Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности. Биофармацевтический анализ играет большую роль в обеспечении безопасности и эффективности применения лекарственных средств (ЛС) - важной части персонализированной медицины. При использовании методов биофармацевтического анализа возможно установление индивидуальных особенностей фармакокинетики и метаболизма ЛС для конкретных пациентов, а также оптимизация режимов их дозирования при проведении фармакотерапии различных заболеваний.
Одним из путей биотрансформации ЛС являются генетически детерминированные процессы ацетилирования при участии фермента N-ацетилтрансферазы (NAT) печени, у человека при этом сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма. Путем N-ацетилирования происходит метаболизм прокаинамида (4-амино-М-[2-(диэтиламино)этил]бензамида, ПА) - лекарственного препарата, который широко применяется для лечения сердечной аритмии, различия в скорости метаболизма которого позволяют использовать его и в качестве тест-препарата для оценки активности NAT организма человека. Однако, в этом случае чаще всего фенотипирование проводят по оценке содержания ПА или его основного метаболита N-ацетилпрокаинамида (NAPA) в пробах крови, что имеет ограничения по применению этих способов на практике.
Перспективным направлением развития фармацевтической химии является разработка неинвазивных подходов по биофармацевтическому анализу для оценки индивидуальных особенностей фармакокинетики тест-препаратов ацетилирования в моче и слюне. При этом постоянно возрастающее число анализов этих биосред требует разработки новых автоматизированных и миниатю-ризированных методов, позволяющих повысить надежность, чувствительность и производительность анализа, а также снизить трудозатраты и расходы реагентов.
Для решения этих задач перспективно использование проточных методов анализа. Однако существуют проблемы, ограничивающие возможности проточных методов при анализе биологических жидкостей, как правило, это низкая селективность и недостаточная чувствительность определений. Эти проблемы могут быть устранены с помощью использования эффективных приемов пробоподготовки в условиях проточного анализа. При этом создание новых автоматизированных методов пробоподготовки является одним из трендов в области развития методологии проточного биофармацевтического анализа.
Диссертационная работа выполнялась при поддержке Гранта РФФИ № 16-33-50090 «Микроэкстракционное концентрирование лекарственных средств для последующего проточного определения в биологических жидкостях».
Научным консультантом по диссертационной работе являлся доктор хим. наук, профессор РАН Булатов Андрей Васильевич
Цель работы состояла в разработке хроматографических и
спектрофлуориметрических способов определения ПА в биологических жидкостях, их автоматизации с помощью проточного анализа, а также оценке фармакокинетических параметров при выведении тест-препарата из организма человека для косвенного установления фенотипа ацетилирования.
Для достижения поставленых целей решались следующие задачи:
изучить условия разделения и режимы элюирования в варианте обра-щенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), провести расчет и оценку параметров пригодности хроматографической системы при разработке методик хроматографического определения ПА и его ацетильного метаболита в моче и слюне;
установить возможности применения жидкостной экстракции ПА с использованием высахаривающих реагентов для пробоподготовки мочи, на этой основе разработать процедуру автоматизированного проточного экстракцион-но-хроматографического определения ПА в моче при использовании системы обращенно-фазной ВЭЖХ;
выявить факторы, обеспечивающие чувствительность и избирательность спектрофлуориметрического определения ПА в слюне, разработать простой подход для автоматизации процедуры жидкостной экстракции ПА с использованием глубоко эвтектических растворителей в системе циклического инжек-ционного анализа (ЦИА) со спектрофлуориметрическим детектирированием;
оценить влияние компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в условиях ВЭЖХ, спектрофлуориметрии и ЦИА аналитический сигнал, определить метрологические характеристики разработанных способов для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;
провести расчет и оценку фармакокинетических параметров экскреции ПА с мочой и слюной у здоровых добровольцев, разработать на этой основе экспрессные способы установления активности NАТ.
Научная новизна работы:
установлены условия хроматографического разделения ПА и его ацетильного метаболита в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ, выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих веществ в биологических жидкостях организма человека;
найдены и обоснованы рабочие условия чувствительного и избирательного определения ПА и его ацетильного метаболита в моче и слюне методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированием;
впервые разработаны автоматизированные способы экстракции ПА из мочи с использованием высахаривающих реагентов в условиях проточного анализа с последующим ВЭЖХ определением, обеспечивающие высокую степень извлечения и чувствительность определений тест-препарата процессов ацетилирования;
- установлены условия чувствительного спектрофлуориметрического оп
ределения ПА в слюне, и впервые показана возможность применения глубоко
эвтектических растворителей для микроэкстракционного концентрирования
ПА из проб слюны при циклическом инжекционном анализе со спектрофлуо-
риметрическим детектированием;
- разработаны способы косвенного определения активности N-
ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров ПА
при его экскреции с мочой, оценке уровня его содержаний в слюне с примене
нием ВЭЖХ, ЦИА со спектрофлуориметрическим детектированием и обосно
вано их использование для персонализации лекарственной терапии.
Теоретическая и практическая значимость состоит в том, что разработаны новые способы оценки активности ферментной системы ацетилирования на основе спектрофлуориметрического и хроматографического определения, в том числе с автоматизированной пробоподготовкой в проточной системе, циклического инжекционного определения содержания ПА в моче и слюне. На их основе предложены неинвазивные диагностические тесты для оценки индивидуальной активности метаболической системы ацетилирования организма человека, которые могут быть рекомендованы при персонализированном применении лекарственных средств.
Результаты исследования внедрены в медицинских учреждениях Управления здавоохранения г. Казани, Научно-образовательном центре фармацевтики ФГАОУ ВО «Казанский (Привожский) федеральный университет» и в учебный процесс ФГБОУ ВО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества и стандартизация лекарственных средств и биологически активных соединений» и «Основы токсикологии и фармакологии».
Методология и методы исследований. При проведении биофармацевтического анализа использовали обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию, спектрофлуориметрию, капиллярный электрофорез, проточные системы циклического инжекционного анализа. Для установления структуры синтезированного метаболита гидрохлорида и основания NАРА использованы методы ИК- и ЯМР 1Н спектроскопии.
Положения, выносимые на защиту:
результаты исследования хроматографического разделения ПА и его ацетильного метаболита в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ;
результаты изучения влияния состава и рН подвижной фазы, условий элюирования, валидационных данных по оценке пригодности предложенных хроматографических систем и свойств ЛВ на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования ПА и его ацетильного метаболита при их анализе в моче и слюне;
- результаты по экстракции ПА из мочи и выбору высахаривающего реа
гента, влиянию его концентрации, рН, соотношения и времени контакта фаз в
условиях проточного анализа на степень извлечения лекарственного вещества;
обоснование и подбор оптимальных условий микроэкстракционного концентрирования ПА из проб слюны в проточной системе при использовании глубоко эвтектического растворителя на основе холина хлорида и глицерина, их соотношения, а также объемов и времени контактирующих фаз, влияния рН на эффективность извлечения, чувствительность и избирательность ЦИА со спектрофлуориметрическим детектированием;
результаты исследования метрологических характеристик разработанных способов определения, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биофармацевтических методов анализа;
результаты расчета и анализа фармакокинетических параметров ПА и его ацетильного метаболита в биологических жидкостях и оптимизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки индивидуальной активности ферментных систем ацетилирования;
способы определения индивидуальной активности N-ацетилтрансферазы, основанные на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров ПА в моче и слюне.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Достоверность полученных результатов обеспечена использованием современных методов высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофлуориметрии в условиях ЦИА, капиллярного электрофореза, ИК- и ЯМР 1Н спектроскопии, а также математической статистики при обработке экспериментальных результатов.
Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на I Mеждисциплинарной конференции «Современные решения для исследования природных, синтетических и биологических материалов» (Санкт-Петербург, 2014), III Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы химической науки и фармации» (Чебоксары, 2014), I Всероссийской конференции с международным участием «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015), X Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа, 2015), Вьетнамо-российской международной научной конференции (Вьетнам, Ханой, 2015), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2015), 20th Международной конференции «International Conference on Flow Injection Analysis and Related Techniques» (Spain, Mallorca, 2016), ХХ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016), ХХIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,
2016), ХХ Всероссийской конференции молодых учных-химиков с международным участием (Нижний Новгород, 2017).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные
положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 –
фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного
исследования соответствуют области специальности, конкретно п. 4 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Публикации: Основные результаты диссертационной работы
опубликованы в 15 печатных изданиях, включая 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых для размещения материалов диссертаций, 1 статью и 10 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 226 источников. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 13 таблицами.
Личный вклад автора в опубликованных в соавторстве работах состоит в выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его проведении, в участии во всей процедуре анализа и обобщении полученных экспериментальных результатов, расчете фармакокинетических параметров, установлении закономерностей и формулировке выводов.
Благодарности. Автор работы выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н., профессору Гармонову С.Ю. и научному консультанту д.х.н., профессору Булатову А.В. за руководство и помощь при выполнении и написании работы; д.х.н., профессору Бухарову С.В. за помощь в синтезе метаболитов; к.х.н. Салахову И.А за помощь в проведении хроматографиче-ских исследований.