Введение к работе
Актуальность темы. Микроспоридии - чрезвычайно своеобразная группа облигатных внутриклеточных паразитов. Круг хозяев этих паразитических организмов охватывает представителей всех типов царства животных, от простейших до млекопитающих. Благодаря особенностям морфологии, физиологии и биохимии микроспоридий, их позиция в современной филогенетической системе - предмет неутихающих дискуссий.
Наиболее богат и разнообразен видовой состав микроспоридий, паразитирующих в насекомых. Энтомопатогенные микроспоридии - важные регуляторы численности насекомых, что обусловливает значительный интерес к данной группе паразитов как к потенциальным агентам биологического метода борьбы с насекомыми-вредителями. На основе микроспоридии Paranosema (Nosema) locustae созданы промышленные биопрепараты «Нолок» и «Нолобайт», успешно применявшиеся в борьбе с саранчовыми (Henry et al., 1974; 1978; 1981).
Длительное сохранение инвазионного начала во внешней среде и внедрение зародыша в клетку хозяина - главные функции споры и важнейшие факторы, определяющие эффективность биопрепарата на основе микроспоридий. Основными структурами споры, обеспечивающими реализацию упомянутых функций, являются оболочка и полярная трубка.
Наиболее сильное патогенное воздействие микроспоридий на организм хозяина отмечается на заключительном этапе спорогенеза, когда подавляющее большинство особей паразита представлено зрелыми спорами. На данной фазе развития микроспоридии оказывают мощные дистантные эффекты на иммунную и репродуктивную системы насекомых (Селезнев, 1997; Соколова, 2000; Токарев, 2003).
Указанные выше моменты несомненно связаны с уникальными структурными особенностями споры микроспоридий, что обусловливает актуальность изучения структурных белков спор с точки зрения паразито-хозяинных взаимоотношений.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось исследование структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, играющих ключевую роль в патогенезе микроспоридиоза сверчка Gryllus bimaculatus: основного белка оболочки и белков полярной трубки. Для достижения обозначенной цели предполагалось решение следующих задач:
-
Разработать метод выделения и очистки основного белка оболочки и белков полярной трубки спор P. grylli.
-
Исследовать влияние процесса экструзии, условий хранения на состав белков оболочки спор и изучить возможность использования полученных показателей для оценки жизнеспособности спор.
-
Определить внутриклеточную локализацию выделенных структурных белков на разных стадиях развития паразита, выявить особенности гликозилирования их молекул, а также-возможную роль данных белков в паразит-хозяинных ^^6нй^"^^!!^ИАЯ J
» о»
rsgfea
4. Разработать метод диагностики морфологически сходных видов микроспоридий (на примере рода Paranosema), основывающийся на
. анализе состава белков оболочки спор. Научная новизна. К началу экспериментальной работы, результаты которой легли в основу настоящей диссертации, не было ни одной публикации по структурным белкам энтомопатогенных микроспоридий.
Впервые разработан метод выделения основного белка оболочки спор >.
микроспоридии P. grylli и установлено, что данный белок а больших количествах высвобождается в среду в процессе стимуляции экструзии полярных трубок in vitro. Показано избирательное снижение содержания этого белка в оболочке спор в ходе их хранения. Продемонстрировано наличие больших количеств белка оболочки спор в цитоплазме зараженных клеток насекомого-хозяина и предложены гипотезы для возможного объяснения этого факта. Выявлено, что данный белок гликозилирован по типу О-маннозилирования, описанного только для дрожжевых грибов. Показано, что у микроспоридий отсутствует характерное для большинства типичных эукариот N-гликозилирование белков.
Впервые для энтомопатогенных микроспоридий у P. grylli
идентифицированы белки полярной трубки (БПТ). На примере БПТ P. grylli
продемонстрирована способность микроспоридий использовать одни и те же
белки для построения разных структур спор - оболочки и полярной трубки.
Выявлена исключительно высокая степень гликозилирования молекулы
одного из выделенных белков (БПТ-1), что, вероятно, связано с его особой
функцией в уникальном процессе выброса (экструзии) полярной трубки.
Практическое значение работы. На примере микроспоридии P. grylli
показано, что содержание количественно преобладающего белкового
компонента оболочки спор может служить показателем длительности их
хранения и жизнеспособности. Тест на основе электрофоретического
разделения белков оболочки может приблизительно показать пригодность
данной партии спор для использования в качестве продуцента биопрепарата. <
Белковый состав оболочки спор микроспоридий является надежным видоспецифичным признаком. Многие близкие виды микроспоридий невозможно отличить по морфологии при рассмотрении на светооптическом уровне. Мы рекомендуем использовать электрофоретические спектры белков спор для диагностики видов микроспоридий, например, при учете зараженности этими паразитами популяций вредных членистоногих. Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, декабрь 1998); на XXVI межвузовской конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии (С-Петербург, март 1999); на научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в решение задач научного обеспечения АПК Северо.-Запада РФ» (С-Петербург-Пушкин); на 49 чтении, посвященном памяти В. А. Догеля, на научных семинарах лаборатории'микробивлогичеекей защиты ВИЗР.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав и выводов. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 40 рисунками. Список цитированной литературы включает 91 источник, из которых 74 на иностранных языках.
