Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 12
1.1. Экология орбивирусов и их значение в инфекционной патологии человека 12
1.2. Молекулярно-генетическая характеристика рода Orbivirus 15
1.3. Отношение вируса Кемерово к группе вируса Грэйт-Айленд (GIV) 17
1.4. Общие сведения о вирусе Кемерово 22
1.5. Эпидемиология лихорадки Кемерово
1.6. Методические подходы, используемые при расшифровке геномов реовирусов de novo 26
1.7. Метод ПЦР в реальном времени как «золотой стандарт» молекулярной диагностики инфекционных заболеваний 26
1.8. Заключение 29
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Общая характеристика организации, материалов и методов исследования 2.2. Расшифровка полного генома вируса Кемерово 35
2.3. Разработка методики выявления РНК вируса Кемерово на основе ОТ-ПЦР в реальном времени 35
2.4. Молекулярно-генетическая оценка взаимоотношений вируса Кемерово с другими вирусами группы Грейт-Айленд 40
2.5. Изучение циркуляции вируса Кемерово на территории Российской Федерации 46
2.5.1. Определение видовой принадлежности клещей 46
2.5.2. Исследование зараженности иксодовых клещей вирусом Кемерово 48
2.5.3. Получение протяженного фрагмента первичной нуклеотидной последовательности вируса Кемерово з
2.5.4. Оценка наличия сероконверсии у лиц с лихорадочными состояниями, возникшими после присасывания клеща 49
Глава 3. Особенности ситуации по инфекциям, передаваемым клещами на территории Российской Федерации 52
3.1. Заболеваемость населения ИПК и ее структура на отдельных территориях Российской Федерации 52
3.2. Диагностика ИПК как основа эпидемиологического надзора 63
3.2.1. Мониторинг численности, видовой структуры и зараженности переносчиков 63
3.2.2. Диагностика ИПК среди населения 67
Глава 4. Разработка методики выявления РНК вируса Кемерово методом ОТ-ПЦР в реальном времени на основе расшифровки генома штамма21/10 69
4.1.Результаты расшифровки полного генома вируса Кемерово 69
4.2. Характеристика методики выявления РНК вируса Кемерово на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени 71
4.3.Аналитические свойства диагностической системы 72
Глава 5. Молекулярно-генетическая оценка взаимоотношений вируса Кемерово с другими вирусами группы Грейт-Айленд 76
5.1. Сравнительное описание основных характеристик генома вируса Кемерово, штамм 21/10 76
5.2. Результаты филогенетического анализа 82
Глава 6. Изучение циркуляции вируса Кемерово на территории Российской Федерации 86
6.1. Результаты исследования зараженности иксодовых клещей 86
6.2. Валидизация полученных результатов 91
6.3.Оценка наличия сероконверсии у лиц с лихорадочными состояниями, возникшими после присасывания клеща 95
Заключение 98
Выводы 101
Практические рекомендации 101
Список сокращений 103
Список литературы
- Эпидемиология лихорадки Кемерово
- Разработка методики выявления РНК вируса Кемерово на основе ОТ-ПЦР в реальном времени
- Диагностика ИПК как основа эпидемиологического надзора
- Характеристика методики выявления РНК вируса Кемерово на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени
Эпидемиология лихорадки Кемерово
Таксономически род Orbivirus принадлежит к семейству Reoviridae, включающему в себя следующие рода: Cardoreovirus, Mimoreovirus, Orbivirus, Phytoreovirus, Rotavirus, Seadornavirus. В настоящее время описано около 160 представителей рода Orbivirus являющихся патогенами беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе и человека [56]. Прототипным представителем орбивирусов считается вирус Синего языка овец (Bluetongue virus, BTV). Представители рода Orbivirus встречаются на всех континентах [12,37]. Переносчиками орбивирусов служат кровососущие насекомые (мокрецы, москиты, комары) и клещи. Наиболее значимыми с точки зрения экономических потерь для сельского хозяйства являются вирусы Синего языка овец (BTV), Африканской болезни лошадей (AHSV) и Эпизоотической геморрагической болезни (EHDV) [56]. Некоторые передающиеся клещами орбивирусы, такие как Чангвинола (Changuinola), Коррипарта (Corriparta), Лебомбо (Lebombo), Орунго (Orungo) и вирусы серогруппы Грейт-Айленд (Great Island, GIV) способны инфицировать человека, вызывая у него лихорадочные состояния различной степени тяжести [32].
Традиционно интерес к изучению орбивирусов был не слишком велик вследствие их невысокой значимости как патогенов (исключая BTV, AHSV и EHDV). Однако в последние пять лет с развитием молекулярных методов интерес к изучению орбивирусов постепенно растет, что приводит к появлению работ, посвященных генетической характеристике как вновь открытых, так и открытых ранее, но не охарактеризованных орбивирусов [30,31,43,44,54]. В основу типирования орбивирусов положена общность антигенных свойств различных представителей рода, образующих 22 различных серокомплекса. Выделяют серокомплексы групп вирусов Африканской болезни лошадей (9 серотипов), Синего языка овец (26 серотипов), Чангвинола (12 серотипов), Ченуда (7 серотипов), Хобар-Горг (2 серотипа), Коррипарта (6 серотипов), Эпизоотической геморрагической болезни (10 серотипов), Энцефаллоза лошадей (7 серотипов), Эубенанджи (4 серотипа), Иери (3 серотипа), Грейт-Айленд (36 серотипов), Лебомбо (1 серотип), Пируанской болезни лошадей (1 серотип), Вонгорр (8 серотипов), Сент-Круа Ривер (1 серотип), Уматилла (4 серотипа), Вад-Медани (2 серотипа), валлал (3 серотипа), Варрего (3 серотипа), Орунго (4 серотипа), Палиам (13 серотипов), а также ряд видов, групповая принадлежность которых еще не определена окончательно [11].
На рис.2 представлено филогенетическое дерево рода Orbivirus, построенное на основании выравнивания 123 фрагментов первичных нуклеотидных последовательностей гена полимеразы (VP1) различных орбивирусов [71]. В качестве статистической модели использована модель Кимуры. Построение филогенетического дерева проведено методом присоединения соседей [76]. Статистическая достоверность топологии дерева подтверждена 1000 бутстреп - повторов. Для построения использована программа MEGA 4.0. Красным цветом обозначены неохарактеризованные вирусы, голубым – референсные штаммы, зеленым – вирусы, первичные нуклеотидные последовательности которых депонированы в международной базе NCBI (National Center for Biotechnology Information). 15
Геном орбивирусов составляет около 20000 пар оснований и представлен 10 сегментами двухнитевой РНК, упакованной в двухслойный белковый кэпсид. Протяженность сегментов варьирует от 4000 до 600 пар оснований. Сегменты генома содержат гены, кодирующие 7 структурных белков (VP1 - VP7) и 4 неструктурных белка (NS1, NS2, NS3, NS3a) [56]. В большинстве случаев каждый сегмент генома кодирует лишь один белок, имея одну открытую рамку считывания. Исключение составляют сегменты 9 и 10, каждый из которых кодирует по 2 близко родственных белка (VP6 и VP6a (NS4) в сегменте 9 и NS3, NS3a в сегменте 10, соответственно) [32].
Икосаэдрическая коровая часть вириона состоит из двух концентрических белковых капсул - субкорового слоя, состоящего из белка VP3 (T2), и поверхностного слоя, состоящего из белка VP7 (T13). Белки VP1, VP4 и VP6 являются ферментами (рис.3). Рис.3. Строение вирусной частицы орбивирусов (по данным [50])
Внешний слой вирусной частицы представлен белками VP2 и VP5, обеспечивающими прикрепление и проникновение вируса в клетку хозяина. Эти белки более вариабильны чем коровые и большинство неструктурных белков, поэтому специфичность их реакции с нейтрализующими антителами лежит в основе серотипирования орбивирусов [32,51]. Белок NS1 представляет собой тубуллярный белок, участвующий в транслокации провирусных частиц к клеточной мембране [52, 70]. Белок NS2, будучи фосфорилированным клеточными киназами, превращается в матриксный белок вирусных гранулярных телец включения (VIB). Неструктурные белки NS3 и NS3a представляют собой гликопротеины, которые в больших количествах экспрессируются в клетках насекомых, и отсутствуют в клетках млекопитающих. Эти белки участвуют в сборке дочерних вирусных частиц [51]. У некоторых орбивирусов белки NS3 и NS3a чрезвычайно вариабельны. Существует предположение о том, что эти белки играют детерминирующую роль в процессе адаптации вируса к переносчику [69]. Описание функций белков и их локализация представлены в Таблице 1
Вирус Кемерово (KEMV) выделен в 1962 г. от больных людей и из клещей вида I. persulcatus. [42]. Вскоре в Чехословакии из клещей вида Ixodes ricinus были выделены вирусы Липовник (LIPV) и Трибеч (TRBV), по биологическим и антигенным свойствам оказавшиеся близкими к вирусу Кемерово [61, 50, 62]. Антигенное родство этих видов послужило основанием для объединения их в новую классификационную группу под названием серогруппа Кемерово [37].
В последующие годы на разных континентах из различных природных источников, главным образом из клещей, были выделены вирусы, антигенно родственные вирусу Кемерово. Основные сведения о месте и источнике выделения представлены в таблице, составленной по данным И. С.Михайловой [12]:
Разработка методики выявления РНК вируса Кемерово на основе ОТ-ПЦР в реальном времени
Исследование зараженности иксодовых клещей вирусом Кемерово проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с помощью разработанного набора для детекции РНК вируса Кемерово KEMV-FL (ФБУН ЦНИИЭ) по стандартному протоколу. Для исследования в реакцию брали по 10 мкл ДНК/РНК из индивидуальных образцов клещей. Реакцию проводили с помощью приборов для ПЦР в реальном времени Rotor Gene Q и Rotor Gene 3000 (Qiagen). Статистическую обработку полученных результатов и их графическое отображение осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Office 2007. Расчет средней ошибки проводили по формуле: _ N-1 где Sp - средняя ошибка относительной величины (средняя ошибка определения зараженности клещей), р - относительная величина (зараженность клещей), N - количество наблюдений (исследованных образцов) [46].
Получение протяженного фрагмента первичной нуклеотидной последовательности вируса Кемерово Для получения протяженных фрагментов генома вируса Кемерово использовали положительные образцы, собранные в Алтайском крае. Для этого предварительно обогащали и неспецифически амплифицировали исходный материал (приложение 5). Амплификацию протяженного фрагмента проводили при помощи двух пар специфических праймеров VP1-f1/VP1-r1 и VP1-f2/VP1-r2, с помощью которых получили два ампликона, нуклеотидные последовательности которых перекрываясь, позволили собрать фрагмент первичной нуклеотидной последовательности гена полимеразы VP1 вируса Кемерово. Данный фрагмент, также содержит область, комплементарную праймерам и зонду, использованным в диагностическом наборе для проведения ПЦР в реальном времени.
В качестве праймеров для амплификации использовали пары VP1-f1/VP1-1r и VP1-f2/VP1-r2, структура которых и расположение относительно референсного генома вируса Кемерово (GenBank NCBI, KС288130) представлены в приложении 2.
Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала по 10 мкл прямого и обратного праймеров, 2,5 мкл дНТФ 1,76 мМ (AmpliSens) под воском, 10 мкл ПЦР-смеси blue-2 (AmpliSens), 2 мкл продукта неспецифической амплификации и Н2О milliQ (AmpliSens) до конечного объема. Амплификацию проводили на приборе Терцик (ДНК-Технологии) в режиме: 95С – 2мин; 95 С – 20сек, 60 С - 20сек, 72 С – 20сек; 72 С – 60сек, n=40.
Полученные ПЦР-продукты анализировали электрофоретическим методом в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и секвенировали с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI-Prism 3500 XL (Applied Biosystems). Хроматограммы анализировали с помощью пакета программ Lasergene 7.0 (DNASTAR Inc), построение филодендрограммы проводили с помощью программы Mega 6.0 методом присоединения соседа и количеством бутстреп-повторов, равным 1000.
Оценка наличия сероконверсии у лиц с лихорадочными состояниями, возникшими после присасывания клеща Оценку наличия сероконверсии у лиц с лихорадочными состояниями, возникшими после присасывания клеща, проводили на территории Алтайского края. Выбор региона был обусловлен следующими факторами:
Алтайский край расположен в Юго-Восточной части Западно-Сибирской равнины. Территория края характеризуется наличием различных ландшафтных участков, включающих степи, лесостепи со смешанными лесами, тайгу и участки гористой местности [15]. Данное обстоятельство обуславливает большое видовое разнообразие иксодовых клещей (более 17 видов), а также их высокую численность вследствие большого многообразия теплокровных животных и птиц, являющихся прокормителями клещей в природе [6, 8].
Площадь Алтайского края составляет 168000 км2, население по данным 2015г составило 2384 тыс. человек. Обращаемость населения по поводу присасывания клещей составляет в среднем 420 случаев на 1000 тыс. населения, что в 1,6 раза больше чем в среднем по Российской Федерации. При этом заболеваемость клещевыми инфекциями в Алтайском крае находится на уровне 26 случаев на 100 тыс. населения, что в 3,5 раза выше, чем в среднем по Российской Федерации [5, 6].
Циркуляция вируса Кемерово на территории Алтайского края доказана как собственными исследованиями, так и данными предыдущих исследователей, а также наличием штаммов вируса Кемерово, изолированных в Алтайском крае [4, 45].
Сбор материала проводили на базе ИКБ №5 г. Барнаул в весеннее-осенний период 2013-2014гг. У пациентов с лихорадочным синдромом, сыпью, неврологическими нарушениями, и зафиксированным фактом присасывания клеща отбирали первую порцию крови сразу при поступлении. Вторую порцию крови отбирали при выписке (через 7-14 дней). Отбор крови проводили в пробирки, содержащие ЭДТА. После инкубации 2-3 часа при 37С отбирали плазму и переносили в отдельные 1,5 мкл пробирки. Далее материал замораживали и хранили при -20С для дальнейшего исследования. Всего был собран материал от 162 пациентов. При наличии у пациентов элементов сыпи брали биоптат из элемента сыпи (корочки). Полученный материал помещали в 70% этанол и хранили при -20С.
Все пациенты предоставили информированное согласие на проведение научных исследований.
Собранный материал исследовали молекулярными методами для выявления генетических маркеров следующих инфекционных агентов: риккетсий группы пятнистой лихорадки, вируса клещевого энцефалита, вируса Кемерово, Borrelia burgdorferi, Ehlichia chaffensis, Anaplasma phagocytophilum. Исследования проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью набора реагентов АмплиСенс TBEV, B.burgdorferi sl, A.phagocytophillum, E.chaffeensis/E.muris-FL, набора реагентов для детекции РНК вируса Кемерово, а также праймеров и зонда для детекции возбудителей пятнистых лихорадок [77].
В качестве исследуемого материала использовали плазму и сгусток первой порции крови, взятой при обращении пациента в стационар, а также биоптаты при их наличии. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора для экстракции Рибо-преп (ФБУН ЦНИИЭ) согласно рекомендациям производителя. При выявлении возбудителя и с учетом клинических проявлений у пациентов образцы исключали из рассмотрения. В результате были отобраны 17 пар сывороток от больных, для которых не удалось получить лабораторно подтвержденный диагноз. Эти сыворотки исследовали в реакции нейтрализации с вирусом Кемерово (штамм 21/10). Реакция нейтрализации проведена на базе лаборатории биологии арбовирусов ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» Л.И. Козловской с соблюдением норм безопасности, предусмотренных при работе инфекционными агентами, отнесенными ко 2-й группе патогенности (приложение 6). Достоверность каждого опыта подтверждали проведением отрицательных контрольных реакций между неинфицированной культурой клеток и отрицательной сывороткой, а также инфицированной вирусом культуры клеток и отрицательной сывороткой.
Заболеваемость населения инфекциями, передаваемыми клещами и ее структура на отдельных территориях Российской Федерации
С развитием методов и средств лабораторной диагностики, а также внедрением их практику надзора в Российской Федерации увеличивается не только число расшифрованных случаев инфекций, переносимых клешами, но и количество самих нозологий. Так, статистическое наблюдение за КВЭ в масштабах страны проводится с 1939 г., за ИКБ – с 1992 г. Начиная с 2013 г. список ИПК, регистрируемых на федеральном уровне, с учетом накопленных знаний об эпидемиологии «новых» инфекций расширен и дополнительно включены омская геморрагическая лихорадка (ОГЛ), астраханская пятнистая лихорадка (АПЛ), ГАЧ и МЭЧ. В настоящее время в структуре ИПК, преобладают ИКБ, КВЭ, а также клещевые риккетсиозы, среди которых наибольшей эпидемиологической значимостью обладает СКТ.
Диагностика ИПК как основа эпидемиологического надзора
Для подтверждения отсутствия кросс-контаминации лабораторными штаммами вируса Кемерово и для исключения неспецифических реакций проводили выборочное секвенирование ампликонов положительных ПЦР-проб. Для улучшения качества секвенирования ампликоны предварительно клонировали в вектор pGem (Promega) по стандартному протоколу и секвенировали индивидуальные колонии, содержащие вставку ожидаемого размера (116 пар оснований). Секвенирование осуществляли с помощью автоматического капиллярного секвенатора GA 3100 (Applied Biosystems).
Полученные сиквенсы анализировали с помощью программы BioEdit 7.2.5 (Ibis Biosciences). Результат сравнения полученных сиквенсов и последовательностей референсных и музейных штаммов представлен на рис. 32.
Сравнение таргетных областей референсных сиквенсов HM543481, KC288130 (штамм 21/10) установлена их 97% гомология на нуклеотидном 95 уровне. Выявлены одиночные нуклеотидные вариации (Т/С), (С/Т) и (С/А) в позициях 2890 н.т., 2924 н.т. и 2935 н.т., соответственно. Анализ штаммов вируса Кемерово из коллекции института Полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова показал разброс по идентичности в таргетной области с референсным штаммом HM543481 в диапазоне 97 - 99%, а с референсным штаммом KC288130 (штамм 21/10) в диапазоне 95 - 98%.
Таким образом, идентичность с референсным штаммом HM543481 в среднем на 1 - 2% выше, чем с референсным штаммом KC288130 (штамм 21/10).
В позиции 2890 н.т. штаммы 37, 106, 205, 483, и k10 содержали (C), в то время как штаммы 21/10, 5/1, 61, 101, R10 и L75 с - (T). В позиции 2924 н.т. штаммы 21/10, 5/1, 37, 61, 106, 5/1, 205, 483, R10, k10 и L75 содержали (C), в то время как штамм 101 содержал (T). В позиции 2926 н.т. штаммы 5/1, 483, R10 and L75 содержали (G), в то время как штаммы 21/10, 37, 61, 101, 106, 205 и k10 содержатли (A). Кроме того, штаммы 37, 205 и k10 имели замену A на G в позиции 2866 н. т., а штаммы 5/1 и 61 - замены A на T и A на G в позиции 2887 н. т., соответственно. Штамм 101 имел замену G на A в позиции 2902 н.т. Штамм 21/10 имел замену A на C в позиции 2935 н.т., а штамм 61 - замену A to G в позиции 2941 н.т.
Сравнительный анализ выборочно секвенированных положительных образцов показал их совпадение с референсным сиквенсом HM543481 в 96-99% и с референсным сиквенсом KC288130 (штамм 21/10) в 95-99%.
Все сиквенсы содержали (Т), (С) и (А) в позициях 2890 н.т., 2924 н.т. и 2935 н.т., за исключением образца 26-17, имеющего замену А/С на Т. Кроме того, образцы 24-624-14, 24-16, и 31-10 имеют замену G на A в позиции 2947 н.т., а образец 24-16 имеет замену A на G в позиции 2936 н.т. Образцы 26-12 и 26-13 имеют замены C на T, C на A и T на C в позициях 2897 н.т., 2900 н.т. и 2940 н.т., соответственно.
Первичные нуклеотидные последовательности имели высокую степень идентичности как с сиквенсами референсных штаммов HM543481 и KC288130 (штамм 21/10), так с сиквенсами штаммов из коллекции института Полиомиелита и вирусных энцефалитов (см. таб.4) а также друг с другом. Это обстоятельство позволило однозначно интерпретировать принадлежность полученных сиквенсов к структуре вируса Кемерово. Наличие единичных замен в различных позициях для сиквенсов положительных образцов. Позволило сделать вывод об отсутствии кросс-контаминации материалом лабораторных штаммов вируса Кемерово.
В ходе исследования 134-х клещевых суспензий имаго I. persulcatus, собранных в Заринском районе Алтайского края, в трех образцах было выявлено наличие РНК вируса Кемерово, что составило 2.2±1,3% от общего количества исследованных проб [4]. Принадлежность исследованных клещей к виду I. persulcatus подтверждена на основании фенотипических признаков. Видовая принадлежность клещей, инфицированных вирусом Кемерово, дополнительно подтверждена генетическим методом. В результате обогащения, неспецифической амплификации и последующей амплификации со специфическими праймерами из одного образца получен фрагмент гена полимеразы вируса Кемерово длиной 805 пар оснований, названный Brn-101-13. Первичная нуклеотидная последовательность фрагмента гена полимеразы изолята Brn-101-13 на 96% идентична аналогичному фрагменту референсного сиквенса штамма 21/10 (KС288130), изолированного в 1968 г. в Кемеровской области из клеща I. persulcatus.
Филогенетический анализ проведен с использованием статистической модели замен Джукса-Кантора. Дерево построено с использованием алгоритма NJ. Статистическая достоверность топологии установлена за счет 1000 бутстрэп-повторов По данным филогенетического анализа полученная последовательность Brn-101-13 находится в одной кладе как с последовательностью референсного штамма вируса Кемерово, так и с последовательностями близкородственных вирусов Трибеч и Липовник (см. рис. 33).
Таким образом, в результате нашего исследования была оценена зараженность вирусом Кемерово иксодовых клещей из 12 регионов, расположенных в пяти федеральных округах Российской Федерации. Зараженность вирусом варьировала от 0.2% до 10.1%. Отсутствие положительных образцов среди клещей, собранных на территориях Республики Тыва и Ярославской области, вероятно, является результатом малой выборки, либо неспособностью вируса Кемерово инфицировать клещей вида D. nuttalli. Косвенным подтверждением этого предположения служит наличие инфицированных клещей в соседних Московской, Костромской и Вологодской областях.
Характеристика методики выявления РНК вируса Кемерово на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени
Клонирование ампликона проводили с использованием рестриктазы XcmI, которая в данном векторе вырезает небольшой фрагмент, в результате чего на обоих его концах образуются выступающие нуклеотидные остатки тимина (T). Так как ампликоны, полученные с помощью Taq полимеразы, содержат на концах выступающие нуклеотидные остатки аденозина (А), они могут быть легко клонированы в полученный вектор.
Линеаризованный вектор и ампликон лигировали в течение 10 часов при температуре +4С. Полученную лигазную смесь вводили в клетки E.coli (штамм DH10b) методом кальциевой трансформации. Клетки высевали на среду, содержащую ампициллин, и растили в течение 10-12 часов при температуре 37С.
Выросшие ампициллинустойчивые колонии E.coli проверяли с помощью ПЦР на наличие целевого фрагмента ДНК, а также на прямую ориентацию этого фрагмента. Для этого в качестве прямого праймера выбрали праймер, отжигающийся на начало целевого фрагмента, а в качестве обратного праймера использовали праймер на край вектора, примыкающий к концу целевого фрагмента. В результате были отобраны клоны, содержащие целевую вставку в прямой ориентации.
Из выбранных в результате скрининга клонов были выделены соответствующие плазмиды, которые затем вводились в клетки E.coli (штамм BL21) для экспрессии генов MS2 фагов и упаковки целевых РНК в фаговые частицы внутри клеток. Для этого колонии с чашек собирали в жидкую среду, наращивали до оптической плотности, равной 1, добавляли ИПТГ и растили еще 4 часа при температуре 37С. Затем клеточную культуру центрифугировали, добавляли 1 мл буфера для MS2 фага и проводили лизис с помощью лизоцима (конечная концентрация 1 мг/мл), а также с помощью замораживания-оттаивания. Полученные лизаты обрабатывали ДНКазой и РНКазой для уничтожения всех нуклеиновых кислот, не включенных в фаговую оболочку. Затем проводили центрифугирование и отбирали супернатант, содержащий фаговые частицы. Наличие упакованной РНК в супернатанте контролировали с помощью электрофореза в агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Для получения более качественных и свободных от возможных примесей контролей проводили очистку упакованных РНК в хлориде цезия. Для этого полученные препараты смешивали с раствором хлорида цезия, переносили в запаивающиеся ценрифужные пробирки и проводили ультрацентрифугирование при скорости 65000 об/мин. на протяжении 20 часов (ультраценрифуга Beckman). В результате разные составляющие исходного препарата распределялись по длине пробирки, которую затем прокалывали и собирали содержимое, разделяя его на 7 фракций. Из них определяли наиболее чистую и концентрированную пробу, которую в дальнейшем разводили и использовали в качестве положительного контрольного образца.
Приложение 5. Обогащение и неспецифическая амплификация вирусной кДНК. 100 мкл осветленных клещевых суспензий обработали 25 ед. бензоназы (Sigma-Aldrich) 30 мин. при 37С в присутствии MgCl2, для удаления хозяйских нуклеиновых кислот. Далее суспензию обработали протеиназой К (до к/к 200 мкг/мл, Sigma-Aldrich) в присутствии 0,5% SDS, 25мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 50мМ Tris-HCl (pH8,0) 90 мин. при 56 С для инактивации бензоназы. Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции с помощью набора Рибо-золь В (AmpliSens). Полученный осадок РНК растворили в 40 мкл Н2О milliQ (AmpliSens). Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью вырожденного гексонуклеотидного праймера NTS-rnd6, содержащего на 5 - конце «довесок» в виде искусственной последовательности нуклеотидов (5 agatgtgtataagagacag(N)6 -3 ). Перед добавлением смеси для обратной транскрипции осуществляли отжиг праймера NTS-rnd6. Для этого к 12 мкл, содержащим вирусную дцРНК, добавляли 2 мкл NTS-rnd6 (48 пмоль /мкл), 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, Sigma-Aldrich) под слоем минерального масла и прогревали 2 мин. при 90С, затем резко помещали в лед. К полученному раствору добавляли 20 мкл RT-mix (AmpliSens), 4 мкл дитиотреита (ДТТ, 10 мМ), 1 мкл ревертазы MMLV (AmpliSens). Реакцию обратной транскрипции проводили на приборе Терцик (ДНК-Технологии) в следующем режиме: 24С – 10мин, 37С – 30 мин, 50С – 15 мин. Полученную кДНК обработали РНКазой Н (Fermentas) 15 мин. при 37С для удаления РНК, после чего инактивировали РНКазу Н прогреванием в течении 2 мин. при 95С. Для синтеза второй цепи кДНК к полученной смеси добавили 2 мкл 10х О-буфера (Fermentas), 12 мкл дНТФ 1,76 мМ (AmpliSens), 5 мкл Н2О milliQ (AmpliSens), 1 мкл фрагмент Кленова Exo(-) (Fermentas). Реакцию проводили 15 мин. при 24С, далее 20 мин. при 37С. Полученный продукт очистили с помощью набора QIAquick PCR kit (Qiagen). Очищенную кДНК элюировали в 50 мкл и хранили при -70 С.
Реакцию неспецифической амплификации проводили с помощью праймеров NTS1 (5 cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3 ) и NTS2 (5 -gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3 ), содержащих в своей 3 -области последовательность, идентичную «довеску» праймера NTS-rnd6 и в присутствии интеркалирующего красителя. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала по 5 пмоль каждого праймера, 5 мкл дНТФ 1,76 мМ (AmpliSens) под воском, 14 мкл пцр-смеси Flu2 (AmpliSens), 20 мкл кДНК и 3 мкл EvaGreen Dye 20х (Biotium Inc.). Реакцию проводили с помощью прибора для ПЦР в реальном времени Rotor-Gene 6000 в режиме: 95 С - 2мин; 95 С -20сек, 50 С - 40сек, 72 С - 60сек, п=4; 95 С - 20сек, 65 С - 20сек, 72 С -60сек (детекция). При достижении кривой флуоресценции порога насыщения реакцию останавливали. Полученный продукт использовали для ПЦР со специфическими праймерами на вирус Кемерово [4]. Приложение 6. Проведение реакции нейтрализации вируса Кемерово