Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1. 1 Этиология, заболеваемость и социальная значимость ГБМ 19
1. 2 Эпидемиологическая характеристика ГБМ различной этиологии 25
1. 3 Эпидемиологический надзор за ГБМ 29
1. 4 Молекулярно-биологический мониторинг возбудителей ГБМ 38
1. 5 Метод мультилокусного секвенирования-типирования в эпидемиологическом надзоре за возбудителями ГБМ 54
ГЛАВА 2. Материалы и методы 62
2. 1 Материалы исследования 62
2. 2 Лабораторные методы исследования 68
2. 3 Программное обеспечение и Интернет-ресурсы 76
2. 4 Базы данных для генотипирования возбудителей и эпидемиологического анализа 78
2. 5 Эпидемиологические методы 88
2. 6 Статистические методы 89
ГЛАВА 3. Разработка молекулярно-биологических методик для внутривидовой классификации возбудителей ГБМ 90
3. 1 Определение капсульных антигенов 91
3. 2 Методики, основанные на секвенировании 104
ГЛАВА 4. Результаты определения эпидемиологически значимых капсульных антигенов 108
4. 1 Серогруппы N. meningitidis 110
4. 2 Серотипы S. pneumoniae 115
ГЛАВА 5. Результаты генотипирования 121
5. 1 Характеристика N. meningitidis 122
5. 2 Генотипирование S. pneumoniae 141
5. 3 Генотипирование H. influenzae 148
ГЛАВА 6. Использование результатов генотипирования в эпидемиологическом надзоре за ГБМ 156
6. 1 Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за генерализованными формами менингококковой инфекции 156
6. 1. 1 N. meningitidis серогруппы А 158
6. 1. 2 N. meningitidis серогрупп B, С и W 172
6. 1. 3 Определение вариабельных фрагментов белков наружной мембраны N. meningitidis и его эпидемиологическое значение 189
6. 2 Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за ГБМ, вызванными S. pneumoniae 205
6. 3 Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за ГБМ, вызванными Hib 211
Заключение 228
Выводы 233
Практические рекомендации 236
Перспективы дальнейшей разработки темы 238
Список литературы 239
- Эпидемиологический надзор за ГБМ
- Базы данных для генотипирования возбудителей и эпидемиологического анализа
- Генотипирование S. pneumoniae
- Определение вариабельных фрагментов белков наружной мембраны N. meningitidis и его эпидемиологическое значение
Эпидемиологический надзор за ГБМ
Основными возбудителями ГБМ и наиболее частыми возбудителями первичного менингита как самостоятельного заболевания являются бактерии видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, которые выделяются у примерно 90% больных c подтвержденным этиологическим диагнозом. Другим частым возбудителем ГБМ (в основном вторичных) являются бактерии вида Staphylococcus aureus, занимающие в общей этиологической структуре ГБМ третье или четвертое место, в зависимости от количества случаев ГБМ, обусловленных H. influenzae. Таксономическая классификация, способы культивирования, биохимические свойства и другие микробиологические особенности представителей этих видов отражены в соответствующих руководствах и многих публикациях [5, 16, 26, 33, 54, 55, 106, 188].
В этиологической структуре ГБМ в большинстве стран первое место занимает N. meningitidis. По данным И.С. Королевой и соавторов, N. meningitidis является этиологическим агентом ГБМ в 64,5% случаях заболеваний среди жителей Москвы в период наблюдения с 1981 по 2002 год; доля ГБМ, обусловленных S. pneumoniae и H. influenzae, при этом составляла 21,6% и 8,3% соответственно [40]. По данным последующих исследований в России соотношение возбудителей в этиологической структуре ГБМ и ГФМИ имеет устойчивый характер и в межэпидемический период 2002-2004 годов оно составляло примерно 67%, 15% и 4% для N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae соответственно [33]. На территории Москвы среди взрослых пациентов в период с 2011 по 2013 год соотношение возбудителей в этиологической структуре ГБМ и ГФМИ составляло 63% и 33% для N. meningitidis и S. pneumoniae соответственно, остальные возбудители встречались существенно реже – в 4% случаев [67]. Среди детей в возрасте до 5 лет соотношение возбудителей в период наблюдения с 1999 по 2001 год составляло 46%, 15-19% и 7-9% для N. meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae соответственно, при этом на долю прочих возбудителей приходилось 5-13% случаев, а для 14-17% случаев ГБМ этиологический диагноз установлен не был [95]. В недавно опубликованных данных соотношение возбудителей в этиологической структуре ГБМ на территории Москвы во всех возрастных группах составляет 40,6%, 16,7%, 15,7% и 8,8% для N. meningitidis, S. pneumoniae, S. aureus и H. influenzae, при этом на долю прочих возбудителей приходится 5,1% случаев и для 13,1% случаев ГБМ этиологический диагноз не установлен [3], то есть для этиологически расшифрованных случаев ГБМ наблюдалось соотношение 47%, 19% и 10% для N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae соответственно. Примерно такое же соотношение возбудителей наблюдалось в общей этиологической структуре ГБМ на территории России, начиная с 2010 года: 51-56%, 18-24% и 8-12% для N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae соответственно [70].
Таким образом, примерно половина всех случаев ГБМ, включая и ГФМИ, обусловлена N. meningitidis, вторым по частоте возбудителем в группе взрослых пациентов является S. pneumoniae, а в группе детей – H. influenzae. При этом соотношение возбудителей, также как и уровень заболеваемости, в регионах могут варьировать [70, 94]. Данные о соотношении возбудителей в этилогической структуре ГБМ могут быть искажены, поскольку возможны колебания в различной доле этиологически подтвержденных случаев в зависимости от качества лабораторной диагностики. На практике (без использования молекулярно-биологических методов диагностики) доля расшифрованных случаев ГБМ составляет в целом не более 40-50% [70, 97]. Не высокий процент этиологической расшифровки связан как с микробиологическими особенностями возбудителей (нестойкостью во внешней среде, плохой способностью расти на искусственных питательных средах), догоспитальном применении антибиотиков, так и с ограниченным использованием ПЦР-диагностики для этиологической расшифровки ГБМ. Также важно отметить, что в зависимости от проводимых противоэпидемических мероприятий на различных территориях с вовлечением соответствующих групп населения соотношение возбудителей может меняться. Клинически все формы инфекционных процессов, вызываемые N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, принято разделять на локализованные и генерализованные, обозначаемые также как неинвазивные и инвазивные. К инвазивным формам инфекций относятся клинические состояния, при которых возбудители обнаруживаются в стерильных в норме жидкостях (наиболее часто исследуемым типом клинического материала являются кровь и/или СМЖ), к неинвазивным – выделение возбудителей в клиническом материале, полученном из отделяемого верхних дыхательных путей или других местных очагов воспаления. Бактерии N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae также могут обуславливать тяжелые септические формы инфекции без клинически выраженного менингита, в частности менингококкцемию [33, 45, 100]. Клинические проявления инфекционных состояний, вызываемых бактериями видов H. influenzae и S. pneumoniae, отличаются большим, по сравнению с формами МИ, разнообразием; грань между локализованной и генерализованной формами инфекционного процесса, вызываемого этими возбудителями, не всегда можно четко обозначить, как при МИ. Кроме ГБМ, наиболее часто диагностируемыми заболеваниями, обусловленным H. influenzae и S. pneumoniae, являются пневмония (как бактериемическая, так и не бактериемическая), острый средний отит (ОСО), эпиглоттит, артрит и другие нозологические формы, включающие, в том числе, сочетанное поражение нескольких органов или систем организма [5, 33, 126, 160].
Инфекции, вызываемые N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, распространены повсеместно, но наибольшие показатели носительства и заболеваемости регистрируются в развивающихся странах. Стабильно высокие показатели заболеваемости МИ характерны для стран «менингитного пояса» Африки. Показатели заболеваемости в индустриально развитых странах Европы и Америки сильно варьируют в зависимости от периодов наблюдения [5, 13, 33, 39, 45, 100, 187, 188]. Заболеваемость ГБМ в России долгое время была не известна, регистрировались только случаи ГФМИ, и при этом не проводится раздельная регистрация клинических форм ГФМИ, поэтому не существует возможности отдельно оценить заболеваемость ГБМ, менингококкцемией и смешанной формой МИ. В то же время в отдельных локальных исследованиях был проведен мониторинг практически всех случаев ГБМ на некоторых территориях и достигнуты высокие показатели этиологической расшифровки за счет использования основанных на ПЦР методик, что позволило оценить истинную заболеваемость ГБМ и этиологическую роль каждого возбудителя [90, 94, 95, 115]. Впервые базовый показатель заболеваемости ГБМ был оценен в 2010-2012 годах, и он составил 2,2 на 100000 населения: показатели заболеваемости ГФМИ равнялись 1, а заболеваемость ГБМ, вызванными другими возбудителями – 1,2 на 100000 населения [44]. В последнее десятилетие наблюдается стабильное снижение заболеваемости ГФМИ [32, 34, 39, 46]. Как было ранее отмечено А.А. Деминой в текущем межэпидемическом периоде, «спад заболеваемости и спорадический уровень отражают равновесие, которое определяется между циркулирующими возбудителями в населении и иммунной толерантностью населения, сформировавшейся в период прошедшей эпидемии», а также то, что «это равновесие очень хрупкое, и в связи с этим возрастает роль эпидемиологического надзора» за МИ [22].
Базы данных для генотипирования возбудителей и эпидемиологического анализа
Для части образцов СМЖ было проведено исследование методом латекс агглютинации с помощью набора реагентов «Slidex meningite-Kit 5» («BioMerieux», Франция). Серогрупповая принадлежность штаммов, полученных на базе ФБУН «Центрального НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, была показана в реакции агглютинации со специфическими сыворотками «Менгрувид» (ФГУП «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток») [33]. Часть изученных штаммов N. meningitidis была протестирована с помощью моноклональных антител для определения субтипа. Панель моноклональных антител содержала следующие антитела к вариабельным фрагментам белка PorA: MN14C2.3 – субтип Р1.1, MN16C13F4 – P1.2, 5G8B2F9 – P1.3, MN20B9.34 – P1.4, MN22A9.19 – P1.5, MN19D6.13 – P1.6, MN14C11.6 – P1.7, MN5A10F – Р1.9, MN20F4.17 – Р1.10, MN21A7.10 – Р1.12, MN25H10.75 – Р1.13, MN21G3.17 – Р1.14, MN3C5C – Р1.15 и MN5C11G – Р1.16 [35]. Для характеристики штаммов пневмококка использован набор «Pneumotest-Latex» (Statens Serum Institut, Дания) [215]. Набор содержит 14 пулированных сывороток, позволяющих определять следующие серогруппы: 1, 2, 3, 4, 5, 6 (6A, 6B, 6C), 7 (7F, 7A, 7B, 7C), 8, 9 (9A, 9L, 9N, 9V), 10 (10F, 10A, 10B, 10C), 11 (11F, 11A, 11B, 11C, 11D), 12 (12F, 12A, 12B), 14, 15 (15F, 15A, 15B, 15C), 17 (17F, 17A), 18 (18F, 18A, 18B, 18C), 19 (19F, 19A, 19B, 19C), 20, 22 (22F, 22A), 23 (23F, 23A, 23B), 33 (33F, 33A, 33B, 33C, 33D), а также некоторые другие серогруппы, не входящие в состав существующих вакцин. Для дифференциации серотипов внутри определяемых серогрупп использован набор факторных антисывороток (Statens Serum Institut, Дания).
Для штаммов Hib, исследованных в 1999-2001 годах, было проведено определение биотипов с использованием набора реагентов «API NH» («BioMerieux», Франция). Все данные, полученные с использованием вышеперечисленных «классических» серологических методик, являются результатом работы коллег автора в ходе исследований, отраженных в совместных публикациях. Необходимо отметить огромный вклад в эти исследования сотрудников Российского референс-центра по мониторингу за бактериальными менингитами ФБУН «Центрального НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора под руководством д.м.н. И.С. Королевой, а также вклад сотрудников НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленский государственный медицинский университет» МЗ РФ под руководством д.м.н. Р.С. Козлова и врачей микробиологических лабораторий стационаров, из которых поступал клинический материал для дальнейшего углубленного изучения. В данной работе результаты, полученные «классическими» серологическими методами, используются исключительно для необходимого сопоставления с результатами, полученными с помощью разработанных автором методик, основанных на ПЦР (см. ниже).
При выделении ДНК из культур использовались бактериальные смывы, приготовленные следующим образом: стерильным ватным тампоном с поверхности агара собиралась бактериальная культура, тампон помещался во вскрытую ампулу, содержащую стерильный физиологический раствор объемом 2 мл, и содержимое ампулы перемешивалось. Концентрация бактерий в смыве, измеренная по стандарту мутности, составляла в среднем 109-1010 клеток в 1 мл. При выделении ДНК из лиофилизированной культуры или приготовлении смывов с культуральных сред, находящихся в пробирках, в ампулу или пробирку со средой добавлялось 0,5-2 мл «PBS-буфера» (NaCl –137 Мм, KCl – 2,7 Мм, Na2PO4 – 10 Мм, KH2PO4 – 2 мМ; pH: 7,4) или «ТЕ-буфера» (Трис-НСl – 10 мМ, ЭДТА – 1 мМ; pH: 8,0), после этого растворимая часть, содержащая микроорганизмы, отбиралась и помещалась в отдельную пробирку. Приготовленные бактериальные суспензии делились на аликвоты и хранились при –20 С.
Выделение ДНК из бактериальных суспензий проводилось либо набором реагентов «ДНК-сорб-А» (из 20-30 мкл смыва), либо по следующей методике. Бактериальные суспензии объемом 250-500 мкл прогревалась при 95 С в течение 5-10 минут. После прогрева суспензии центрифугировалась 10 минут при скорости 12000 оборотов в минуту на микро-центрифуге для пробирок типа «эппендорф», например «MiniSpin plus» («Eppendorf», Германия). После центрифугирования из пробирок отбиралась надосадочная жидкость, содержащая бактериальную ДНК, и готовились разведения ДНК в ТЕ-буфере до концентрации 105-106 геномных эквивалентов в 1 мл для постановки ПЦР.
Выделение ДНК из клинических образцов проводилось с использованием наборов реагентов «РИБО-сорб-A» или «РИБО-сорб-AМ» – при выделении из СМЖ, или с использованием набора реагентов «РИБО-преп» – при выделении из СМЖ, крови, секционного материала или других клинических образцов.
Генотипирование S. pneumoniae
В основе ПЦР-ЭФ методики с праймерами, рекомендованными [200], лежит использование апробированных ранее методик [139, 146, 198, 202] с известной аналитической специфичностью, для соответствующих серотип специфических мишеней в геноме S. pneumoniae, что является ключевым преимуществом данного подхода. В то же время использование метода ПЦР-ЭФ имеет ряд недостатков, среди которых можно отметить возможные сложности при визуальной интерпретации результатов электрофореза, неодинаковую чувствительность для серотип-специфических мишеней, обусловленную необходимостью амплификации мишеней разной длины, а также стандартные сложности, связанные с лабораторным использованием метода ПЦР-ЭФ [24]. Существенным ограничением использования ПЦР-ЭФ методик [139, 146, 198, 202] и протоколов исследований, рекомендованных [200], в лабораторной практике является материал для исследования: данные подходы предполагают исследование ДНК, выделенной из штаммов, а не из клинического материала, содержащего ДНК S. pneumoniae. С целью избежать сложностей, связанных с лабораторным применением методики ПЦР-ЭФ, а также с учетом необходимости определения серотипов S. pneumoniae в клиническом материале нами была разработана оригинальная методика, основанная на ПЦР-РРВ. При разработке методики также принималось во внимание удобство постановки ПЦР: каждая ПЦР-смесь содержала максимальное количество серотип специфических мишеней (которое было ограничено только количеством каналов флуоресцентной детекции прибора), а также положительный внутренний контроль присутствия ДНК S. pneumoniae. Первые две ПЦР-смеси содержали серотип-специфические мишени для детекции наиболее часто распространенных серотипов S. pneumoniae, ассоциированных с ГБМ.
На основании анализа серотип-специфических генетических локусов были выбраны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченые зонды для определения 16 серотипов S. pneumoniae, представленные в таблице III приложения 1. Для детекции некоторых серотип-специфических мишеней были использованы праймеры, опубликованные в предыдущих исследованиях; необходимость перевыбора праймеров связана с изменением способа детекции продукта амплификации – проведением ПЦР-РРВ. Некоторая часть праймеров для методики ПЦР-РРВ была разработана ранее в исследованиях [139, 198, 202] и не была изменена в данной методике. При выборе альтернативных праймеров для амплификации всех серотип-специфических мишеней использованы локусы бактериального генома, включающие сайты отжига соответствующих праймеров, рекомендованных [200]. При проведении ПЦР-РРВ в формате «мультипрайм» олигонуклеотиды для детекции серотип-специфических мишеней были распределены по четырем реакционным смесям: реакции № 1-4. В каждой реакционной смеси содержалось пять пар праймеров и пять зондов для определения четырех серотипов S. pneumoniae и детекции фрагмента гена cpsA, присутствующего у всех капсульных S. pneumoniae (см. таблицу III приложения 1). Постановка ПЦР-РРВ и интерпретация результатов описаны в главе «Материалы и методы». Продукты амплификации серотип-специфических мишеней детектируются по четырем каналам флуоресценции для флуорофоров FAM, R6G, ROX и Cy5 в соответствии с серотип-специфичными зондами, представленных в таблице III приложения 1; детекция продукта амплификации фрагмента гена cpsA проводится по каналу для флуорофора Cy5.5.
Для определения аналитической специфичности проведено тестирование 108 коллекционных штаммов S. pneumoniae (см. главу «Материалы и методы»), охарактеризованных также c помощью ПЦР-ЭФ методики в [80]. Ложноположительных или ложноотрицательных результатов ПЦР-РРВ для 14 исследованных серотипов выявлено не было. Возможность и специфичность определения методикой серотипа 2 подтвердить не удалось ввиду отсутствия контрольных штаммов. Клиническая апробация методики проведена в рамках микробиологического мониторинга S. pneumoniae, вызвавших ГБМ на территории Москвы. В качестве метода сравнения использована ПЦР-ЭФ методика для определения серотипов S. pneumoniae с праймерами, рекомендованными [200] (см. раздел 3. 1. 2. 1). Результаты клинической апробации и эпидемиологический анализ выявленных серотипов представлены в разделе 4. 2.
Одним из вариантов модификации разработанной методики ПЦР-РРВ является вариант анализа с использованием оборудования для проведения ПЦР-РРВ с шестью каналами флуоресцентной детекции, которое позволяет применить разработанные серотип-специфические праймеры и зонды оптимальным образом. На первом этапе анализа используется две реакции в формате «мультипрайм», содержащие праймеры и зонды для выявления наиболее частых или актуальных для решения той или иной задачи серотип-специфических мишеней. Например, первая реакция может содержать праймеры и зонды для серотипов 3, 6BA, 19F, 4 и 18, и вторая реакция – праймеры и зонды для серотипов 1, 9NL, 23F, 11AD и 14. В данной модификации пять серотип-специфических зондов метятся флуорофорами FAM, R6G, ROX, Cy5 и Cy5.5, а зонд для детекции фрагмента гена cpsA – флуорофором Alexa350. В случае если в обеих реакциях серотип не определяется и детектируется сигнал, соответствующий амплификации фрагмента гена cpsA, может быть проведено дополнительное исследование с целью обнаружения других серотип-специфических мишеней методом ПЦР-ЭФ или ПЦР-РРВ с использованием соответствующих олигонуклеотидов, не включенных в эти реакции [89]. Результаты определения серотипов с помощью описанной модификации методики ПЦР-РРВ представлены на рисунке 5.
Определение вариабельных фрагментов белков наружной мембраны N. meningitidis и его эпидемиологическое значение
Наиболее часто были выявлены серотипы 3 (12 образцов, 13%), 23F (13%), 4 (8 образцов, 9%) и 18 (7 образцов, 8%). Из найденных образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae серотипа 6А или серотипа 6В, в одном образце найдена ДНК серотипа 6А, в 5 образцах – ДНК серотипа 6В (см. раздел 3. 1. 2. 3).
В исследованных образцах СМЖ было выявлено 14 серотип-специфических мишеней ПЦР-ЭФ методикой и 12 серотип-специфических мишеней – ПЦР-РРВ методикой. В то же время серотип был определен ПЦР-ЭФ методикой у 66 (74%) образцов, а ПЦР-РРВ методикой – у 70 (79%) образцов, что обусловлено, по-видимому, более высокой чувствительностью технологии ПЦР-РРВ. Выявление ПЦР-ЭФ методикой серотипов 12F и 8, не характерных для возбудителей пневмококковых менингитов, циркулирующих на территории России [8, 70], и не входящих в состав конъюгированных вакцин, не дает основания полагать, что методика ПЦР-ЭФ (также как и ее аналоги [200]) будет иметь преимущество при проведении микробиологического мониторинга возбудителей ГБМ.
Наиболее эффективным способом определения серотипов S. pneumoniae, ДНК которых может быть обнаружена в СМЖ, является ПЦР-РРВ исследование с реакцией № 2, которое позволяет в одной постановке определить серотип у наибольшего количества образцов (33%). Наименее эффективным ПЦР-РРВ исследованием для образцов СМЖ является реакция № 4 (2%), которая, в первую очередь, предназначена для детекции редких в России серотипов 7F и 19A, входящих, тем не менее, в состав 13-валентной вакцины. В совокупности реакции № 1-3 позволяют определить серотип в не менее чем 75% образцах СМЖ. Поэтому, для определения серотипов S. pneumoniae в образцах СМЖ оптимальный алгоритм применения ПЦР-РРВ методики, должен выглядеть следующим образом: сначала проводится исследование образца в реакции № 2, затем cpsA-положительные образцы исследуются в реакциях № 1 и № 3. Если серотип не определяется, образец должен быть дополнительно исследован в реакции № 4 для определения двух серотипов, входящих в состав 13-валентной вакцины, или с использованием методики ПЦР-ЭФ для расширенного определения серотипов. В то же время при исследовании клинического материала, забранного в рамках изучения эффективности вакцинации при других формах пневмококковой инфекции, алгоритм исследования может быть изменен. Например, при ОСО, рациональнее начинать исследование с реакции № 1, с помощью которой, с учетом данных [92], можно рассчитывать определить серотип у 60% S. pneumoniae пневмококков, присутствующих в образцах, взятых при парацентезе.
Определенным недостатком всех использующихся в настоящее время основанных на ПЦР схем для определения серотипов S. pneumoniae является то, что внутри некоторых выявляемых серогрупп (например, серогруппы 18) не удается дифференцировать входящие в них серотипы (например, серотипы 18F, 18A, 18B, 18C). Этот недостаток не является принципиальным, поскольку, по данным эпидемиологических исследований [8, 163, 165], в популяции циркулирующих пневмококков доминирует только один серотип из такой группы (в данном случае – серотип 18C, входящий в состав конъюгированных вакцин), а остальные серотипы практически не обнаруживаются. Поэтому широко используемый в микробиологической практике набор реагентов для определения серотипов S. pneumoniae с помощью комплекта специфических пулированных сывороток «Pneumotest-Latex» (Statens Serum Institut, Дания) [215] также не предусматривают возможности дифференциации серотипов внутри некоторых серогрупп. Если дифференциация серотипов внутри одной серогруппы имеет значение при выборе оптимального препарата для иммунопрофилактики, в схему исследования могут быть интегрированы дополнительные молекулярно-биологические методики: например, методика для дифференциации серотипов 6A (входит только в состав 13-валентной вакцины) и 6B (входит в состав всех вакцин) [80, 199] (см. раздел 3. 1. 2. 3).
Таким образом, разработанная методика ПЦР-РРВ позволяет определять серотип S. pneumoniae у не менее 75% штаммов или клинических образцов СМЖ, содержащих ДНК S. pneumoniae. Методика позволяет определять серотип-специфические мишени, необходимые для планирования и мониторинга эффективности иммунопрофилактики с применением существующих конъюгированных вакцин, и в перспективе может быть использована для микробиологического мониторинга серотипов штаммов S. pneumoniae, ассоциированных с другими формами ПИ. При проведении расширенного микробиологического мониторинга, выходящего за рамки исследования серотипов, входящих в состав конъюгированных вакцин, могут быть использованы как разработанная ПЦР-ЭФ методика (см. раздел 3. 2. 2. 1), так и дополнительные возможности для идентификации серотип-специфических мишеней с помощью альтернативных ПЦР методик [200]. Определение серотипов штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae, в совокупности с методиками генотипирования, в первую очередь МЛСТ, может быть использовано в комплексной характеристике циркулирующих штаммов без этапа высева возбудителя, что существенно расширяет возможности сбора эпидемиологически значимой информации.
Дальнейшее практическое применение ПЦР-РРВ методики для определения серотипов штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae, было реализовано к.м.н. Г.В. Белошицким в рамках работ, проводимых Российским референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами (руководитель – д.м.н. И.С. Королева) [6, 9, 70], методика также была использована в других проспективных исследованиях, связанных с микробиологическим мониторингом S. pneumoniae [25, 83, 87, 89, 220].