественное определение аминокислот проводили в водных извлечениях F. uniflorum травы и корневищ с корнями на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в системе растворителей 6.
На линию старта пластины микропипеткой наносили по 0,1 мл водного извлечения F. uniflorum травы, корневищ с корнями и по 0,05 мл растворов СО аминокислот: глицин, лейцин, аланин, валин, аргинин, аспарагин.
Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе, затем помещали в хроматографическую камеру с системой растворителей 6 и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт проходил около 10 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 минут и обрабатывали хроматограмму 0,1 % раствором нингидрина, затем нагревали в сушильном шкафу при температуре 100 – 105C в течение 10 минут.
На хроматограмме растворов СО аминокислот обнаружили 6 зон адсорбции светло-фиолетового или фиолетового цвета: глицин (Rf = 0,40); лейцин (Rf = 0,64); аланин (Rf = 0,36); валин (Rf = 0,50); аргинин (Rf = 0,06); аспарагин (Rf = 0,34).
При просмотре хроматограммы обнаружили в F. uniflorum траве четыре зоны адсорбции на уровне СО глицина, СО лейцина, СО аланина и СО аргинина, а в F. uniflorum корневищах с корнями три зоны адсорбции на уровне зон адсорбции СО глицина, СО валина и СО аргинина. Для качественного определения инулина готовили извлечения из сырья, для этого в колбу 200 мл помещали 5,0 г сырья, прибавляли 30 мл воды очищенной, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин с момента закипания смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр (испытуемый раствор). На линию старта хроматографической пластины ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» наносили 0,02 мл извлечения F. uniflorum травы и корневищ с корнями и 0,05 мл раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовали извлечение из Inula helenium корневищ с корнями, приготовленное аналогично испытуемому раствору. Пластину с нанесёнными пробами помещали в камеру, предварительно насыщенную парами растворителя 7 в течение не менее 15 мин. После прохождения фронта растворителя около 10 см пластину вынимали из камеры и высушивали на воздухе в течение 10 мин. Затем хроматограмму опрыскивали последовательно 20% спиртовым раствором тимола и разведенной серной кислотой. Пластинку подсушивали на воздухе и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105С. На хроматограмме раствора сравнения обнаружили зону адсорбции оранжево-красного цвета с Rf = 0,77 (инулин). На хроматограмме испытуемых растворов обнаружили две зоны адсорбции оранжево-красного цвета на уровне хроматограммы раствора сравнения, что подтверждает наличие инулина в F. uniflorum траве и корневищ с корнями.
Таким образом, извлечения F. uniflorum травы и корневищ с корнями содержат экдистерон, аскорбиновую кислоту, инулин и аминокислоты, в том числе извлечения F. uniflorum травы - глицин, лейцин, аланин и аргинина, а F. uniflorum корневища с корнями - глицин, валин и аргинин.