Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Фармакологические свойства производных бензимидазола
1.1.1. Фармакологические свойства неконденсированных производных бензимидазола
1.1.2. Фармакологические свойства конденсированных производных бензимидазола
1.2. Методы анализа производных бензимидазола 21
1.2.1. Физические и химические свойства производных бензимидазола... 21
1.2.2. Спектральные методы анализа
1.2.2.1. УФ-спектроскопия 26
1.2.2.2. ИК-спектроскопия 28
1.2.2.3. ПМР-спектроскопия
1.2.3. Хроматографические методы анализа производных
бензимидазола
1.2.3.1. Тонкослойная хроматография в анализе производных бензимидазола ЗО
1.2.3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 32
1.2.3.3. Газожидкостная хроматография 42
Выводы по Главе 1 44
Глава 2. Объекты и методы исследований
Глава 3. Фармацевтический анализ и стандартизация субстанции РУ
3.1. Определение основных фармакопейных показателей качества субстанции РУ 1205 53
3.2. Определение спектральных характеристик субстанции РУ 1205 57
3.2.1. УФ-спектроскопия 57
3.2.2. ИК-спектроскопия 58
3.2.3. ПМР-спектроскопия 61
3.3. Определение родственных примесей в субстанции РУ 1205
3.4. Определение остаточных органических растворителей в субстанции РУ 1205
3.5. Количественное определение субстанции РУ 1205 80
3.6. Определение сроков годности субстанции РУ 1205 82
3.7. Установление норм качества субстанции РУ 1205 85
Выводы по Главе 3 88
Глава 4. Фармацевтический анализ и стандартизация твердой дозированной лекарственной формы РУ 1205 - таблеток, покрытых пленочной оболочкой
4.1. Внешний вид 89
4.2. Однородность массы 89
4.3. Распадаемость 90
4.4. Определение подлинности 90
4.5. Определение родственных примесей методом ВЭЖХ
4.5.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография в изократическом режиме элюирования
4.5.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография в градиентном режиме элюирования 100
4.6. Количественное определение 111
4.7. Однородность дозирования 116
4.8. Разработка методики определения показателя «Растворение» 120
4.9. Изучение стабильности и установление сроков годности лекарственного препарата РУ 1205, таблетки, покрытыепленочной оболочкой .
4.10. Установление норм качества таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой .
Выводы по Главе 4 133
Общие выводы 134
Список литературы
- Фармакологические свойства неконденсированных производных бензимидазола
- Определение спектральных характеристик субстанции РУ 1205
- Определение сроков годности субстанции РУ 1205
- Высокоэффективная жидкостная хроматография в градиентном режиме элюирования
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время актуальной
проблемой является создание лекарственных средств, обладающих выраженной
анальгетической активностью и не вызывающих побочные эффекты, характерные
для классических опиоидных анальгетиков. В результате поисков таких
лекарственных средств в Ростовском государственном медицинском университете
(Ростов-на-Дону, Россия) из большого числа производных конденсированной
системы имидазобензимидазола было выбрано соединение, получившее
лабораторный шифр РУ 1205 – дигидрохлорид 2-(4-фторфенил)-9-
морфолиноэтилимидазо[1,2-]бензимидазола.
Установлено, что РУ 1205 обладает выраженными анальгетическими свойствами, являясь агонистом -опиоидных рецепторов. В ряде тестов на моделях термических, электрических и химических стимулов РУ 1205 по своей анальгетической активности превосходит препарат сравнения буторфанола тартрат в несколько раз. Показано, что он обладает мембраностабилизирующим действием, опосредованным через характер взаимодействия с -опиоидными рецепторами (Спасов А.А. и др., 2014; 2015). В тестах генерализованных судорог РУ 1205 обладал противосудорожными свойствами, превосходящими вальпроат натрия, и не оказывал влияния на адренергические, серотонинэргические и холинергические нейромедиаторные системы (Спасов А.А. и др., 2014).
Данные фармакологических исследований позволяют предположить
перспективность РУ 1205 для медицинского применения, а соответственно, и проведения исследований по фармацевтической разработке лекарственного препарата на его основе.
Степень разработанности темы исследования
РУ 1205 – принципиально новое соединение, синтезированное в Ростовском
государственном медицинском университете, изучение фармакологических
свойств которого проводится в Волгоградском государственном медицинском
университете (ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России). В рамках
сотрудничества с ВолгГМУ в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В. В. Закусова» была разработана твердая дозированная
лекарственная форма: таблетки РУ 1205, покрытые пленочной оболочкой, 10 мг. Фармацевтический анализ и стандартизация субстанции и твердой дозированной лекарственной формы РУ 1205 до этого момента не проводились.
Цель и задачи настоящего исследования
В соответствии с фармакопейными требованиями изучить физико-химические свойства, разработать методики контроля качества и провести стандартизацию фармацевтической субстанции нового отечественного к-опиоидного анальгетика РУ 1205 и его лекарственной формы
Задачи исследования:
-
охарактеризовать серийные образцы фармацевтической субстанции РУ 1205 по физико-химическим свойствам и спектральным характеристикам методами ИК-, УФ-, ПМР-спектроскопии;
-
изучить хроматографические характеристики и разработать методики определения примесей в субстанции РУ 1205 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (родственные примеси) и газожидкостной хроматографии (остаточные органические растворители);
-
разработать методику количественного определения субстанции РУ 1205;
-
определить фармакопейные показатели качества и разработать методики контроля качества таблеток РУ 1205 10 мг;
-
изучить стабильность субстанции и таблеток РУ 1205, определить условия хранения и сроки годности;
-
установить экспериментально обоснованные нормы качества субстанции и таблеток РУ 1205, оформить соответствующие проекты нормативной документации.
Научная новизна работы. В рамках исследований по стандартизации
проведен комплексный анализ физико-химических свойств и спектральных
характеристик фармацевтической субстанции РУ 1205. Изучены
хроматографические характеристики РУ 1205 и его технологических примесей методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в изократическом и градиентном режимах. На основании проведенных исследований предложены методики определения содержания родственных примесей в субстанции и таблетках РУ 1205, покрытых
пленочной оболочкой, а также методика количественного определения РУ 1205 в лекарственной форме.
Изучена стабильность субстанции и таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой, 10 мг при хранении в естественных условиях. Показано, что субстанция и лекарственная форма РУ 1205 стабильны в течение 2 лет при хранении в защищенном от света месте при температуре 25С.
Проведенные исследования являются частью комплекса исследований, завершившихся получением патента на лекарственную форму (RU 2545861).
Теоретическая значимость исследования. Представленный в работе экспериментально-практический материал может служить теоретической базой для разработки методик анализа производных имидазобензимидазола.
Практическая значимость исследования. Разработан комплекс методик контроля качества субстанции и таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой, 10 мг. В соответствии с полученными данными установлены научно обоснованные нормы качества субстанции и таблеток РУ 1205. По результатам исследований оформлены проекты нормативной документации на субстанцию и таблетки РУ 1205, покрытые пленочной оболочкой 10 мг.
Основные положения, выносимые на защиту:
результаты определения фармакопейных показателей качества, изучения спектральных и хроматографических характеристик фармацевтической субстанции и таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой;
обоснование выбора комплекса методик контроля качества фармацевтической субстанции и таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой, результаты валидации аналитических методик;
результаты изучения стабильности субстанции и таблеток РУ 1205 при хранении;
результаты исследований по установлению экспериментально обоснованных норм качества фармацевтической субстанции и таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой.
Методология и методы исследования. Работа выполнена в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи РФ XII издания, Отраслевого
стандарта 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения" и Государственной Фармакопеи XIII издания. Также были учтены требования и рекомендации, представленные в зарубежных фармакопеях, руководствах ICH и GMP, руководствах под редакцией В.В. Береговых -«Валидация аналитических методик для производителей лекарств» и под ред. Н.В. Юргеля - «Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств». Статистическая обработка полученных результатов проведена в соответствии с требованиями ГФ XIII.
В процессе исследований были использованы методы: ИК-, УФ-, ЯМР 1H -спектроскопии, кислотно-основного титрования в неводной среде, ГЖХ, ВЭЖХ.
Достоверность научных положений и выводов. Экспериментальные исследования проведены с использованием современного сертифицированного оборудования; разработанные аналитические методики валидированы; анализ экспериментальных данных проведен с применением методов статистической обработки, что позволяет считать полученные результаты достоверными.
Апробация результатов исследования. Основные результаты работы доложены и обсуждены на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2014 г., 2016 г.); 6-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2015 г.).
Апробация проведена на межлабораторной конференции ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (27 сентября 2016 г., протокол №2).
Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в выполнении экспериментальных исследований, разработке и валидации методик, анализе и обобщении полученных результатов, проведении аналитической и статистической обработки результатов, написании публикаций и нормативных документов.
Внедрение результатов исследования. Разработанные методики внедрены в работу аналитической группы опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова».
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 –
фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической
науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в рамках комплексной темы
исследований: «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций
центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных
нейропсихотропных средств» (номер государственной регистрации
01.2.006.06601).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 152 страницах
машинописного текста, содержит 32 таблицы, 43 рисунка и приложение.
Диссертационная работа состоит из содержания, списка используемых
сокращений, введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы
исследований», двух глав описания экспериментальных исследований,
Фармакологические свойства неконденсированных производных бензимидазола
Амфедазол по антиаритмической активности при суправентрикулярных нарушениях ритма превосходил такие препараты сравнения как хинидин, новокаинамид, этмозин, амиодарон [Грецкая И.Б., 1987]. Данное соединение увеличивает эффективный рефрактерный период, и обладает свойствами III класса антиаритмических препаратов [Спасов A.A. и др., 1995]. Кроме того, амфедазол обладает противоишемическими и антифибрилляторными свойствами [Гурова H.A., 1998].
Эноксифол – антиишемический препарат, обладающий выраженным защитным действием в условиях острой ишемии головного мозга, не уступая кавинтону. Препарат, по всей видимости, обладает мембраностабилизирующим и антиоксидантным эффектом. РУ 891 – антиагрегантное средство с выраженной активностью по сравнению с ацетилсалициловой кислотой. Механизм антитромбогенного действия соединения РУ 891 основан на блокирующем влиянии на P2Y12 рецепторы тромбоцитов, снижением синтеза тромбоксана А2 (ТхА2) и уровня внутриклеточного Са2+ [Кучерявенко А. Ф., 2013].
РУ 1117, РУ 1148 – средства, имеющие местноанестезирующую активность, и, согласно исследованиям, вещества, которые могут составить конкуренцию лидокаину и дикаину при переднекамерной анестезии глаза. Эти вещества обладают более глубокой и продолжительной анестезией в сочетании с вискоэластиком визитоном-пэг [Галенко-Ярошевский А.П. и др. 2007]. РУ 1275 – фторированное производное имидазобензимидазола, превосходящее по своей местноанестезирующей активности РУ 1117 [Галенко-Ярошевский А.П. и др. 2009]. РУ 1203 и РУ 1205 – выраженные -опиоидные агонисты [Спасов А.А. и др., 2010].
Опиоидные анальгетики – отдельный класс лекарственных средств, которые применяют при остром болевом синдроме при серьезных травмах, обширных ожогах, инфаркте миокарда, онкологических и неврологических заболеваниях для его купирования. На данный момент наиболее активно используют неселективные агонисты опиоидных рецепторов, среди которых такие вещества как морфин, промедол, фентанил. Их клиническое использование ограничено рядом центральных и периферических побочных эффектов: наркотической зависимостью, угнетением дыхательного центра, толерантностью к обезболивающему действию [McNicol E., 2003]. Основой создания эффективных и безопасных обезболивающих средств является их поиск среди высокоселективных рецепторных лигандов [Воронина Т.А., 2010; Kivell B., 2010].
Селективные агонисты -опиодных рецепторов представляют из себя наиболее значимую группу соединений с улучшенными фармакологическими свойствами с отсутствием характерных для неселективных опиатов побочных реакций [Boacek S. et al., 2007; Prisinzano T. E. et al., 2008; Aldrich J. V. et al., 2009; Carlezon W. J. et al., 2009; Bruchas M. R., Chavkin C., 2010; Kivell B., Prisinzano T. E., 2010; Vanderah T. W., 2010]. Среди большого числа синтезированных соединений на данный момент в клинической практике нашел применение лишь буторфанол (парциальный агонист - и агонист -опиоидных рецепторов). В последнее время появилась информация о негативных эффектах препарата: наркогенном потенциале, провоцировании суицида, угнетении дыхательного центра [Comminskey S. et al., 2005].
Информация о взаимодействии с -опиоидным рецепторным комплексом производных бензимидазола и их доказанная эффективность in vitro послужила предпосылкой к созданию высокоселективных веществ с опиоидным рецепторным профилем среди производных конденсированных систем бензимидазола. На основании анализа базовых структур экспериментально изученных субстанций показано, что наиболее перспективным классом для поиска веществ с высокой -рецепторной активностью являются 2,9-дизамещенные производные имидазо[1,2-]бензимидазолов. При этом проявление -агонистической активности у производных этого класса в значительной мере зависит от природы заместителя у атома азота в положении 9, а также строения радикала во втором положении гетероциклического ядра. В последнем случае обязательным условием -агонистического действия изучаемых веществ является наличие фенильного радикала в положении С2 гетероциклического ядра, иначе исследуемые соединения полностью теряют свою активность [Спасов А. А. и др., 2011].
Соединения под лабораторными шифрами РУ 1203, РУ 1204 и РУ 1205 с выраженной -агонистической активностью были выбраны в результате длительных исследований по синтезу и изучению различных конденсированных производных на основе ядра бензимидазола, выполненных в Волгоградском государственном медицинском университете и НИИ ФОХ Южного федерального университета [Анисимова В.А., 2009; Гречко О.Ю., 2010; Спасов А. А. и др., 2011].
На экспериментальных ноцицептивных моделях РУ 1205 проявляет дозозависимое анальгетическое действие, вызванных термическими, электрическими и химическими стимулами. Наиболее выраженное обезболивающее действие соединения РУ 1205 отмечалось на центральной модели аналгезии, характеризующей супраспинальный уровень организации болевой чувствительности, что превосходило препарат сравнения (буторфанола тартрат) в 6 раз. В тестах спинальной аналгезии и тестах, свидетельствующих о вовлечении периферических структур в антиноцицептивные эффекты, вещества были эквивалентны. Эффект РУ 1205 блокировался неселективным антагонистом опиоидных рецепторов – налоксоном и селективным антагонистом -опиоидных рецепторов – нор 20 биналторфимином, что доказывает опосредованность эффекта через -опиоидные рецепторы [Спасов А.А. и др., 2013; Гречко О. Ю. и др., 2014]. В результате ряда исследований было обнаружено, что РУ 1205 не влияет на эффекты адренергических, серотонинергических и холинергических анализаторов и нейромедиаторных систем [Спасов А.А. и др. 2014]. Соединение под шифром РУ 1205 не оказывало модулирующего влияния на дофаминергическую нейропередачу в комбинации с L-ДОФА, в тесте с галоперидолом не вызвало изменений его каталептогенных свойств у животных опытной группы по сравнению с контрольной группой. При этом было выявлено статистически значимое снижение гиперактивности мышей в тесте с фенамином по сравнению с контрольными животными, что может указывать на способность РУ 1205 блокировать дофаминовую нейротрансмиссию в мезолимбической структуре мозга [Спасов А.А. и др. 2014]. В результате проведенных исследований с пикротоксином и бикукуллином было установлено, что РУ 1205 снижает число конвульсивных движений, что может быть обусловлено аллостерическими взаимодействиями с участками ГАМК-бензодиазепин-хлорионофорного комплекса [Bimir B. et al., 2000] и влиянием на Ca2+-зависимые-K+ токи [Pfieger J.F., Clarac L., Vinay L., 2002].
Определение спектральных характеристик субстанции РУ 1205
Объекты исследований представляли собой образцы субстанции нового отечественного -опиоидного анальгетика РУ 1205 серий 1-013, 56, 58, 59, 60, 214, 217, 828, 010512, 020512, исходное вещество – таблетки, покрытые пленочной оболочкой, 10 мг, серий 20213, 30213, 40213, 50213, 60213. Синтез субстанции РУ 1205 осуществлен в ЗАО «ЭМПИЛС-ФОХ» (Ростов-на-Дону, Россия). Образцы технической субстанции для исследований предоставлены ЗАО «ЭМПИЛС-ФОХ». Очистка образцов субстанции путем кристаллизации была проведена коллективом группы технологии синтеза лекарственных средств химико-технологической лаборатории опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (руководитель группы – ведущий научный сотрудник, кандидат химических наук – Авдюнина Н.И.).
По химической структуре препарат представляет собой дигидрохлорид 2-(4-фторфенил)-9-морфолиноэтилимидазо[1,2-]бензимидазола. Свидетели технологических примесей 2-аминобензимидазола (примесь 1) и 2-амино-1-морфолиноэтилбензимидазола (примесь 2) получены в группе технологии синтеза лекарственных средств химико-технологической лаборатории опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова». Бромид 2-амино-1-морфолиноэтил-3-(4 фторфенацил)бензимидазолия (примесь 3) предоставлен ЗАО «ЭМПИЛС-ФОХ».
Твердая дозированная лекарственная форма – таблетки РУ 1205, покрытые пленочной оболочкой, 10 мг, получены коллективом лаборатории готовых лекарственных форм опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (зав. лабораторией – д.ф.н., профессор К.В. Алексеев). Твердая дозированная лекарственная форма РУ 1205 представляла собой двояковыпуклые таблетки почти белого цвета, покрытые пленочной оболочкой, дозировкой 10 мг и средней массой таблетки 210 мг.
Состав таблеток РУ 1205 (патент №2545861 от 02.10.2013), покрытых пленочной оболочкой (на одну таблетку): РУ 1205 0,0100 г (0,01105 г в пересчете на сухое вещество) Вспомогательные вещества:Лактоза (USP)Лудипресс (Eur. Ph)Магния стеарат (ТУ 6-09-16-1553-90) 0,02000 г 0,16695 г 0,00200 г Оболочка:Опадрай (Opadry 200 f280000) (USP) До получения таблетки с оболочкой массой 0,210 г
Изучение основных фармакопейных показателей качества субстанции и таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой, разработку методик анализа, установление сроков годности и научно-обоснованных норм качества проводили в аналитической группе химико-технологической лаборатории опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».
Микроскопический анализ субстанции проводился с помощью микроскопа Eclipse 50i (Nikon, Япония).
УФ-спектры получены на спектрофотометре UV-1700 (Shimadzu, Япония). ИК-спектры получены в группе физико-химических методов исследования отдела химии лекарственных средств ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (Рук. отдела – профессор, член-корр. РАН Т.А. Гудашева, анализ выполнен к.х.н. Ф.С. Байбуртским) на двухлучевом ИК-спектрометре Vertex 70 (Bruker, ФРГ). ПМР-спектры были получены в группе физико-химических методов исследований отдела химии лекарственных средств ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (Рук. отдела – профессор, член-корр. РАН Т.А. Гудашева, анализ выполнен к.х.н. В.П. Лезиной) на ПМР-спектрометре АС – 250 (Bruker, ФРГ).
Для определения рН растворов и потенциометрического титрования были использованы рН-метр Seveneasy S20 (Mettler Toledo, Швейцария) с электродом для неводного титрования DGi116-Solvent комбинированным (Mettler Toledo, Швейцария) и иономер универсальный ЭВ-74 (Завод измерительных приборов, СССР) c электродами ЭСЛ-43-07 и ЭВЛ-1М3 (Завод измерительных приборов, СССР).
Тест «Растворение» проведен на приборе «Лопастная мешалка» PT-DT 70 (Pharmatest, Германия).
Для проведения хроматографического анализа методом ВЭЖХ использовали жидкостной хроматограф System Gold HPLC (Beckman, США) с градиентным насосом (модель 127) и спектрофотометрическим детектором с изменяемой длиной волны (модель 166); программное обеспечение – «Мультихром 1.5» (Амперсенд, Россия).
Хроматографическое разделение изучаемых соединений проводили на колонках Hypersil BDS C18 5 мкм 150 4,6 мм (Thermo Scientific, США), сорбент С18 с размером частиц 5 мкм) и Hypersil BDS C18 5 мкм 250 4,6 мм (Thermo Scientific, США), сорбент С18 с размером частиц 5 мкм) в изократическом и градиентном режимах соответственно.
Также при разработке методик использовались колонки GraceSmart RP 18 3 мкм, 150 4,6 мм (W. R. Grace & Co.-Conn., США), сорбент С18 с размером частиц 3 мкм), Luna C18 (2) 5 мкм 150 4,6 мм (Phenomenex, США), сорбент С18 с размером частиц 3 мкм).
Анализ методом газожидкостной хроматографии (определение остаточных органических растворителей) выполняли на хроматографе Chrom 5 (Лабораторные приборы, ЧССР); детектор пламенно-ионизационный; программное обеспечение – «Экохром» (ООО «Прибор», Россия). Для анализа использовали стеклянную набивную колонку размером 2,4 м 3 мм, заполненную сорбентом 15% Carbowax 1500 на твердом носителе Chromaton N-AW-DMCS (0,200 – 0,250 мм).
Определение остаточных органических растворителей в субстанции проводили по методике, ранее разработанной в аналитической группе опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В, Закусова» [Коночкина М.Е. и др., 2010].
Определение сроков годности субстанции РУ 1205
В результате проведенных исследований была разработана методика определения родственных примесей в субстанции РУ 1205, представленная ниже.
Приготовление испытуемого раствора: 0,025 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл подвижной фазы, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают (концентрация испытуемого раствора – 1 мг/мл).
Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО): около 0,025 г (точная навеска) рабочего стандартного образца (РСО) РУ 1205 помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл подвижной фазы, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают (концентрация раствор 1 РСО – 1 мг/мл). 1 мл раствора 1 РСО помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки подвижной фазой и перемешивают (концентрация раствора 2 РСО – 0,01 мг/мл).
Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографической системы: около 0,020 г РУ 1205 и 0,020 2-аминобензимидазола (примеси 1) (Aldrich кат. № 934-32-7) (точные навески) помещают в мерную колбу вместимостью 20 мл и растворяют в достаточном объеме смеси метанол – вода в объемном соотношении 1:1, тщательно перемешивают (раствор А, концентрация РУ 1205 и 2-аминобензимидазола – по 1 мг/мл). 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки тем же растворителем, тщательно перемешивают (раствор для проверки пригодности хроматографической системы, концентрация РУ 1205 и 2-аминобензимидазола – 0,01 мг/мл). Перед проведением анализа колонку уравновешивают подвижной фазой до достижения стабильной базовой линии, проводили холостой опыт. Хроматографируют раствор для проверки пригодности хроматографической системы, испытуемый раствор, раствор РСО, получая не менее 5 хроматограмм каждого из растворов. Хроматографическую систему считают пригодной, если выполняются требования, представленные в таблице 8. Все растворы следует использовать непосредственно после приготовления. Формула расчета содержания единичной примеси (Х, %) следующая: где Sпр – площадь пика индивидуальной примеси; Sст – площадь пика РУ 1205 на хроматограмме раствора РСО; mст – масса навески РСО РУ 1205, г; mисп – масса навески образца субстанции РУ 1205, г; W – чистота РСО РУ 1205, %; Zисп – потеря в массе образца субстанции РУ 1205, %; Zст – потеря в массе СО РУ 1205, %. В качестве РСО РУ 1205 использовался серийный образец субстанции, паспорт на который представлен в приложении 1. Разработанная методика была валидирована по показателям: специфичность, линейность и диапазон применения, предел обнаружения, предел количественного определения, правильность и прецизионность.
Специфичность методики подтверждается разделением РУ 1205 и его технологических примесей в модельных смесях (см. рис. 10).
Также для дополнительного подтверждения специфичности методики образцы, приготовленные для определения родственных примесей, были помещены под действие солнечного света. Через 8 суток в пробах был обнаружен ряд дополнительных примесей, полностью разделившихся с основным веществом (РУ 1205) (см. рис. 21). Обнаруженные в пробах примеси идентифицированы не были. 5.18
Линейная зависимость площади пика от концентрации РУ 1205 подтверждена в диапазоне концентраций от 0,001 до 0,05 мг/мл, примеси 3 – от 0,0002 до 0,01, примеси 2 – от 0,0004 до 0,05 мг/мл, примеси 1 – от 0,0003 до 0,04 мг/мл (см. рис. 20).
Правильность и прецизионность методики были подтверждены с использованием поправочных коэффициентов на модельных смесях субстанции РУ 1205 и технологических примесей (примесей 1, 2 и 3) с известным содержанием всех соединений.
Концентрация РУ 1205 в модельных растворах составила около 1 мг/мл, а концентрация примесей – 0,002 мг/мл, 0,005 мг/мл и 0,01 мг/мл, соответственно.
Модельные смеси готовили следующим образом: около 0,050 г (точная навеска) каждой технологической примеси помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 40 мл подвижной фазы, тщательно перемешивали, доводили до метки тем же растворителем и перемешивали (концентрация раствора А – 1 мг/мл). Около 0,1 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл подвижной фазы, прибавляли 1 мл раствора А технологических примесей, доводили объем раствора до метки подвижной фазой и перемешивали (раствор В, концентрация примесей 0,01 мг/мл, концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл).
Для получения модельных смесей с концентрациями технологических примесей 0,005 мг/мл и 0,002 мг/мл в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали навески по 0,025 и 0,010 г каждой примеси соответственно. Последующее разведение проводилось по описанной выше методике.
В качестве раствора РСО использовали раствор серийного образца субстанции РУ 1205 (приложение 1) с концентраций 0,01 мг/мл.
Около 0,025 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 20 мл подвижной фазы, тщательно перемешивали, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и вновь перемешивали (раствор РСО 1 – концентрация 1 мг/мл). 1 мл раствора РСО 1 помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки подвижной фазой и перемешивали (раствор РСО 2 – концентрация РУ 1205 - 0,01 мг/мл). Результаты оценки содержания примесей 1, 2 и 3 в модельных смесях с субстанцией РУ 1205 с использованием коэффициентов представлены в таблице 10.
Высокоэффективная жидкостная хроматография в градиентном режиме элюирования
Для приготовления испытуемого раствора около 0,105 г (точная навеска) массы растертых таблеток РУ 1205 переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли около 20 мл смеси метанол - вода (1:1) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин. Затем содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем и фильтровали через мембранный фильтр Nylon (PA) (Fisherbrand, Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объем раствора до метки подвижной фазой, перемешивают (испытуемый раствор, концентрация РУ 1205 – 0,02 мг/мл).
Для приготовления раствора РСО около 0,020 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в достаточном объеме смеси метанол - вода (1:1) и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объем раствора до метки подвижной фазой, перемешивали (стандартный раствор, концентрация РУ 1205 – 0,02 мг/мл).
Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографической системы и проверку пригодности хроматографической системы проводили так же, как и при определении показателя «Родственные примеси» для методики с изократическим режимом элюирования.
Перед проведением анализа колонку уравновешивали подвижной фазой до достижения стабильной базовой линии, проводили холостой опыт. Результаты количественного определения РУ 1205 в таблетках покрытых пленочной оболочкой, усредненные по 5 хроматограммам, представлены в таблице 26.
Таким образом, разработанная методика количественного определения РУ 1205 в таблетках методом изократической ВЭЖХ специфична, линейна в пределах диапазона применения, правильна (доверительный интервал включает 100% и результаты не отягощены систематической ошибкой) и прецизионна (RSD не более 2%), что позволяет включить ее в проект НД на препарат [Илларионов А. А. и др., 2014].
Содержание РУ 1205 в серийных образцах таблеток, определенное по разработанной методике соответствует требованиям Государственной фармакопеи РФ XIII издания (Т.2, с. 109).
В качестве метода количественного определения был выбран метод УФ-спектрофотометрии. На основании результатов о растворимости субстанции РУ 1205 извлечение содержимого таблеток было принято проводить в смеси этанол – вода в соотношении 1:1. УФ-спектры растворов субстанции РУ 1205, извлечения из плацебо и таблеток РУ 1205 в смеси этанол – вода (1:1) (концентрация РУ 1205 – 0,01 мг/мл) на спектрофотометре UV-1700 (Shimadzu, Япония) в диапазоне длин волн от 200 до 350 нм. Спектры представлены на рис. 35-37.
Как видно на представленных рисунках, УФ-спектры растворов РУ 1205 в диапазоне длин волн от 220 до 350 нм имеют два максимума при 272 ± 2 нм и 243 ± 2 нм и два минимума при 255 ± 2 нм и 225 ± 2 нм. УФ-спектр извлечения из таблеток РУ 1205 практически идентичен УФ-спектру раствора субстанции РУ 1205. В области длин волн от 220 до 350 извлечение из плацебо электромагнитное излучение практически не поглощает.
Линейная зависимость оптической плотности от концентрации РУ 1205 в смеси этанол - вода (1:1) наблюдалась в интервале концентраций от 0,002 до 0,015 мг/мл (рис. 38).
Результаты количественного определения РУ 1205 в модельных смесях методом УФ-спектрофотометрии в смеси спирт - вода (1:1)
Приготовление проб для определения однородности дозирования серийных образцов таблеток проводили следующим образом: одну таблетку помещали в фарфоровую ступку, тщательно растирали с 10 мл смеси этанол – вода (1:1) и количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, затем трижды смывали остатки растертой таблетки со ступки и пестика 10 мл смеси этанол – вода (1:1), объединяя полученные растворы с содержимым в колбе, прибавляли к содержимому колбы еще 40 мл смеси этанол – вода (1:1) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин. Затем объем содержимого колбы доводили до метки тем же растворителем, перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр Nylon (PA) (Fisherbrand, Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасывая первые порции фильтрата. 1 мл фильтрата помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объем раствора до метки смесью этанол – вода (1:1) и перемешивали.
Для приготовления раствора РСО РУ 1205 около 0,025 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в достаточном количестве смеси этанол – вода (1:1), доводили объем раствора в колбе до метки тем же растворителем, перемешивали. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора в колбе до метки смесью этанол – вода (1:1) и перемешивали.
Определяли оптическую плотность полученного испытуемого раствора и раствора РСО РУ 1205 на спектрофотометре при длине волны 272 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм [Илларионов А. А. и др., 2014].
В качестве раствора сравнения использовалась смесь этанол – вода (1:1). Формула для расчета содержания РУ 1205 в одной таблетке (Х, г) следующая: исп исп РСО РСО где Aисп – оптическая плотность испытуемого раствора АРСО – оптическая плотность раствора РСО РУ 1205 АРСО – масса навески РСО РУ 1205, г Содержание РУ 1205 в каждой таблетке должно соответствовать требованиям ГФ ХIII. Результаты определения однородности дозирования для пяти серий таблеток РУ 1205, покрытых оболочкой, представлены в таблице 28. 120