Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об эпидемическом и эпизоотическом процессах бешенства 14
1.1. История изучения бешенства 14
1.2. Эпизоотологические особенности рабической инфекции
1.2.1. Распространенность рабической инфекции в мире и Российской Федерации 17
1.2.2. Возбудитель рабической инфекции 20
1.2.3. Специфическая лабораторная диагностика 21
1.2.4. Классификация очагов бешенства
1.2.4.1. Особенности природных очагов бешенства 27
1.2.4.2. Особенности антропургических очагов бешенства 27
1.3. Эпидемиологические особенности бешенства 28
1.3.1. Распространенность гидрофобии в мире, в Российской Федерации29
1.3.2. Пути и факторы инфицирования человека, клинические проявления гидрофобии
1.4. Профилактика и противоэпидемические мероприятия против бешенства у животных 32
1.5. Специфическая профилактика бешенства у людей 34
1.6. Эпидемиологический надзор за бешенством 35
Глава 2. Материалы и методы исследований 39
Глава 3. Эпизоотические особенности бешенства в Липецкой области 49
3.1. Краткое физико-географическое и социально-экономическое описание Липецкой области 49
3.2. Эпизоотология бешенства в Липецкой области
3.2.1. Животные Липецкой области, чувствительные к вирусу бешенства50
3.2.2. Характеристика динамики эпизоотического процесса, заболевания животных на территориях Липецкой области з
3.2.3. Видовая структура больных бешенством животных 61
3.2.4. Внутригодовая динамика заболеваний бешенством животных 63
3.2.5. Распространенность случаев бешенства животных в Липецкой области 67
3.2.6. Мероприятия по профилактике бешенства животных в Липецкой области 69
3.3. Сравнительная характеристика эпизоотического процесса бешенства в Липецкой области и на сопредельных территориях 75
3.4. Характеристика вирусов бешенства, циркулирующих на территории Липецкой области 3.4.1. Вирусологическая характеристика штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Липецкой области 78
3.4.2. Молекулярно-генетическая характеристика вирусов бешенства, циркулирующих на территории Липецкой области 84
Глава 4. Эпидемиологические особенности и эпидемиологический надзор за бешенством на территории липецкой области 90
4.1. Заболеваемость населения гидрофобией в Липецкой области в 1954-1995 гг 90
4.2. Обращаемость населения за антирабической помощью в Липецкой области в 2001-2010 гг 4.2.1. Внутригодовая динамика обращаемости за антирабической помощью в Липецкой области в 2001-2010 гг 97
4.2.2. Распределение обращаемости за антирабической помощью по административным территориям Липецкой области в 2001-2010 гг . 9 8
4.2.3. Обращаемость за антирабической помощью различных групп населения в Липецкой области в 2001 - 2010 гг 99
4.3. Анализ оказания антирабической помощи населению в Липецкой области в 2001 -2010гг 115
Глава 5. Совершенствование эпидемиологического надзора за бешенством на территории Липецкой области
5.1. Совершенствование информационной подсистемы эпидемиологического надзора за бешенством в Липецкой области 122
5.2. Совершенствование блока диагностической системы эпидемиологического надзора
5.2.1. Совершенствование оперативного и ретроспективного анализа. 124
5.2.2. Ранжирование территорий Липецкой области по степени риска заражения бешенством 125
5.3. Совершенствование управленческого блока эпидемиологического надзора за бешенством в Липецкой области 128
Заключение 133
Выводы 146
Практические рекомендации 148
Список сокращений 149
Список литературы 1
- Специфическая лабораторная диагностика
- Эпизоотология бешенства в Липецкой области
- Вирусологическая характеристика штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Липецкой области
- Распределение обращаемости за антирабической помощью по административным территориям Липецкой области в 2001-2010 гг
Введение к работе
Актуальность исследования. В мире на современном этапе происходит глобальный рост рабической инфекции. В Российской Федерации (РФ) также обострилась проблема бешенства вследствие формирования новых очагов инфекции, а также на фоне обострения социальных проблем, сокращения централизованного финансирования профилактических мероприятий. Бешенство приносит серьезный экономический ущерб, ежегодные затраты на иммунизацию населения составляют десятки миллионов рублей, на вакцинацию диких и сельскохозяйственных животных - 15 и более млн. рублей, ликвидацию очагов бешенства - около 8-9 млн. рублей (Черкасский Б.Л. с соавт., 2005).
В РФ в период 2006-2011 гг. антирабическую помощь получали ежегодно около 400 тыс. человек (302,4 /оооо), из них 25% - дети. Обращаемость имела тенденцию к росту (среднегодовой темп прироста - 2,4%); наиболее высокий показатель регистрировался в Южном (352,4 /оооо), Приволжском (328 /оооо), Центральном (313,2%0оо) Федеральном округах (ФО). Зарегистрировано 70 случаев гибели людей от гидрофобии, самым неблагополучным являлся Центральный ФО (38,6% больных) (Бешенство в РФ в 2006-2011 гг. Инф. бюллетень, 2013).
В 2007 - 2011 гг. бешенство животных регистрировалось в 69 субъектах; самыми неблагополучными являлись Центральный (плотность инфекции - 2,5 случаев бешенства на 1000 кв. км) и Приволжский (1,3) ФО.
Негативными факторами, способствующими активизации
эпизоотического и эпидемического процессов, являются неполный охват домашних животных учетом, профилактической иммунизацией, рост численности бездомных животных, нарушение правил содержания домашних животных, неудовлетворительное проведение мероприятий по регулированию численности диких плотоядных (Черкасский Б.Л. с соавт., 2005).
Для Липецкой области изучение данных вопросов крайне актуально, т.к. она входит в пятерку наиболее неблагополучных субъектов РФ по бешенству животных. По плотности инфекции область заняла 2 место после Белгородской (5,7 и 7,3 соответственно). С 2002 г. зарегистрирована самая интенсивная эпизоотия за последние 40 лет. Проблема профилактики гидрофобии относится к группе инфекций, имеющих наиболее высокую эпидемиологическую и экономическую значимость на территории области. Показатель обращаемости за антирабической помощью населения области (315,5 /оооо) превышает средний в РФ (Бешенство в Российской Федерации: инф.-аналит. бюллетень, 2013 г.).
Перечисленное указывает на высокий риск инфицирования населения области лиссавирусами. Поэтому исключительную важность на региональном
уровне приобретают углубленный ретроспективный анализ
эпидемиологических и эпизоотологических особенностей бешенства, выявление групп, территорий риска, времени и факторов риска, которые позволят совершенствовать систему эпидемиологического надзора, снизить риск развития гидрофобии.
Степень разработанности темы исследования. Изучены особенности эпизоотического процесса бешенства в период 1954 - 2005 гг., проведено ранжирование районов по степени опасности возникновения вспышек бешенства по количеству случаев бешенства животных на административных территориях Липецкой области (1993 - 2005 гг.). Изучена профилактика бешенства в части, касающейся эффективности оральной вакцинации (Жуков И.В., 1985; Гурьев М.С., 2009). Однако важен вопрос изучения особенностей эпизоотического процесса бешенства в современный период, углубленный анализ профилактических мероприятий (иммунизация домашних плотоядных животных, отлов бездомных животных, отстрел лисиц), ранжирование административных территорий области по степени эпидемиологической опасности заражения бешенством по интегральному показателю для дифференцированного проведения профилактических мероприятий.
Изучена вирулентность циркулирующих в Липецкой области изолятов лиссавирусов (Гурьев М.С., 2009). Однако актуальное значение приобретает изучение биологических и генетических свойств возбудителя и их роли в распространении инфекции.
Частично изучены эпидемиологические особенности бешенства в Липецкой области в 1996 - 2002 гг. (Мищук В.И. с соавт., 2003). Однако не выявлены эпидемиологические особенности бешенства, не установлены факторы риска развития гидрофобии, отсутствуют предложения по совершенствованию системы эпидемиологического надзора.
Цель исследования - совершенствование системы эпидемиологического надзора, мер профилактики бешенства на основе выявленных эпидемиологических и эпизоотологических особенностей бешенства в Липецкой области.
Задачи исследования:
1. Выявить региональные особенности эпизоотического процесса за
период с 1954 по 2010 гг. для ранжирования территорий области по степени
риска заражения бешенством, современные особенности за период с 2001 по
2010 гг.
-
Выявить биологические особенности циркулирующих лиссавирусов.
-
Выявить особенности эпидемического процесса на территории области за период с 1954 по 1995 гг.
4. Провести оценку существующей системы эпидемиологического
надзора за бешенством в Липецкой области за период с 2001 по 2010 гг.
5. Разработать и внедрить дополнительные меры эпидемиологического
надзора за бешенством на территории области.
Научная новизна работы. Выявлены эпизоотологические особенности бешенства в современный период (2001 - 2010 гг.), характеризующиеся высокой интенсивностью эпизоотического процесса, природным типом, выраженной зимне-весенней и осенне-зимней сезонностью, поддерживаемым лисицей. Изучены эпизоотические особенности для каждой группы животных, вовлеченных в эпизоотический процесс. Установлены факторы, определяющие интенсивность эпизоотического процесса: плотность популяции лисиц и бездомных животных на территориях.
Впервые проведено интегральное ранжирование с учетом индекса эпизоотичности, плотности инфекции, плотности популяции лисиц на 1000 кв. км. территорий, по степени эпидемиологической опасности заражения бешенством, определены территории риска.
Впервые выявлены эпидемиологические особенности бешенства в области, характеризующиеся низкой интенсивностью, весенне-летней сезонностью, преобладанием в структуре взрослых мужчин. Изучены факторы риска развития гидрофобии: опасная локализация покусов, не обращение или несвоевременное обращение за антирабической помощью, прерывание или неполный курс иммунизации. Установлены негативные факторы увеличивающие риск развития гидрофобии в современный период: интенсивное вовлечение детей 7-14 лет, рост обращаемости по поводу покусов, нанесенных бездомными животными.
Впервые установлено, что в области циркулируют средне - и высоковирулентные лиссавирусы, относящиеся к кластеру степных вирусов бешенства с высоким уровнем гомологии с вирусами Белгородской и Воронежской областей, являющихся частью Среднерусского природно-очагового региона.
Разработаны и внедрены дополнительные мероприятия в систему эпидемиологического надзора за бешенством.
Обоснована тактика иммунизации домашних и сельскохозяйственных животных против бешенства в зависимости от сезонности эпизоотического процесса и степени риска эпидемической опасности территории.
Теоретическая и практическая значимость работы. Изучены вирусологические, молекулярно-генетические особенности циркулирующих вирусов бешенства, группы риска, территории риска, время, факторы риска,
влияющие на активность эпидемического и эпизоотического процессов бешенства на территории области.
Усовершенствована система эпидемиологического надзора за бешенством в области.
Обоснована тактика иммунизации животных против бешенства в зависимости от сезонности эпизоотического процесса и степени риска эпидемической опасности территории.
Результаты исследований внедрены в: Комплексный план мероприятий профилактики инфекционных заболеваний на территории Липецкой области на 2011 - 2015 гг. (акт внедрения №1841-ПТ от 26.08.2014 г.); Закон Липецкой области от 14.14.2011г. №585-03 «О размере денежного вознаграждения за истребление лисицы красной» (акт внедрения №1841-ПТ от 26.08.2014 г., акт внедрения от 07.05.2014 г.); Правила содержания домашних животных на территории Добровского района Липецкой области от 21.01.2014 г. (акт внедрения от 07.05.2014 г.); Методические рекомендации «Организация эпидемиологического надзора за бешенством на территории Липецкой области» от 22.08.2014 г. (акт внедрения от 25.08.2014 г.).
Материалы работы внедрены в учебный процесс на кафедре гигиены и эпидемиологии с основами лабораторного дела Факультета повышения подготовки ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» (г. Липецк; акт внедрения от 24.04.2015 г.).
Методология и методы исследования. Исследование выполнено в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Северозападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова».
Для достижения цели и решения поставленных задач использовались эпидемиологические, статистические, зоологические, вирусологические, молекулярно-генетические, филогенетические методы исследований.
Ранжирование административных территорий Липецкой области по
степени риска эпидемиологической опасности заражения бешенством
выполнено на основании методик, разработанных в ФБУН «Омский НИИ
природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора по 3 эколого-
эпизоотологическим характеристикам: индексу эпизоотичности за 2001 - 2010
гг. (отношение числа лет в течение которых район был неблагополучен, к числу
анализируемых лет); плотности инфекции (среднее число случаев бешенства за
2001 - 2010 гг. на 1 000 кв. км общей площади района); средней годовой
плотности популяции лисиц в 2001 - 2010 гг. на 1000 кв. км по данным
послепромысловых зимних маршрутных учетов. Внедрены
геоинформационные технологии (Карта «ГИС 2005» и электронная ландшафтно-географическая карта Липецкой области).
Положения, выносимые на защиту:
1. Липецкая область с 2007 г. находится на втором месте в РФ по
активности эпизоотического процесса (плотность инфекции - 5,7 на 1000 кв.
км), с 2002 г. зарегистрирована самая интенсивная эпизоотия за последние 40
лет. Основной резервуар инфекции - лисица красная, неблагоприятным
фактором является превышение ее численности относительно эпизоотически
безопасного уровня (1 особь на 1000 га охотничьих угодий) на территориях
области в 2,0 - 3,7 раза.
2. Молекулярно-генетическими исследованиями лиссавирусов
установлено, что они относятся к кластеру степных вирусов, циркулирующих
на сопредельных территориях Воронежской, Белгородской, Тульской областей,
являющихся частью Среднерусского природно-очагового региона.
3. Выявленные особенности эпизоотического и эпидемического процесса
бешенства на территории области позволили разработать предложения по
совершенствованию эпидемиологического надзора и основные направления
проведения профилактических мероприятий.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных результатов и выводов обеспечена представительностью анализируемых выборок, использованием адекватных и современных методов исследования и статистической обработкой полученных результатов, методик проведения расчетов, выполнением исследований на базе аккредитованных лабораторий, апробацией результатов и положений в рецензируемых журналах.
Диссертационная работа представлена на совместном заседании кафедры эпидемиологии, паразитологии, дезинфектологии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Результаты работы изложены и обсуждены на научно-практических конференциях: Областной - «Вопросы профилактики бешенства» (г. Липецк, 2010); Всероссийской с международным участием - «Современные аспекты природной очаговости болезней» (Омск, 2011); 15-ой республиканской с международным участием - «Социально-гигиенический мониторинг здоровья населения» (г.Рязань, 2011); Региональной - «Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия и сохранения здоровья населения: итоги и перспективы» (г. Липецк, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 13 научных работ, в том числе 5 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ для публикаций основных положений диссертаций на соискание ученой степени.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 166 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 26 таблицами, 1 фотографией и 80 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы исследований, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, приложения. Библиографический указатель включает 170 источников, в том числе 41 - зарубежных.
Специфическая лабораторная диагностика
Бешенство - зооноз, для которого диагностические методы стандартизированы ВОЗ. Лабораторная диагностика основана на выявлении вируса или его включений в материале от больных или погибших людей и животных. Для исследования берут пробы ткани мозга, слюнных желез, спинномозговую жидкость, мазки-отпечатки роговицы и другой материал. В случаях прижизненной диагностики бешенства у человека исследуют пробы слюны, биопсии кожи волосистой части головы, сыворотку крови и ликвор. Разработаны вирусологические и серологические методы идентификации вируса и противовирусных антител [20, 28, 30,32,72,87,104,130,131]. Методы прямого обнаружения антигена вируса бешенства:
1. Метод световой микроскопии - позволяет выявлять в клетках нервной ткани специфические цитоплазматические включения - тельца Бабеши-Негри. Преимущество метода - экспрессность (45 - 60 минут), однако он недостаточно результативен, так как позволяет лишь в 40-73% случаев поставить положительный диагноз [36, 72].
2. Реакция диффузной преципитации (РДП) основана на образовании преципитатов-комплексов «антитело-антиген» в агаровом геле. Преимущество- простота выполнения, возможность исследования разложившегося материала. РДП используют как дополнительный диагностический тест в связи с ограниченной чувствительностью (65-70%) и ложноположительными результатами [36, 72].
3. Метод флуоресцирующих антител (МФА) заключается в образовании светящихся комплексов «антиген-антитело». Основное преимущество - возможность получить результат через несколько часов. Метод обязателен для подтверждения результатов биопробы и гистологического метода. С помощью МФА возможно прижизненное обнаружение антигена вируса бешенства в эпителиальных клетках роговицы. К недостаткам относятся необходимость подавления неспецифического свечения при исследовании патологически измененной ткани и исследование только пробы свежего мозга [20, 29, 30, 36, 39, 72, 87].
4. Гистохимический вариант твердофазного иммуноферментного анализа применяется в качестве альтернативы МФА в полевых условиях, позволяет идентифицировать специфический антиген в разложившемся и в консервированном материале [36, 72].
5. Метод подавления иммунофлуоресценции основан на способности раби-ческого антигена, связанного с нефлуоресцирующими антителами, вторично не входить в соединение с флуоресцирующим специфическим конъюгатом [36, 72].
6. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФ-ИФА) основан на сорбции антигена в разных разведениях на иммобилизированные специфические глобулины с последующим выявлением антигена глобулинами конъюгированными с пероксидазой хрена. По чувствительности метод уступает биопробе при исследо 23 вании свежего материала, но позволяет обнаружить инактивированный ВБ [36, 72]. Методы выделения вируса бешенства:
1. Биологическая проба (БП) - выделение ВБ от больных бешенством животных путем инокулирования патологического материала белым мышам. Её проводят, если выявление рабического антигена ИФМ или РДП в первичном материале окажется отрицательным. Имеет ряд недостатков: необходимо использовать большое количество животных; продолжительное время (инкубационный период при заражении уличным ВБ варьирует от 7 - 25 дней до 2 месяцев); для выполнения БП необходимы особые условия, значительные экономические затраты. Метод является самым чувствительным и обязательным тестом при исследовании патологического материала на бешенство [30, 36, 72, 141, 161].
2. Выделение и идентификация ВБ в культуре клеток. Для этой цели используют различные клеточные системы. Данная методика не может применяться в каждой лаборатории, необходимы навыки работы с культурой клеток, постоянное поддержание культуры [29, 38, 72135, 152].
Методы обнаружения генома ВБ: 1. Дот-гибридизация - выявление и идентификация вирусной РНК с исполь зованием специфической ДНК-зондов. Выявление РНК вируса бешенства мето дом гибридизации insitu соответствует выявлению антигена, оцениваемому им мунопероксидазным методом, она позволяет определять небольшое количество инфицированных клеток из общего числа. Это дает преимущество в диагностике на ранней стадии инфекции. Метод может применяться в ретроспективной диа гностике инфекции в мозге людей, умерших от бешенства и хранившихся не сколько лет. Таким образом, гибридизация insitu может применяться в случаях, когда выявление специфического антигена дает четкие результаты и невозможно выделить ВБ в культуре клеток или на лабораторных животных[36, 72, 87]. 2. Полимеразная цепная реакция (ПНР) наиболее удобна для экспресс диагностики ВБ и идентификации лиссавирусов. Метод надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концен 24 трации. Используется для подтверждения результатов МФА, для определения вируса в слюне, в луковицах волос заднего отдела шеи и головы, даже в разложившемся патологическом материале. В настоящее время широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР) - высокочувствительный и наиболее эффективный метод, который можно применять для прижизненного обнаружения вирусной РНК. Кроме традиционно применяемой полимеразной цепной реакции разработан новый вариант - ОТ-ПЦР-ИФА, представляющий выявление ПНР-продуктов ДОТ-гибридизацией с использованием двух специфических зондов, меченых биотинов [36, 72, 149, 150].
Попытки создания классификации очагов бешенства предпринимались неоднократно [20, 37]. Более приемлемой представляется классификация очагов бешенства, общепринятая в нашей стране как классификация очагов зоонозных инфекций [111]: 1. Природные очаги, в которых самостоятельная циркуляция вируса осуществляется в популяциях диких плотоядных животных, кровососущих и насекомоядных летучих мышей. 2. Антропургические очаги, в которых самостоятельная циркуляция вируса осуществляется в популяциях одомашненных животных (кошки - собаки) в искусственно созданной человеком экологической среде («городское» или «урбанистическое» бешенство). 3. Природно-антропургические (переходные, смешанные) очаги - обмен ВБ происходит между популяциями диких и одомашненных животных.
Очаги всех типов встречаются во всех неблагополучных по бешенству территориях с той разницей, что на одних территориях преобладают антропургические очаги (Азия, Африка, Южная Америка), а на других - природные (Центральная Европа) [111]. Активная циркуляция ВБ приурочена к открытым ландшафтам тундры, степи, лесостепи. Установлено что в 62,5 - 72,1% особенности ландшафта и характер землепользования определяют распределение и плотность популяций основных источников бешенства в России. Препятствуют распространению бешенства диких животных географические барьеры -гребни гор, густые леса [95, 140, 144].
Эпизоотология бешенства в Липецкой области
Анализ оказания антирабической помощи населению, пострадавшему от животных в 2001 - 2010 гг., проводился с учетом лиц: обратившихся из очагов лабораторно подтвержденного бешенства - 2071 человек; получивших полный курс лечебно-профилактической иммунизации -31974, получившие комбинированный курс - 1421, самовольно прекративших вакцинацию - 1530, отказавшихся от прививок - 832. Проведенный анализ 7278 карт обратившихся за антирабической помощью (Ф.№045у) позволил установить локализацию повреждений, нанесенных животными и своевременность обращения пострадавших за антирабической помощью. По локализации повреждений группы разделились следующим образом: повреждения нижних конечностей - 2604 человек; укусы опасной локализации - 2066 (кисть - 1800; голова - 214; паховая область - 20; шея - 19; пальцы ног - 13); верхних конечностей - 1509; контактов с животными - 641; множественных укусов - 223; спины - 138; передней брюшной стенки - 49; грудной клетки - 45. По обращаемости - в день получения укуса -4338 человек; на следующий день - 1797; на второй день - 572; на третий - 294; на четвертый - 118; на 5 и более - 159.
Профилактическая вакцинация по эпидемическим показаниям групп профессионального риска - 3394 человек, ревакцинация -3528 человек.
При проведении ретроспективного эпидемиологического анализа использовались отчетные формы: №2 Госкомстата России «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях», №5 «Сведения о профилактической вакцинации». Сведения о численности населения взяты из статистического бюллетеня территориального органа ФС государственной статистики по Липецкой области «Числен 42 ность населения Липецкой области по полу и отдельным возрастным группам» в 2001 - 2010 гг. Анализ заболеваемости бешенством проводился по годовым отчетам и пояснительным запискам отдела особо опасных инфекций санитарно-эпидемиологической стации Липецкой области.
Третьим направлением работы было изучение биологических свойств лис-савирусов, циркулирующих на территории Липецкой области.
Для изучения некоторых биологических свойств и молекулярно-генетического разнообразия ВБ, циркулирующих на территории Липецкой области, при исследовании биологического материала было изолировано 14 штаммов (4 в 2011 г. и 10 в 2012 г.) Источниками послужили 8 лисиц, 3 кошки и З КРС из 7 районов: Лев-Толстовского, Грязинского, Данковского, Елецкого, Чаплыгинского, Тербунского, Усманского. Изоляты были названы Rus(Lipetsk)8052f; Rus(Lipetsk)8053c; Rus(Lipetsk)8054f; Rus(Lipetsk)8057f; Rus(Lipetsk)8061cow; Rus(Lipetsk)8064f; Rus(Lipetsk)8067cow; Rus(Lipetsk)8069f; Rus(Lipetsk)8072cow; Rus(Lipetsk)8075c; Rus(Lipetsk)8080f; Rus(Lipetsk)8083f; Rus(Lipetsk)8089c.
Для постановки биопробы и приготовления отрицательных контрольных образцов использовались лабораторные животные - беспородные белые мыши массой 8-12 г (3-х недельные). Применялись: питательная среда на растворе Хенкса; фосфатный, карбонат ный и цитратный буферные растворы; флуоресцирующий антирабический глобу лин поликлональный, производства Федерального государственного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической без опасности» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), г. Казань, серия №1 от 03.2012г., монокло нальный (FITC-Anti-RabiesMonoclonalGlobium) производства
CENTOCORFujirubioDiagnostics, Inc., Malvern, PA, USA; набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА, производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань, серия №2, от 05.2012 г.; экспериментальная ИФА тест-система, разработанная ФБУН «Омский НИИ природноочаговых инфекций» Роспотребнадзора, содержащая поликлональный пероксидазный конъ-югат, приготовленный на основе очищенного антирабического IgG из сыворотки овцы, иммунизированной штаммом ГНКИ фиксированного вируса бешенства (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань).
В ходе работы использовали: ламинарно-потоковый шкаф III класса биологической безопасности Biowizard BW3 (БББ); микроскоп СХ41 тринокулярный люминесцентный (Olympus, Japan) с цифровой цветной 12-мегапиксельной CCD-камерой DP72 (Olympus, Japan) и ПК; инкубатор лабораторный общего назначения Shellab 55 л, (SheldonManufacturing, USA); центрифуга лабораторная клиническая ОПн-3; анализатор иммунологический MultiscanFC (ThermoFisherScientific, USA) с принтером, планшет-отмыватель Wellwash 4 МК-2, (ThermoFisherScientific, USA), низкотемпературный морозильник (-86С) вертикальный (240 л) UF240-86E (SnijdersScientific B.V., Netherlands).
Поступивший на исследование секционный материал (головной мозг животных) предварительно тестировали на наличие антигена вируса бешенства экспресс-методами (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный анализ). Прямой метод флюоресцирующих антител использовали для выявления специфических флюоресцирующих включений в отпечатках головного мозга жи вотных, а также в препаратах, сделанных с головного мозга белых мышей, по гибших или забитых на высоте клинических проявлений в ходе биопробы этого материала. Реакцию ставили по общепринятой методике [160] с использованием поликлонального (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань, серия №1 от 03.2012 г.) и моноклонального (CENTOCORFITC-Anti-RabiesMonoclonalGlobulin, FujirubioDiagnostics, Inc., Malvern, PA, USA) флюоресцеин-меченного антираби-ческого глобулина. Отпечатки головного мозга животных (или белых мышей, полученных в ходе биопробы), фиксированные охлаждённым ацетоном, экспонировали с поликлональным ФИТЦ-иммуноглобулином (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань) в течение 40 мин. при 37С, промывали, сушили и просматривали под люминесцентным микроскопом Olympus СХ41 (окулярх 10,объектив 100, система документирования DP 72) с использованием масляной иммерсии.
В качестве «+» контроля использовали отпечатки головного мозга мышей, заражённых фиксированным штаммом вируса бешенства С VS. В качестве «-» контроля использовали отпечатки головного мозга здоровых белых мышей, не подвергавшихся инокуляции. Иммуноферментный анализ использовался для тестирования как полевого, так и пассажного материала. При этом применяли набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуно ферментного анализа, производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань, серия №2, от 05.2012 г. Набор предназначен для обнаружения антигена вируса бешенства в суспензии исследуемых образцов в результате его специфического взаимодействия с антителом (ан-тирабическим иммуноглобулином G), иммобилизованном на твёрдом носителе. Обнаружение комплекса антиген-антитело производили с помощью антивирусного пероксидазного конъюгата (второе меченное ферментом антитело) в цветной реакции фермент-субстрат.
Иммуноферментный анализ проводили сендвич-методом. В качестве исследуемого материала (антигена) использовали пробу ткани свежезамороженного головного мозга (10% суспензия головного мозга). Учёт результатов анализа проводили визуально по разнице в интенсивности окраски продукта реакции опыта и контроля, а также на спектрофотометре АКИ-Ц-01 (г. Москва, ООО «Медтехни-ка») при длине волны 492 нм. Уровень меченых антител в реакции прямо пропорционален количеству антигена. Для исследуемых образцов рассчитывали коэффициент специфичности (отношение оптической плотности в испытуемой лунке (ОПі) к оптической плотности в лунке с контрольным отрицательным антигеном (ОПг). Положительными пробами считали пробы, оптическая плотность которых в 2,1 раза превышала отрицательный контроль (К-).
Все вирусы были выделены на белых мышах [161], идентифицированы с помощью прямого метода флюоресцирующих антител [160] и иммуноферментного анализа [138].
Вирусологическая характеристика штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Липецкой области
В области обитают 66 видов млекопитающих, более 260 видов птиц. В настоящее время наиболее распространенными являются животные, относящиеся к семействам парнокопытных (лось, олень, косуля, кабан), собачьих (лисы, енотовидные собаки, волки), куньи (горностаи, куницы, белки), грызуны (мышевидные, выдры), бобры, барсуки, хорьки [83, 114].
Отряд хищных представлен волком (около 20 особей на территорию области), лисицей, енотовидной собакой, лесной куницей, горностаем, лесным хорьком, выдрой, барсуком. В связи с тем, что вышеперечисленные животные, за исключением лисицы красной, представлены небольшими популяциями и не представляют эпизоотической опасности, учет их численности на территории области не проводится [83, 114].
Красная лисица (хищник из семейства Canidae) является наиболее многочисленным видом. Ее численность за анализируемый период колебалась от 4200 до 7687 особей, плотность популяции от 2,03 в 2006г. до 3,7 в 2009 г. на 1000 га охотничьих угодий (Приложение 1). Данный показатель значительно превышает показатель эпизоотологического благополучия на территории РФ - 1 особь на 1000га охотничьих угодий, регламентированный Приказом Министерства природных ресурсов и экологии РФ №138 от 30.04.10г. «Об утверждении нормативов допустимого изъятия охотничьих ресурсов и нормативов численности охотничьих ресурсов в охотничьих угодьях» [75].
Эпизоотологической особенностью бешенства лисиц на территории области является отсутствие значительных колебаний численности животных, плотность (число особей на 1000 га охотничьих угодий) постоянно превышала эпизоотоло-гически безопасный уровень в 2,0 - 3,7 раз. Быстрому восстановлению плотности популяции после эпизоотии и искусственной депопуляции способствует наличие достаточной кормовой базы, территорий для заселения, приток особей с сопредельных территорий, что поддерживает постоянную высокую активность природного очага (рис. 2.).
Для определения распространенности лисиц на территории области был просчитан показатель - плотность популяции на 1000 кв. км площади района в разрезе административных территорий. Проведенное ранжирование показателя позволило выделить три группы административных территорий: - 3 территории с очень высоким показателем (более 299,3): Воловский, Усманский, Хлевенский районы; - 11 территорий с высоким показателем(146,1-299,3): Грязинский, Добров-ский, Долгоруковский, Елецкий, Задонский, Измалковский, Краснинский, Лебедянский, Лев-Толстовский, Становлянский, Чаплыгинский районы; - 4 территории с умеренным показателем (менее 146,1): Данковский, До-бринский, Липецкий, Тербунский районы (рис. 3 приложения 1., таб. 1 приложения 2).
На территории области основное поголовье лисиц обитает в лесисто-овражистой местности. Наличие больших пойменных массивов, заросших кустарником и камышом, с постоянным обитанием в них мелких млекопитающих, создают благоприятные условия для их обитания и размножения. Небольшие лесные урочища, расположенные вблизи населенных пунктов, овраги и балки также благоприятны для обитания лисиц. На большей части территории Липецкой области (70% площади, на 10 административных территориях) выявлена сильная отрицательная связь (г= -0,75) между плотностью лисиц и распаханностью земельных угодий.
В области наблюдается обилие мышевидных грызунов (суслики, мыши, полевки, хомяки, бобры, белки, ондатры и др.), с целью мониторинга организован систематический зоолого-микробиологический мониторинг. Вопрос эпизоотоло-гического значения грызунов изучен в 1985г. [42], исследован материал от 235 полевых мышей, 39 серых крыс и 4 хомяков, вирус бешенства был выделен в одном случае (0,36% от серой крысы). Известно, что плотность популяций и миграционная активность лисиц зависят от обилия их основного корма - мышевидных грызунов. В годы высокой численности грызунов численность диких плотоядных, питающихся ими, нарастает. Данная закономерность на территории области не установлена, связь между численностью грызунов и лисиц отсутствует (коэффициент корреляции г= -0,46), что объясняется активным регулированием численности лис (отстрел) и систематически проводимой сплошной дератизацией.
В населенных пунктах обитает большое количество домашних и бездомных собак и кошек. Примерная численность владельческих животных оценивалась по данным вакцинации животных; проведенные расчеты показали, что действительное количество их на 30% больше. В городах регистрация домашних животных проводится при обращении в ветеринарную службу, в сельской местности ежегодно при плановой вакцинации путем подворных обходов, т.е. количество зарегистрированных животных примерно соответствует количеству вакцинированных.
Для проведения сравнительного анализа уровня организации регистрации и охвата вакцинацией домашних животных на территориях введен показатель их численности из расчета на 1000 жителей.
Проведенное ранжирование среднемноголетнего показателя учета владельческих собак позволило выделить три группы административных территорий: - 4 территории с высоким показателем (более 107,9) - Воловский, Долгоруковский, Тербунский, Хлевенский районы; - 10 территорий со средним (51,8 - 107,9): Данковский, Добринский, Доб-ровский, Задонский, Измалковский, Краснинский, Лебедянский, Лев-Толстовский, Липецкий, Становлянский районы; - 4 территории с низким (менее 51,8): Грязинский, Елецкий, Усманский, Ча-плыгинский районы (рис.5.приложения 1, таб. 1 приложения 2).
Оценка организации регистрации и вакцинации владельческих собак в городах области не проведена, ранжирование провести не представилось возможным, т.к. на территории области располагаются только два крупных города (более 100 тыс. населения). Несмотря на то, что показатели вакцинации из расчета на 1 тыс. городских жителей были значительно ниже (в 3 - 5 раз) средних областных, тенденция к росту (3,4 раза) была более выражена, чем для сельских территорий (1,9 раза) с 5,3 в 2001 г. до 18,0 в 2010 г. (рис. 6.). 91,8 88,7 8S
Единственной возможностью оценить численность бездомных животных явились данные по количеству отловленных животных специализированными предприятиями. Однако действительная численность данной популяции значительно больше, чем число отловленных животных, о чем свидетельствует рост обращаемости населения за анализируемый период по поводу покусов бродячими животными (рис. 63. из главы 4).
Формированию относительно устойчивых групп бездомных животных способствуют определенные категории людей, которые их обеспечивают пищей, помогают укрыться от непогоды и оберегают в период выращивания молодняка. Также пополнение популяции происходит за счет потерявшихся особей или ставших ненужными хозяевам. Бродячие собаки на территории области обычно живут группами (от 2до 10 особей), которые формируются у рынков, торговых палаток, железнодорожных станций, на территориях гаражных кооперативов, крупных предприятий, либо на периферии населенных пунктов. Максимум бездомных собак - 13121 особей зарегистрирован в 2008 г., минимум - 8702 в 2006 г. Для проведения сравнительного анализа мероприятий по регулированию численности безнадзорных животных на территориях автором введен показатель количества отловленных животных из расчета на 1 кв. км площади населенных пунктов (таб.
1 приложения 2).
Областной показатель численности бездомных собак на 1 кв. км населенных пунктов в течение года колебался от 3,8 в 2006 г. до 5,7 в 2008 г., однако, тенденция к снижению отсутствовала (среднегодовой темп снижения - 0,4%; рис. 7., таб. 1 приложения 2), что полностью согласуется с динамикой обращаемости населения по поводу покусов бродячими собаками.
Распределение обращаемости за антирабической помощью по административным территориям Липецкой области в 2001-2010 гг
Для оптимизации эпидемиологического надзора за природными очагами бешенства в Липецкой области совместно со специалистами ФБУН «Омский НИИ природноочаговых инфекций» Роспотребнадзора (г. Омск), Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск), ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва), которым автор выражает глубокую благодарность, с 2011 по 2012 гг. проводилось изучение вирусологических и молекулярно-эпидемиологических аспектов циркуляции лисса-вирусов на территории Липецкой области.
Во всех 14 образцах (8 от лисиц, по 3 от кошек и КРС) методом флюоресцирующих антител было обнаружено специфическое свечение. Препараты демонстрировали наличие практически в каждом поле зрения специфические включения, имеющие характерные форму и свечение в реакции с поликлональными и моноклональными флюоресцеин-меченными антирабическими глобулинами.
Включения во всех препаратах были многочисленными, имели мелкую, либо довольно крупную округлую или овальную форму. На уровне первого и последующих пассажей, в результате накопления вирусного материала, в препаратах дополнительно наблюдали крупные включения в виде запятых, тяжей, нитей, пятен. Интенсивность специфического свечения как в отпечатках с первичного материала, так и в отпечатках с материалов биопробы, была оценена на 4 креста (чётко видимое, жёлто-зелёное свечение).
При тестировании образцов материала в ИФА визуально наблюдали интенсивное специфическое окрашивание в лунках со всеми тестируемыми образцами, аналогичное таковому в лунках с положительным антигеном (К+) (фотої).
Результаты тестирования первичного материала от животных в ИФА. Примечание: номера штаммов с 8052 по 8057- верхние плашки; номера штаммов с 8061 по 8091- нижние плашки.
Лунки К- оставались бесцветными. Рассчитанный коэффициент специфичности для исследуемых проб составил- 10-15.
Параллельно материал исследован в экспериментальной тест-системе ФБУН «Омский НИИ природноочаговых инфекций» Роспотребнадзора, с использованием поликлонального пероксидазного конъюгата, приготовленного на основе очищенного антирабического IgG из сыворотки овцы, иммунизированной штаммом ГНКИ фиксированного вируса бешенства (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ, Казань). В качестве положительного контроля (К+) использовали суспензию лабораторного штамма CVS фиксированного вируса, в качестве отрицательного контроля (К-) использовали 10% суспензию головного мозга здоровой мыши и 0,1 М ФСБ.
Полученные результаты реакций при визуальном и инструментальном учётах, аналогичны результатам, полученным с использованием коммерческой тест-системы производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань.
Инфекционную активность вирусов определяли методом титрования на белых мышах при интрацеребральной инокуляции на уровне второго пассажа и выражали в мышиных летальных дозах - 1Т)5о/1,Омл. Для этой цели из основной суспензии вируса (10%) готовили ряд 10-кратных разведений до 10 7. Титр инфекционной активности вирусов рассчитывали по Риду и Менчу.
Инфекционная активность вирусов (титр вируса) на уровне 2-го пассажа при интрацеребральном заражении для штаммов, собранных на территории Липецкой области, составляла 5,0-7,2 IgLDso/1,0мл. В среднем для исследуемой группы вирусов их инфекционная активность при интрацеребральном заражении на уровне 2 пассажа установлена равной 6,0 lgLDso/1,0 мл.
При интрацеребральном заражении мышей суспензиями, прогретыми при 50С в течение 15 мин. наблюдали снижение инфекционной активности вируссо-держащей суспензии, а титр вируса составил 3,1-4,7 lgLD5o/l,ONm. Несмотря на это, использованные в опыте дозы вируса, содержащиеся в 10%-й суспензии и введённые подопытным животным, оказались достаточными для определения их 100% гибели.
При подкожном заражении наблюдали снижение инфекционной активности штаммов в 2 раза, их титр составлял 2,2-4,0 lgLDso/1,0 мл. Титр вируса, равный 4,0 lgLD5o/l,ONm был установлен только для одного штамма - Rus(Lipetsk) 8061cow_2012. У остальных штаммов титры вирусов составляли от 2,2 до 3,8 lgLD5o/l,ONm, а в среднем для исследуемой группы вирусов их инфекционная активность при подкожном заражении на уровне 2 пассажа установлена равной 3,0 lgLD5o/l,ONm, т.е. в 2 раза ниже, чем при интрацеребральном заражении. Получен 81 ные данные свидетельствуют о снижении патогенности штаммов при периферическом заражении. Однако данный факт нуждается в исследовании на уровне более высоких пассажей, что также позволит более детально охарактеризовать индивидуальные особенности штаммов.
Патогенность изучали на уровне 2-го пассажа вирусов и оценивали по их вирулентности для беспородных белых мышей.
Вирусологическое исследование материала проводили на 3-х недельных беспородных белых мышах, массой 8-12 гр., путём интрацеребральной инокуляции 0,03мл 10% вируссодержащей суспензии головного мозга, приготовленной на растворе Хенкса и её подкожной инокуляции в объёме 0,1 мл. Срок наблюдения предполагалось установить до 30-60 дней.
При интрацеребральном введении 10%-х суспензий первичного материала (суспензии головного мозга, полученные от животных, подозрительных на инфицирование бешенством) наблюдали 100% гибель мышей, при инокуляции животных всеми 14-ю образцами. При этом мыши заболевали на 7-18 дни, чаще на 10-11 дни. Инкубационный период, средний для всех штаммов, составил 11,1 дня. Аналогичный инкубационный период наблюдали при реизоляции. Болезнь сопровождалась выраженными параличами, нарушением координации движений, снижением активности. Гибель животных наступала в течение 24-48 часов. При этом инфекционная активность первичного материала составляла 4-5 1Ь05о/1,Омл, животным было введено 103 9-104 3МЬ05о/1,Омл.
Головной мозг белых мышей, погибших или забитых на высоте клинических признаков заболевания в ходе биологической пробы, исследовали прямым методом МФА, суспензии повторно исследовали в ИФА и другими методами, материал пассировали на беспородных белых мышах.
Дальнейшее изучение вирулентности проводили на уровне 2 пассажа штаммов, изолированных в ходе первого заражения.
Группам из 5-10 мышей вводили интрацеребрально и подкожно 10%-ю ви-руссодержащую суспензию активностью 5-7 1Ь05о/1,Омл и 2-4 1Ь05о/1,Омлсоответственно. Мыши сохраняли 100% чувствительность к интраце 82 ребральному заражению всеми исследуемыми штаммами, собранными на территории Липецкой области. При этом в ходе интрацеребрального заражения число MicLDso использованных в опытах составляло от 10,5 тыс. до 1,5 млн. MicLDso в 1 мл.
Четыре исследованных штамма также вызывали 100% гибель мышей после прогрева суспензий на водяной бане при +50С, 15 мин.
Число MicLDso в 1 мл взятых в опыт при использовании прогретых суспензий, составило 133-5266. Этот факт указывает на возможность некоторой термостабильности штаммов. При этом установлено снижение инфекционной активности вирусной суспензии. Полученные данные нуждаются в проведении дополнительных исследований, с изменением температуры и времени инкубации суспензии, а также требуют проведения повторов опытов.
При подкожном заражении выявлена определённая разница в патогенности между вирусами. Ряд штаммов при подкожной инокуляции вызывали гибель 40-80% животных. При этом в ходе подкожного заражения число MicLDso использованных в опытах составляло от 16 до 630MicLD5o в 1 мл, вирусная активность установлена равной 2,2-4,0 lgLDso/1,0 мл. Полученные результаты могут быть связаны с относительно низкой периферической активностью некоторых штаммов. Однако в ходе проведения исследований имело место длительное хранение вирусного материала при - 20С (около 1,5 месяцев), с последующим хранением на - 70С. Это могло неблагоприятным образом сказаться на инфекционной активности штаммов, следовательно, и на их вирулентности. Исследование периферической активности исследуемых штаммов необходимо продолжить на уровне более высоких их пассажей, при стабилизации инкубационного периода.