Введение к работе
Актуальность темы. Микроспоридии - наиболее древние внутриклеточные паразиты среди зукариот, происхождение которых датируется ранним палеозоем (Исси, 1978). В настоящее время тип Microsporidia, представители которого сохранили некоторые прокариотные признаки, переведен из полцарства Protozoa в новое подцарство Archezoa (Corliss, 1994).
Длительная адаптация микроспоридий к развитию внутри клетки животного - хозяина предполагает их глубокую метаболическую зависимость от последнего, а также возможность целенаправленного воздействия на организм хозяина и противодействия его защитным системам. Поэтому системы паразит-хозяин с участием микроспоридий - интересные и перспективные модели для изучения фундаментальных проблем внутриклеточного паразитизма.
Широкое распространение микроспоридий при антагонистическом характере их взаимоотношений с хозяином (Шульман, 1984), объясняет возрастающий практический интерес к этим паразитам, который со стороны специалистов в области микробиометода обусловлен их важной ролью в регуляции численности природных популяций вредных насекомых. В нашей стране и за рубежом зарегистрированы эпизоотии микроспоридиозов в популяциях многих опасных вредителей сельскохозяйственных культур, леса и запасов. Проводятся исследования с целью создания биопрепаратов на основе микроспоридий. Микроспоридия Nosema locusiae послужила основой для создания и производства первых промышленных препаратов "Нолок" и "Нолобайт " для борьбы с саранчовыми (Henry et а!., 1985).
Несмотря на это, процессы, лежащие в основе патогенеза микроспориди-оза, остаются все еще не известными и, следовательно, не контролируемыми при использовании этих паразитов в качестве продуцентов биопрепаратов. При внутриклеточном паразитизме отношения между патогеном и зараженной клеткой в значительной мере определяются взаимодействием двух метаболических систем. Вместе с тем, метаболизм микроспоридий, а значит и механизмы, лежащие в основе патогенного воздействия этих паразитов на организм хозяина, остаются совершенно не исследованными.
Традиционно изучение метаболизма начинается с исследования энергетического обмена. Для эндопаразитов (как одноклеточных, так и гельминтов)
основным источником энергии являются углеводы (Сопрунов, 1987). Это и обусловило цель и задачи наших исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей энергетического и углеводного обменов микроспоридий Nosema grylli и их взаимодействия с обменными процессами насекомого-хозяина -двупятнистого сверчка Gryllus bimaculaius. Для успешного выполнения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать методики получения чистой от любых паразитов культуры сверчков и заражения насекомых спорами микроспоридий;
. - разработать методику получения высокоочищенных спор микроспоридий и подобрать условия разрушения очищенных спор;
- провести измерение активностей ферментов углеводного и энергетического обменов в спорах микроспоридий;
изучить влияние микроспоридий на активность ферментов углеводного и энергетического обменов в жировом теле сверчков;
сравнить влияние микроспоридий с воздействием другого внутриклеточного паразита жирового тела - кокцидии Adelina grylli, с целью выявления специфичности воздействия микроспоридий;
сопоставить данные об активностях ферментов в спорах с особенностями влияния микроспоридий на хозяина и сделать выводы об энергетическом обмене этих паразитов и их влиянии на метаболические процессы зараженной клетки и организма насекомого.
Научная новизна. На основании: 1) тестирования активностей 20 ферментов углеводного и энергетического метаболизма в очищенных и разрушенных спорах микроспоридии Nosema grylli, 2) изучения изменений активностей 8 ферментов в клетке хозяина, как ответной реакции метаболического аппарата на микроспорздиоз, 3) сравнения влияния микроспоридий на организм хозяина и метаболический аппарат зараженной клетки с влиянием кокцидии Adelina grylli, впервые в мире получены данные, позволяющие сделать выводы об особенностях углеводного и энергетического метаболизма микроспоридий.. Тестирование ферментов гликолиза показало, что этот путь играет важную роль в энергетике микроспоридий и что самые древние внутриклеточные паразиты - типичные анаэробы, использующие углеводы для синтеза АТФ. Установлено, что микроспоридии имеют ферменты, участвующие в пентозо-фосфатном пути и синтезе трегалозы. Вьивлено, что в спорах микроспоридий
отсутствуют или находятся на очень низком уровне активности ряда ферментов, что позволяет предположить наличие специфичных метаболических особенностей у этих паразитов, вероятно связанных с глубокой адаптацией к внутриклеточному развитию. Показано, что ответная реакция клетки хозяина на заражение проявляется в значительном увеличении активности ферментов, предположительно участвующих в утилизации выделяемых микроспоридиями конечных продуктов обмена. Установлено, что патогенное воздействие на сверчков при микроспоридиозе сопровождается снижением активностей ферментов, участвующих в синтезе энергетических субстратов в жировом теле. Впервые проведен сравнительный анализ влияния на организм хозяина и метаболические процессы зараженной клетки двух различных внутриклеточных паразитов жирового тела - микроспоридий и кокцидий. Установлено, что паразиты по разному влияют на хозяина, что, вероятно, обусловлено физиологическими отличиями этих видов.
Практическая значимость работы. Результаты исследования показали, что одной из основных причин патогенеза при микроспоридиозе насекомых является интенсивное использование паразитами углеводов зараженного жирового тела и выделение в клетку хозяина конечных продуктов углеводного катаболизма. Знание механизмов, лежащих в основе патогенеза, позволит контролировать признак патогенности в случае использования определенных видов в качестве продуцентов биопрепаратов - впервые появилась возможность связать в дальнейших экспериментах конкретные количественные физиологические показатели у микроспоридий (удельную активность ферментов) со степенью патогенности различных видов и изолятов, а также с жизнеспособностью спор при хранении биопрепаратов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийском сьезде по защите растений (1995), на заседаниях Санкт-Петербургских отделений Всероссийского общества протозоологов и Паразитологического общества при РАН (1995-1996), ежегодной отчетной сессии ВИЗР (1996), IV Международном совещании по оппортунистическим простейшим в рамках обьединенного собрания Американского общества паразитологов и Общества протозоологов (США, Аризона, Туссон, 1996), научных семинарах кафедры зоологии Дрезденского технического университета (Дрезден, 1996), кафедры зоологии беспозвоночных Санкт-Пегербургского государственного университета (Санкт-Петербург, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа юшюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками. Список литературы включает 195 работ, в том числе 133 работы на иностранных языках.