Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эпидемиологические особенности внебольничных пневмококковых пневмоний (обзор литературы) 11
1.1. Эпидемиологическая характеристика внебольничных пневмококковых пневмоний 11
1.2. Современные методы лабораторной диагностики пневмококковой инфекции 18
1.3. Специфическая профилактика пневмококковой инфекции 23
1.4. Эпидемиологический надзор и контроль за внебольничными пневмониями 28
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Материалы 32
2.2. Методы 36
Глава 3. Состояние заболеваемости и смертности от пневмоний среди населения г. Перми 47
3.1. Эпидемиологический анализ заболеваемости и смертности от пневмоний населения г. Перми 47
Глава 4. Распространенность носительства и серотиповой состав s.pneumoniae, выделенных на территории г.Перми 63
4.1. Распространенность носительства S. pneumoniae среди различных групп взрослого населения, включая медицинских работников 63
4.2. Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической венозной крови в отношении S. pneumoniae у медицинских работников 68
4.2. Серотиповой состав S. pneumoniae, циркулирующих на территории г. Перми 71
Глава 5. Диагностические возможности иммунохроматографического экспресс-метода в верификации пневмококковых пневмоний 75
5.1.Оценка чувствительности и специфичности иммунохроматографического метода 75
5.2. Применение иммунохроматографического метода для верификации пневмококковой пневмонии 77
Глава 6. Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность поливалентной полисахаридной пневмококковой вакцины при иммунизации медицинских работников 83
6.1. Безопасность 84
6.2. Иммунологическая эффективность 91
6.3. Профилактическая эффективность 92
Заключение 95
Выводы 109
Список литературы
- Специфическая профилактика пневмококковой инфекции
- Эпидемиологический анализ заболеваемости и смертности от пневмоний населения г. Перми
- Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической венозной крови в отношении S. pneumoniae у медицинских работников
- Применение иммунохроматографического метода для верификации пневмококковой пневмонии
Специфическая профилактика пневмококковой инфекции
Резервуаром и источником возбудителя пневмококковой инфекции являются больные люди с любой клинической формой, а также здоровые носители [5, 37, 46, 50].
Инкубационный период при пневмококковой инфекции длится от 1 до 3 дней. Период заразности точно не установлен, однако, по-видимому, передача возбудителя может происходить так долго, как долго он находится в секретах верхних дыхательных путей [6, 50, 60, 65].
С клинической точки зрения принято выделять инвазивные и неинвазивные формы пневмококковой инфекции. К первым относятся заболевания, при которых возбудитель был выделен из стерильных в норме локусов и тканей, к ним относят бактериемическую пневмонию, менингит и сепсис. К неинвазивным инфекциям, соответственно, относятся локально-очаговые поражения (обострение хронического бронхита, средний отит, риносинусит, пневмонию) [5, 37, 60, 94].
Уровень носительства S. pneumoniae в человеческой популяции, по разным данным, варьирует от 5% до 80%. Особенно высока частота носительства в детских дошкольных учреждениях 49,3% (5-72,2%) и в интернатах – 50,7% (11,1-86,7%). В начальной школе частота носительства снижается до 29-35%, в старших классах – до 25%. Дети первых лет жизни являются основными источниками возбудителя пневмококковой инфекции, заражая окружающих взрослых. Так, при обычной частоте носительства у взрослых (5-7%), среди проживающих с детьми она может достигать 30%. Частота носительства, по данным авторов, увеличивается при длительном контакте с больным или носителем [7, 10, 13, 15, 17, 39]. Колонизация пневмококками начинается сразу после рождения ребенка [22]. У детей 2 месяцев пневмококки выделяются в 21-46% случаев [69], хотя полагают, что средний возраст начала колонизации пневмококками составляет 6 месяцев. Дети могут являться бессимптомными носителями (даже нескольких серотипов) пневмококка в течение 4-6 недель [63], а по мнению некоторых авторов до года [121]. Средняя продолжительность носительства составляет 2,2 месяца, то есть, приобретя иммунитет к определенному серотипу пневмококка, примерно каждые 2 месяца дети вновь реинфицируются пневмококком, но уже другого серотипа. Таким образом, каждые 2 месяца, ребенок приобретает возможность развития любой патологии, которую могут вызвать все 94 серотипа пневмококка, - от пневмонии, до бронхита, отитов, менингита, и т.д. В 20% случаев возможна реинфекция одним и тем же серотипом. При изучении продолжительности носительства для конкретных штаммов пневмококка, выявлено, что носительство в среднем длится около 4 месяцев для серотипов 6, 14, 19 и 23, и около 2-7 месяцев для штаммов всех остальных серотипов [22, 44, 50, 78].
У взрослых носительство пневмококков составляет в среднем 2-4 недели [69], однако некоторые авторы указывают на более длительную персистенцию S. pneumoniae [22].
Механизм передачи пневмококковой инфекции – аэрозольный, т.к. S.pneumoniae является обычным представителем микрофлоры слизистой оболочки верхних дыхательных путей человека. Из-за низкой устойчивости во внешней среде, пневмококки быстро теряют жизнеспособность под действием различных дезинфицирующих веществ, при температуре 60 С погибают в течение 10 мин, на искусственных питательных средах сохраняются не более 6-7 дней, передаются, как правило, воздушно-капельным путем. Отмечены случаи внутриутробного заражения плода от инфицированной матери [5, 15].
Заболеваемость пневмококковой инфекцией для большинства регионов мира неизвестна. Первой страной, которая ввела с 1994 года учет пневмококковых инфекций, являются США. По данным, публикуемым Центром по контролю за заболеваемостью (CDC), в стране ежегодно регистрируются свыше 60 000 случаев инвазивной инфекции (распространенность составляет 23,2 на 100 000 населения) [15, 69]. Регистрация пневмококковых инфекций ведется только в девяти странах [15], поэтому об уровне заболеваемости можно судить лишь по данным отдельных исследований, в которых показано, что распространенность инвазивных пневмококковых инфекций колеблется в пределах 15-24 на 100 000 населения [17, 43].
В Российской Федерации частота инвазивных пневмококковых заболеваний точно не известна, предполагают, что уровень заболеваемости не отличается от США.
Ежегодно в мире от всех видов пневмококковых инфекций умирают не менее 1,6 млн. человек. При этом, следует заметить, что на долю пневмококковых инфекций приходится до 9% от общего количества случаев смерти у детей [36, 46]. Российская Федерация по показателю смертности при пневмококковых инфекциях относится к наиболее благополучным регионам мира, смертность менее 10 на 100 000 детей младше 5 лет, в то время как в странах Азии и Африки показатель смертности составляет 102 и 399 на 100 000 детей младше 5 лет соответственно [69].
Каждый год в мире регистрируют около 20 млн. пневмококковых пневмоний, которые чаще других осложняются сепсисом и бактериемией. Пневмококковая пневмония является причиной госпитализации в 17-90% случаях у детей и в 13-67% случаев у взрослых, при этом госпитальная летальность достигает 1-44% [54]. По данным российских исследователей, в 88% случаев госпитализации детей по поводу пневмонии, выделяется S.pneumoniae, а у 14% развивается осложненное течение [76, 78].
Эпидемиологический анализ заболеваемости и смертности от пневмоний населения г. Перми
Иммуногенность вакцины оценивали путем определения в сыворотке крови специфических IgG антител (IgG-АТ) к смеси полисахаридов (СП) S. pneumoniae, входящих в состав вакцины методом иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе до иммунизации и спустя 28 дней после введения вакцины, а также спустя 5 лет после имунизации.
Планшеты разборные для ИФА, производства ВНИИ «Медполимер» (Москва) сорбировали вакциной “Pneumo-23” (Авентис Пастер, Франция). Для сорбции пластин одну дозу вакцины (0,5 мл) разводили фосфатно-солевым буферным раствором до объема 50 мл. Использовали 1 дозу вакцины серии № G0008-2. 5 планшетов сорбировали р-ром антигенов (100 мкл в лунку) в течение 2ч при 37С, а затем 16ч при +4С. Затем содержимое лунок вытряхивали, лунки отмывали однократным фосфатно-солевым буферным раствором с твином 3 раза. Затем в лунки вносили в дублях рабочие растворы анализируемых сывороток. Рабочее разведение сывороток составляло 1:400, по 100 мкл в лунку. В качестве контроля использовали пул сывороток 100 клинически здоровых людей в том же разведении. Реакция сывороток с иммуносорбентом (антигеном на полистироле) продолжалась 1 час при 20-22С. Затем содержимое лунок вытряхивали, лунки промывали 3 раза ФСБ с твином. Следующий этап постановки ИФА состоял в реакции антител, прореагировавших с антигенами, с конъюгатом. В качестве конъюгата использовали антитела кроличьи против IgG человека, меченные пероксидазой (пр-во ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Содержимое ампулы (сух.) доводили стабилизирующим раствором до 5 мл. Использовали рабочее разведение 1:200. Рабочий раствор конъюгата в объеме 100 мкл/лунка разливали в лунки планшетов и выдерживали 30 минут при 20-22С для реакции IgG антител, прореагировавших с АГ, с анти IgG конъюгата. После этого жидкость из лунок вытряхивали и трехкратно промывали фосфатно-солевым буферным раствором с твином от непрореагировавшего конъюгата. Следующий этап состоял в добавлении индикаторного раствора, основой которого является хромоген – тетраметилбензидин фирмы Merck (Германия). В каждую лунку планшета добавляли по 100 мкл тетраметилбензидина и выдерживали в темном месте при комнатной температуре в течение 5-15 минут. После чего реакцию останавливали внесением в каждую лунку по 50 мкл 0,9 моль/л H2SO4. Затем проводили измерение результатов анализа на энзиметре при =450 нм.
Исследования проводились на базе ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» РАМН (г. Москва). Все парные сыворотки до их исследования были заморожены, хранились в холодильнике при температуре -20С и исследовались одновременно.
Иммунохроматографический анализ выполнялся на тестах Binax NOW (производство ООО «Ниармедик плюс», Россия), разработанным для выявления растворимого антигена S. pneumoniae в моче. Исследование осуществлялось при поступлении пациента в инфекционный стационар, до назначения этиотропной терапии, при наличии информированного согласия больного. Для проведения анализа использовалась тест-кассета, содержащая мембрану с нанесенными в виде двух отдельных полосок кроличьими антителами к антигену S. pneumoniae и козьими антителами против IgG кролика в комбинации с конъюгатом из кроличьих антител к антигену .pneumoniae и анти-видовых антител, конъюгированных с окрашенными частицами. Вторая полоска дает контрольную линию, проявляющуюся розовым или красным цветом. Кассета имела лунку для внесения исследуемого в тесте образца, расположенную на противоположной стороне усстройства. Образцы мочи для исследования помещали в стандартные контейнеры, доводили до комнатной температуры (18-20С) и непосредственно перед тестированием перемешивали легким вращательным движением. Затем стерильный тампон на палочке (прилагаемый к диагностическому набору) погружали в мочу и помещали в кассету. Затем добавляли 3 капли реагента А (цитратно-фосфатного буфера с лаурил -сульфатом, Твином-20 и азидом натрия) из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывали, чтобы привести исследуемый образец мочи в контакт с тест-полоской. При наличие в моче антигена Spneumoniae происходило его связывание с находящимися на подложке антителами окрашенного конъюгата, а также с иммобилизованными на мембране кроличьми антителами к антигену .pneumoniae, в результате чего возникала окрашенная розовая или красная линия в зоне чтения образца. Иммобилизованные на полоске в виде линии козьи антитела против IgG кролика также связывали окрашенный конъюгат и формировали вторую контрольную-линию. Положительный результат регистрировали через 10-15 минут по наличию двух окрашенных линий в зоне чтения. На отрицательный результат указывала одна окрашенная контрольная линия, свидетельствуя о том, что антиген pneumoniae в тестируемом образце не обнаружен.
Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической венозной крови в отношении S. pneumoniae у медицинских работников изучалась в сравнительном выборочном скрининговом когортном эпидемиологическом исследовании, в котором приняли участие 34 медицинских работника (группа наблюдения) и 39 условно здоровых доноров крови, чья профессиональная деятельность не связана с медицинской практикой (группа сравнения). Группы были однородны по возрасту и не привиты против пневмококковой инфекции.
Пневмококки (клинический изолят) культивировали на кровяном агаре в течение суток, окрашивали в растворе флюоресцеина изотиоцианата (FITC) [53], помещали в раствор 10% глицерина, аликвотировали и замораживали при - 80С [101]. В отдельном эксперименте в качестве объектов фагоцитоза использовали обезвреженный формалином S. aureus Cowan I («Пермское НПО «Биомед»), окрашенный FITC. FITC-меченные бактерии смешивали с гепаринизированной (25 ЕД/мл) венозной кровью, инкубировали 30 мин при +37С (конечная концентрация пневмококков в реакционной смеси была подобрана предварительно и составила 6 107 кл/мл), лизировали эритроциты, лейкоциты отмывали и хранили на льду до анализа. Подсчёт фагоцитов, ассоциированных с бактериями, проводили методом проточной цитометрии по общепринятой методике на проточном цитофлюориметре BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США) [53]. В целях оценки безопасности иммунизации, у 194 человек группы наблюдения и второй группы сравнения до вакцинации и спустя 28 дней после иммунизации были взяты моча и венозная кровь, объемом 8-10 см для проведения ОАМ, ОАК, биохимического исследования крови (с определением общего билирубина, аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), общего белка и креатинина), а также определения в сыворотке крови JgE.
Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической венозной крови в отношении S. pneumoniae у медицинских работников
Как было обозначено нами ранее, уровень заболеваемости пневмониями, и уровень носительства S. pneumoniae у медицинских работников, значительно превышал таковой у лиц, профессионально не связанных с медицинской деятельностью.
В целях изучения механизмов более высокой восприимчивости медицинских работников к S. pneumoniae мы провели у них оценку фагоцитарной активности лейкоцитов периферической венозной крови в отношении S. pneumoniae, так как фагоцитоз является основным механизмом защиты макроорганизма от инфекций [47]. Результаты оценки интенсивности поглощения пневмококков лейкоцитами периферической венозной крови у медицинских работников и в группе сравнения (доноры крови) показали, что у медицинских работников доля фагоцитирующих нейтрофилов составила 11,7±1,1%, моноцитов -9,0±0,8% против 62,6±1,9% (p 0,001) и 59,5±2,1% (p 0,001), соответственно, у доноров (табл.8).
Таким образом, интенсивность нейтрофильного и моноцитарного фагоцитоза в отношении S. pneumoniae у лиц, занятых медицинской практикой, в 5-6 раз ниже, по сравнению с представителями немедицинских профессий. Вполне вероятно, что обнаруженные различия фагоцитарной активности свидетельствовали о снижении общей резистентности организма медицинских работников к инфекционным агентам и не являлись частным проявлением антипневмококкового иммунитета. Поэтому на следующем этапе нашего исследования мы оценили активность лейкоцитов в тех же группах по отношению к другому возбудителю - S. aureus. Результат оказался несколько иным. В образцах крови, полученных от медицинских работников, и в контрольных пробах в поглощении стафилококков участвовало большое число нейтрофилов: 76,7±3,5% и 86,1±2,3% соответственно (p 0,05). Следовательно интенсивность нейтрофильного фагоцитоза в отношении S. aureus у медицинских работников была более выраженной по сравнению с уровнем фагоцитоза к S. pneumoniae, но также оказалась ниже, по сравнению с представителями немедицинских профессий (p 0,05). Подобные результаты были получены и для моноцитов: 74,3±3,8% и 77,4±2,8% (p 0,05) (рис.18). Рис. 18. Доля фагоцитирующих нейтрофилов и макрофагов у медицинских и не медицинских работников по отношению к S. aureus (%)
Низкая интенсивность поглощения пневмококков и стафилококков лейкоцитами у медицинских работников может быть связана с состоянием клеток или их рецепторным аппаратом. Однако, более выраженные отличия между группами при поглощении S. pneumoniaе по сравнению с S. aureus, позволяют нам высказать гипотезу, что снижение поглощения пневмококков у медицинских работников отражает количество опсонинов в образцах крови.
В крови человека присутствуют так называемые натуральные антитела класса М, специфичные к различным серотипам капсульных полисахаридов пневмококка. Однако было показано, что эти антитела при введении их лабораторным животным не защищают последних от пневмококковой инфекции. В то же время, если животным ввести антитела, полученные после вакцинации доноров пневмококковой вакциной, это защитит реципиентов от пневмококковой инфекции. Источником таких защитных антител являются В-клетки маргинальной зоны селезёнки, формирование пула которых завершается к 2 годам жизни. Вакцинация вызывает активацию соответствующего клона, его пролиферацию, дифференцировку в IgM -, IgG -и IgA - секретирующие плазматические клетки без последующего формирования клеток памяти [127]. На основании вышесказанного можно предположить, что при частом контакте с пневмококками у медицинских работников происходит некоторое истощение пула В-клеток маргинальной зоны, специфичных к капсульным полисахаридам пневмококка. Это, в свою очередь, может вызвать недостаточность опсонизирующих антител крови и отразиться на эффективности фагоцитоза, а также стать причиной снижения концентрации IgA в секретах слизистых оболочек.
Обнаруженные различия фагоцитарной активности у медицинских работников по сравнению с группой сравнения могут свидетельствовать о снижении общей резистентности организма медицинских работников к инфекционным агентам и в частности к S. рneumoniae. Поскольку фагоцитоз является основным способом защиты макроорганизма от бактериальных инфекций, снижение фагоцитарной активности по отношению к S. pneumoniae скорее всего и будет одной из причин более частого инфицирования медицинских работников S.pneumoniae.
Серотиповой состав S. pneumoniae был изучен нами при исследовании 44 штаммов выделенных как от носителей, так и от больных с различными клиническими формами пневмококковой инфекции. Большинство изолятов было выделено из мокроты и крови, отдельные изоляты были выделены нами также из назофарингеальных мазков, спинномозговой жидкости (СМЖ) и жидкости среднего уха при проведении тимпаноцентеза (табл.9).
Применение иммунохроматографического метода для верификации пневмококковой пневмонии
Фоновые показатели биохимического анализа крови также соответствовали нормативным значениям и не имели достоверных различий в группах наблюдения и сравнения, полученные результаты в процессе наблюдения после вакцинации так же оставались в пределах нормы (табл.21). Иммунизация медицинских работников и лиц профессионально не связанных с медицинской деятельностью вакциной «Пневмо 23» не оказала негативного влияния на пигментный обмен – общий билирубин до иммунизации составил 11,5 ±0,4 и 13,5 ±0,4 при нормативном уровне 5-21 мкм/л, на 28-й день наблюдения он составил 11,2 ±0,8 и 12,4±0,8 соответственно (p 0,05). Ферментативная активность печени оставалась без патологических изменений как в группе наблюдения, так и в первой группе сравнения: АЛТ до вакцинации - 29,2±5,2 и 32,1±5,2, при нормативном уровне от 0 до 40 Ед/л, на 28-й день наблюдения - 26,4±1,4 и 30,2±1,4 соответственно; АСТ - 28,4 ±2,5 и 29,6±2,5 при норме от 0 до 40 Ед/л, на 28-й день наблюдения - 27,8 ±1,1 и 28,9±1,1 соответственно (p 0,05). Не было выявлено нарушений и в показателях очищения крови: креатинин до иммунизации в группе наблюдения составил - 74,7 ±1,6мкмоль/л, в группе сравнения - 72,2±1,6мкмоль/л при норме 44,0 – 100,0 мкмоль/л, на 28-й день - 73,6 ±1,2мкмоль/л и 71,9±1,2мкмоль/л в группе наблюдения и сравнения соответственно (p 0,05). Уровень мочевины в крови в группе наблюдения исходно составил - 5,4 ±0,1, в группе сравнения - 4,9±0,1, при нормативном показателе 2,2-7,2 Ммоль/л, в динамике наблюдения уровень мочевины составил - 5,6 ±0,1 и 5,0±0,1 в группе наблюдения и сравнения соответственно.
Показатели биохимического анализа крови у привитых полисахаридной пневмококковой вакциной в группе медицинских работников и лиц профессионально не связанных с медицинской деятельностью до и после иммунизации
Показатели общего анализа мочи, как в основной группе, так и в группе сравнения, после вакцинации по отношению к фоновым величинам статистически значимо не изменились и не выходили за пределы физиологической нормы.
Средние значения исходного уровня общего IgE в крови у привитых лиц в обеих группах находились в пределах физиологической нормы. Однако следует заметить, что в группе медицинских работников среднее значение сывороточного IgE в 1,7 раза превышало исходное значение IgE в группе сравнения (71,0±5,6 МЕ/л против 41,1±4,1 МЕ/л). Полученные результаты свидетельствуют о латентной сенсибилизации организма медицинских работников, которая, как известно, является фактором риска развития аллергических заболеваний. 70 -60 -50 -40 -30 20 -10 -0 Медицинские работники Не медицинские работники до вакцинации на 28 дней после вакцинации
Содержание сывороточных IgE у привитых полисахаридной пневмококковой вакциной в группе медицинских работников и лиц профессионально не связанных с медицинской деятельностью образования до и после иммунизации (МЕ/л)
Динамическое наблюдение за привитыми лицами в процессе иммунизации не выявило достоверных различий показателей общего IgE, как в группе наблюдения (t=0,5, p=0,586), так и в группе сравнения (t=0,2, p=0,848), что свидетельствует об отсутствии у вакцины аллергизирующих свойств (рис.19). 6.2. Иммунологическая эффективность вакцины «Пневмо 23» при иммунизации медицинских работников
При определении содержания в сыворотке крови привитых IgG-АТ к СП S. pneumonia до иммунизации, было установлено, что в основной группе cредняя геометрическая титра до прививки составила 65,9±4,4у.е., в группе сравнения – 62,1±6,5у.е (t=0,4, p=0,686). Серонегативных лиц в обеих группах наблюдения выявлено не было. После проведения профилактической прививки концентрация специфических антител возросла как в группе медицинских работников, так и в группе сравнения соответственно в 2,3 (t=9,3, p=0,000) и 2,4 (t=5,2, p=0,000) раза и составила 152,1±3,9 у.е и 149,8±4,1 у.е соответственно (рис.20). Уровень специфических антител после вакцинации в основной группе достоверно не отличался от такового в группе сравнения.
Уровень IgG антител к антигенам вакцины “Pneumo-23” в сыворотках крови у привитых полисахаридной пневмококковой вакциной в группе медицинских работников и лиц профессионально не связанных с медицинской деятельностью до и после иммунизации (средняя геометрическая титра) Проведенные нами исследования по оценке содержания в крови привитых медицинских работников IgG-АТ к СП S. pneumoniae спустя пять лет после иммунизации показали, что средняя геометрическая титра антител снизилась в 2,3 раз и составила 65,1±3,5у.е., достоверно не отличаясь от таковой до иммунизации. Однако, при определении среднегеометрической титра антител в возрастных группах 25-50 лет и 51-66 лет, установлено, что в группе медицинских работников 25-50 лет уровень титров антител снизился и составил 72,6 у.е. В группе же лиц более старшего возраста через 5 лет после иммунизации средняя геометрическая титра антител снизилась более значительно и составила 58,7 у.е., что сопоставимо с содержанием антител до иммунизации. Полученные данные подтверждают необходимость проведения медицинским работникам ревакцинации против пневмококковой инфекции через пять лет.