Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Введение 5
1.1. Актуальность проблемы 5
1.2. Цели и задачи исследования 6
1.3. Научная новизна 6
1.4. Практическая и теоретическая значимость 6
1.5. Положения, выносимые на защиту 7
1.6. Апробация диссертации 8
1.7. Публикации по теме диссертации 8
1.8. Структура и объем диссертации 9
ГЛАВА 2.Обзор литературы 10
2.1. Строение печени 10
2.2. Эмбриогенез печени 15
2.3. Регенеративные возможности печени 17
2.4. Заболевания печени 21
2.5. Методы оценки степени развития фиброза печени 30
2.6. Экспериментальные модели повреждения печени 34
2.7. Способы терапии фиброза печени 36
2.8. Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы 37
2.9. Роллерное органотипическое культивирование и специфическая биологическая активность МГТБ 41
ГЛАВА 3.Материалы и методы 46
3.1. Выделение и очистка МГТБ 46
3.2. Электрофорез белковых фракций в полиакриламидном геле 46
3.3. Масс-спектрометрический анализ 47
3.4. Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле 48
3.5. Определение размеров частиц методом динамического лазерного светорассеяния 49
3.6. Определение вторичной структуры методом кругового дихроизма 49
3.7. Модель острого токсического повреждения печени 49
3.8. Модель хронического токсического повреждения печени 50 3.9. Модель роллерного органотипического культивирования фибротической
печени 51
3.10. Гистологическое исследование 52
3.11. Морфологичекие и морфометрические исследования. 53
3.12. Биохимический анализ сыворотки крови 53
3.13. Молекулярно-биологическое исследование относительного уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР 53
3.14. Измерения и статистический анализ данных 55
ГЛАВА 4.Результаты и обсуждение 57
4.1. Физико-химическая характеристика выделенных биорегуляторов 57
4.2. Влияние МГТБ, выделенных из печени и сыворотки крови, на состояние печени при остром токсическом повреждении печени 60
4.3. Влияние МГТБ, выделенных из печени и сыворотки крови, на состояние печени при хроническом токсическом повреждении печени 63
4.4. Влияние МГТБ на состояние ткани печени при роллерном органотипическом культивировании. 80
Глава 5.Заключение 87
Глава 6.Выводы 90
Глава 7.Список литературы 92
- Цели и задачи исследования
- Заболевания печени
- Масс-спектрометрический анализ
- Влияние МГТБ, выделенных из печени и сыворотки крови, на состояние печени при остром токсическом повреждении печени
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Процессы восстановления в печени у млекопитающих часто протекают по механизму заместительной или атипичной регенерации, которая также именуется фиброзом – она сопровождается замещением функциональной ткани соединительнотканными волокнами. Фиброз печени обратим лишь на начальных этапах, он возникает в ответ на повреждение печени и характеризуется накоплением внеклеточного матрикса (ВКМ) в паренхиме. На заключительных этапах он является причиной 90% летальных исходов при хронических заболеваниях печени. В связи с этим поиск путей терапии фиброза печени остается острой медицинской и социальной проблемой (Налобин и др., 2016; Friedman, 2008).
В связи с этим в настоящее время осуществляется поиск различных факторов, способных замедлить или остановить фибротические процессы в печени. В настоящее время активно изучаются мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ), которые в сверхмалых дозах способны влиять на различные биологические процессы. Эти биологически активные вещества были выделены в отдельную группу на основании общности физико-химических свойств и характера биологического действия. Биорегуляторы данной группы были выделены из тканей животных, растений, а также из грибов. На их основе разрабатываются лекарственные препараты нового поколения (Ямскова и др., 2012).
Цели и задачи исследования
Цель данной работы – изучение влияния биорегуляторов, выделенных из печени крысы и сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), на заместительную регенерацию печени мыши.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать физико-химические свойства изучаемых биорегуляторов.
-
Исследовать протекторное действие биорегуляторов на модели острого токсического повреждения печени мыши.
-
Исследовать протекторное действие биорегуляторов на модели хронического токсического повреждения печени мыши.
-
Исследовать протекторное действие биорегуляторов на модели роллерного органотипического культивирования фибротической печени мыши.
Научная новизна
Впервые было показано биологическое действие МГТБ, выделенных из печени крысы и сыворотки крови КРС, на модели роллерного органотипического культивирования фрагментов фибротической печени мыши. Также впервые было продемонстрировано протекторное действие МГТБ, выделенного из печени крысы, на моделях острого и хронического токсического повреждения печени мыши и отсутствие такого действия у МГТБ, выделенного из сыворотки крови КРС.
Практическая и теоретическая значимость
Данные МГТБ могут быть использованы при разработке фармакологических препаратов нового поколения для нормализации функции печени при различных патологиях. Кроме того, модель роллерного органотипического культивирования фибротической печени мыши может быть использована для поиска и проверки эффективности новых гепатопротекторных препаратов. Результаты данного исследования могут быть включены в курсы лекций по биологии развития, клеточной биологии, гистологии и биотехнологии.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты были получены при помощи нескольких независимых методов физико-химического, гистологического, биохимического и молекулярно-биологического анализа, подтверждающих друг друга, объем использованных выборок обеспечивал статистическую достоверность данных. В работе использовались все необходимые контроли.
Материалы и результаты диссертационной работы были доложены в виде устных докладов на XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2014), XXII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2015), Международном симпозиуме молодых ученых Европы «Symposium of Biology Students in Europe» (Греция, 2015).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 110 страницах, содержит 6 таблиц, 20 рисунков и состоит из следующих разделов: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающего 163 источника (67 русскоязычных и 96 англоязычных).
Цели и задачи исследования
Поверхность печени покрыта висцеральным листком брюшины и тонкой соединительнотканной капсулой (капсулой Глиссона). Паренхима печени состоит из структурно-функциональных единиц – долек, которые имеют призматическую форму (обычно шестигранную). Они образованы печеночными балками и внутридольковыми синусоидными кровеносными капиллярами. Друг от друга дольки отграничены тонкими прослойками соединительной ткани, в которой располагаются печеночные триады (портальные тракты) и поддольковые вены. Портальные тракты располагаются в вершинах многоугольника и определяют границы дольки. В их состав входят междольковые артериолы, ветви воротной вены, желчные протоки и лимфатические сосуды. В центре дольки располагается центральная вена. Печеночные балки, построенные из гепатоцитов, расположены радиально. Между ними в направлении от периферии к центру долек проходят кровеносные капилляры, окруженные пространством Диссе (перисинусоидальным пространством). В него могут попадать составные части плазмы крови, а при патологии и форменные элементы. Между рядами гепатоцитов, составляющих балку, располагаются желчные капилляры. Они не имеют собственной стенки, поскольку образованы соприкасающимися билиарными поверхностями гепатоцитов (рисунок 2). Желчные капилляры начинаются на центральном конце печеночной балки и несут желчь к периферии дольки. Из капилляров желчь попадает в терминальные желчные канальцы (каналы Геринга), которые образуют желчные протоки (холангиолы). Холангиолы впадают в междольковые желчные протоки, выстланные холангиоцитами (Афанасьев, Юрина, 2012). Рисунок 2. Строение структурно-функциональной единицы печени (Tanaka et al., 2011).
Печень снабжается кровью из двух источников – воротной вены, приносящей кровь от органов желудочно-кишечного тракта, и печеночной артерии, приносящей кровь от аорты. В печени эти сосуды распадаются на более мелкие. К дольке подходят междольковая вена и междольковая артерия, которые распадаются на вокругдольковые (вену и артерию). Вокругдольковые вена и артерия сливаются, образуя синусоидные капилляры. Таким образом, долька получает смешанную венозно-артериальную кровь, которая течет от периферии к центру и собирается в центральную вену. Далее, по собирательным венам кровь возвращается в общий кровоток. Благодаря этому через печень проходит за короткое время вся кровь организма (Быков, 2002).
Печеночные клетки, или гепатоциты составляют от 60 до 80 % всех клеточных элементов печени. Они имеют неправильную многоугольную форму и часто содержат два ядра. Большинство клеток полиплоидные. Ядра содержат 1-2 ядрышка. Цитоплазма гепатоцитов зернистая и окрашивается не только кислыми, но и основными красителями, содержит большое количество органелл. Гепатоциты выполняют большую часть функций печени. Прочная механическая связь между клетками обеспечивается за счет комплексов межклеточных соединений. Клетки, расположенные в центральных и периферических зонах дольки, различаются размерами, развитием органелл, активностью ферментов. Гепатоциты периферической зоны активнее участвуют в процессах накопления и детоксикации веществ. Клетки центральной зоны активнее в процессах экскреции соединений в желчь. Клетки, выстилающие синусоиды, включают, по крайней мере, четыре различных типа. Эндотелиальные клетки – выстилают синусоиды. Отличаются отсутствием базальной мембраны и наличием множества пор (фенестр). Это обеспечивает быстрый обмен питательными веществами и макромолекулами с близлежащими гепатоцитами через пространство Диссе. Эндотелиальные клетки могут также поглощать посредством эндоцитоза разные молекулы и частицы, участвуют они и в метаболизме липопротеинов. Звездчатые макрофаги (клетки Купфера) располагаются в щелях между эндотелиальными клетками или на их поверхности. Они имеют многочисленные отростки, которые проникают в пространство Диссе через цитоплазму эндотелиоцитов. Эти клетки обладают высокой фагоцитарной активностью и очищают кровь от частиц, микроорганизмов, токсинов и антигенов. Они участвуют в секреции большого количества важнейших белков, в том числе ряда цитокинов, факторов гемопоэза, фибронектина, эритропоэтина. Клетки Купфера осуществляют активацию гормонов (инсулина, кортикостероидов), оказывают влияние на рост и регенерацию гепатоцитов, а также на регуляцию структурного гомеостаза печени. Обновляются за счет размножения собственной популяции или за счет пополнения моноцитарными предшественниками из костного мозга. Продолжительность жизни около 100 дней.
Перисинусоидальные липоциты (клетки Ито) располагаются в пространстве Диссе (рисунок 3). Имеют длинные отростки, которые охватывают синусоиды. Органеллы развиты слабо. В цитоплазме вокруг ядра и в отростках содержатся крупные липидные капли, в которых запасается витамин А. Данные клетки являются основными продуцентами компонентов ВКМ печени, осуществляя синтез и секрецию коллагенов I, III и IV типов, фибронектина, ламинина и протеогликанов. Как полагают, клетки Ито трансформируются в фибробласты в ответ на повреждение печени, которые приводят к гибели гепатоцитов.
Pit-клетки располагаются в просвете синусоида, реже в пространстве Диссе. В их цитоплазме присутствуют секреторные гранулы. Эти клетки представляют собой тканевые лимфоциты с функцией естественных клеток-киллеров и эндокринной функцией. При заболеваниях печени они уничтожают поврежденные гепатоциты, а в период выздоровления стимулируют пролиферацию печеночных клеток (Быков, 2002; Kmie, 2001).
Холангиоциты образуют эпителий желчных протоков. Имеют базальную мембрану. Просвет холангиол образован не более чем 2-3 клетками, а стенка желчного протока – всегда большим количеством холангиоцитов. Между кровеносными и желчными капиллярами нет непосредственной связи, так как их отделяют друг от друга гепатоциты и эндотелиальные клетки. Только при заболеваниях, связанных и гибелью печеночных клеток, желчь может поступать в кровеносные капилляры (Афанасьев, Юрина, 2012).
Заболевания печени
Для пациентов с прогрессирующим фиброзом или его финальной стадией – циррозом – показана пересадка печени (Hernandez-Gea, Friedman, 2011). Поэтому противофиброзная терапия при хронических заболеваниях печени необходима. Главная цель ее состоит в том, чтобы предотвратить развитие цирроза и его осложнений. Существует несколько подходов к терапии фиброза печени: лечение основного заболевания (диабета, болезней сердца, вирусных гепатитов), ослабление воспалительного и иммунного ответа, торможение активации клеток Купфера, нейтрализация ответа звездчатых клеток, стимуляция апоптоза звездчатых клеток, усиление деградации ВКМ.
На ранних стадиях развития заболеваний применяют гепатопротекторы, которые по химическому составу делят на фосфолипиды, аминокислоты, витамины и антиоксиданты. Наиболее часто используются эссенциальные фосфолипиды – группа препаратов, прошедших клинические испытания. Преимуществом их является комбинированное действие. Одним из самых изученных в этой группе является Эссенциале форте, который представляет собой препарат, содержащий смесь эссенциальных фосфолипидов. Мембрано-стабилизирующее и гепатопротективное действие обеспечивается путем замещения дефектов и восстановления барьерной функции липидного слоя мембран. Есть данные о защитном действии антиоксидантов при токсическом повреждении печени (Налобин и др., 2016в; Arendt, 2003; Yang et al., 2010). Они способны замедлять или полностью ингибировать процессы свободнорадикального окисления. К антиоксидантам можно отнести урсодезоксихолевую кислоту, витамин Е, бета-каротин, пентоксифиллин, S-аденозин-метионин, а также мелатонин. Мелатонин – гормон эпифиза. В настоящее время исследуются иммунологические, антиканцерогенные, геропротекторные и антиоксидантные свойства этого гормона. Рассматривается возможность применения его в терапии широкого спектра заболеваний (Рапопорт, Голиченков, 2009; Беспятых и др., 2010).
Особенный интерес представляет антиоксидантное действие мелатонина. Мелатонин после попадания в кровоток метаболизируется главным образом в печени. Он способен препятствовать развитию реакций свободнорадикального окисления. Мелатонин связывает свободные радикалы, такие как радикалы супероксидного аниона, синглетный кислород и NO, запуская естественную систему антиоксидантной защиты, через активацию супероксиддисмутазы и каталазы (Беспятых и др., 2010; Филатова и др., 2011). Мелатонин способен нейтрализовать гидроксил-радикал, переводя его в неактивное состояние (Tan et al., 1998). Так же мелатонин ограничивает ПОЛ, благодаря нейтрализации инициирующего радикала (Maharaj et al., 2007).
Для терапии заболеваний печени также используются ЭСК, мезенхимальные стволовые клетки, полученные из разных источников, эндотелиальные прогениторные клетки и фетальные стволовые клетки (Zhao et al., 2009).
Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы были обнаружены практически во всех тканях животных, причём не только млекопитающих, но и в тканях птиц, амфибий, а также в растениях и грибах (Ямскова и др. 1977а, 1977б, 2012; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003в, 2011). Данные биорегуляторы были выделены в отдельную группу на основании общности их физико-химических свойств и характера биологического действия. Они локализованы внеклеточно, характеризуются наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности и представляют собой пептидно-белковые комплексы, состоящие из пептидов – продуктов протеолиза белков межклеточного пространства и белка-модулятора, представляющего собой одну из изоформ бычьего сывороточного альбумина. Было показано, что МГТБ в сверхмалых дозах могут влиять практически на все биологические процессы: адгезию, миграцию, пролиферацию, направленность дифференцировки, апоптоз клеток, а также они способны стимулировать клеточные источники регенерации, таким образом восстанавливая нормальные функции и морфологию в патологически изменённых тканях (Ямскова и др., 1977а, 1977б, 2009а, 2010а, 2012; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003а, 2005б; Маргасюк и др., 2005а, 2005б, 2008). Исследование МГТБ проводится на основе разработанного экспериментального подхода, сочетающего в себе комплекс методов выделения, очистки, изучения физико-химических свойств и биотестирования.
Все МГТБ, независимо от их происхождения, получают по сходной методике, включающей экстракцию биорегуляторов и их очистку, которую проводят с применением различных биохимических методов (высаливание, изоэлектрофокусирование, электрофорез в ПААГ белков, обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хромотография в градиенте вода-ацетонитрил) (Ямсков и др., 2009; Ямскова и др., 2012; Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007; Yamskova et al., 2007б).
Для определения мембранотропной активности МГТБ был разработан метод биотестирования, который заключается в исследовании вязкоупругих свойств ткани в условиях стандартного деформационного воздействия. Деформационное воздействие проводят с помощью специально дезинтегратора, представляющего собой гомогенизатор с зазором 50 мкм. При таком воздействии некоторые клетки остаются целыми, а некоторые – разрушаются, с выделением клеточных ядер, при этом их соотношение будет зависеть от вязкоупругих свойств плазматической мембраны (Ямскова, Резникова, 1991).
Масс-спектрометрический анализ
Для проведения количественной оценки степени повреждения печени при модели острого токсического повреждения проводили морфометрический анализ, при котором оценивали площадь очагов некроза гепатоцитов в разных экспериментальных группах. Для каждого животного было проанализировано 30 полей зрения.
Для проведения качественной оценки степени развития фиброза использовали шкалу METAVIR. Для проведения количественной оценки степени развития фиброза проводили морфометрический анализ гистологических препаратов, где оценивалась степень коллагенизации. Для этого рассчитывали отношение длины коллагеновых септ к общему периметру долек печени. Для каждого животного было проанализировано 30 полей зрения.
Забор крови проводился из хвостовой вены. Для получения сыворотки крови образцы инкубировали при 37С 15 минут, затем 30 минут при +4С. Далее проводили центрифугирование в течение 15 минут на 3000g. Биохимический анализ уровней АЛТ и АСТ в сыворотке крови проводили на биохимическом анализаторе Beckman Coulter AU480 (Beckman Coulter, США).
Проводили полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с целью выявить различия в относительных уровнях экспрессии генов -SMA, TGF- и TIMP-1. В качестве конститутивного гена выбрали -actin. Подбор праймеров (таблица 2) осуществляли с использованием программы Primer Express (Applied Biosystems, США). Праймеры были синтезированы компанией ДНК-Синтез (Россия).
Количество выделенной РНК определяли спектрофотометрически (Biowave II, Biochrom, США). Для определения нативности выделенной РНК проводился электрофорез в 1% агарозном геле, приготовленном на буфере ТАЕ (40мМ Трис (pH 8.0), 40мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА), с использованием интеркалирующего красителя этидия бромида в концентрации 0.5 мкг/мл.
Электрофорез проводили в буфере ТАЕ при напряженности электрического поля 8-10 В/см. Окрашенные гели фотографировали в системе гель-документирования Syngene GBOX Chemi XT4 (Syngene, Великобритания) и производили полуколичественный анализ с помощью программы GeneTools (Syngene, Великобритания).
В смесь для реакции обратной транскрипции вносили 1мкг РНК. Для синтеза кДНК на матрице РНК использовали набор реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). Реакцию проводили в соответствии с рекомендациями данными производителем реактивов.
Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США). В смесь для ПЦР вносили 5 мкл кДНК, 7,5 пмоль каждого праймера и готовый раствор ScreenMix (Евроген, Россия). Реакцию проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Для того, чтобы убедиться в отсутствии контаминации готовили контрольный образец, в который добавляли все компоненты смеси, кроме пробы с кДНК. Для визуализации результатов реакции проводился электрофорез в 1,5% агарозном геле, приготовленном на буфере ТАЕ, с использованием интеркалирующего красителя этидия бромида в концентрации 0.5 мкг/мл. Электрофорез проводили в буфере ТАЕ при напряженности электрического поля 8-10 В/см. Гели анализировали под ультрафиолетовым светом при помощи системы гель-документирования. Для контроля молекулярной массы продуктов реакции использовали маркеры PCR 100bp Low Ladder (Sigma, США).
Измерение площади очагов некроза и протяженности септ проводили на основе фотографий при помощи программного обеспечения ImageJ (NIH, США). Полученные численные значения анализировали при помощи программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft Сorporation, США) и STATISTICA 8.0 (Dell, США).
С использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Вилка были проверены гипотезы о нормальности распределении исследуемых показателей. Для величин, имеющих нормальное распределение, данные приводили в виде среднего±стандартное отклонение. Если гипотезы о нормальности распределений были отвергнуты, приводили медиану, квартили (25-75%) и вариацию (минимальное и максимальное значения) величины. Если распределение изучаемых параметров отличалось от нормального, для сравнения двух независимых групп использовали критерий Манна-Уитни (U-критерий), для сравнения двух зависимых групп использовали критерий Уилкоксона (W-критерий). Критический уровень значимости для всех статистических критериев принимали равным 0,05.
Влияние МГТБ, выделенных из печени и сыворотки крови, на состояние печени при остром токсическом повреждении печени
В настоящем исследовании было показано, что МГТБ, выделенный из сыворотки крови КРС, не проявлял гепатопротекторную активность на исследуемых моделях. Это выражалось в отсутствии статистически значимых отличий по показателям относительной площади очагов некроза, степени коллагенизации ткани печени, уровне ферментов АЛТ и АСТ в сыворотке крови, а также уровне экспрессии генов a-SMA, TGF-fi и TIMP-1 от данных этих показателей в группах мышей с индуцированным острым и хроническим повреждением печени. Ранее на модели роллерного органотипического культивирования печени тритонов было показано, что МГТБ, выделенный из сыворотки крови КРС, стимулировал митозы соединительно-тканных клеток. Очевидно, данный МГТБ способен поддерживать процессы кроветворения в капсулярной области печени амфибий (Ямскова и др., 2010а). Отрицательные данные, полученные на печени мыши, могут свидетельствовать о том, что у тритонов, в отличие от млекопитающих, во взрослом состоянии продолжается кроветворение в печени. Поскольку исследуемые биорегуляторы обладают тканеспецифичным действием, то, соответственно, он влиял на клетки кроветворения у тритона, но не влиял на клетки паренхимы печени у мыши.
Ранее было показано, что, в отличие от МГТБ, выделенного из сыворотки крови КРС, МГТБ, выделенный из печени крысы, активировал меланомакрофаги и угнетал процессы кроветворения в печени амфибий (Ямскова и др., 2010а). Согласно литературным источникам, эти клетки являются рекрутированными макрофагами, относящимися к мононуклеарно-фагоцитарной системе, способны автономно синтезировать меланин (Sichel et al, 2002). Представленные литературные данные, а также результаты ранее проведенного исследования специфической активности МГТБ, выделенного из печени крысы, на модели роллерного органотипического культивирования печени тритона показали, что он проявлял гепатопротекторные свойства (Ямскова и др., 2010). Результаты проведенного нами исследования подтвердили это предположение. В нашей работе было показано, что при пероральном приеме МГТБ, выделенного из печени крысы, на фоне острого токсического повреждения печени снижалась относительная площадь очагов некроза в 1,8 раз, по сравнению с группой мышей с индуцированным острым токсическим повреждением печени. А также снижались темпы развития индуцированного фиброза при хроническом токсическом повреждении печени. Это выражалось в снижении степени коллагенизации ткани печени в 1,5 раза - на 30-е и в 1,3 раза - на 60-е сутки эксперимента, снижении в сыворотке крови уровня ферментов АЛТ - в 1,2 раза, АСТ - в 1,4 раза, а также снижении уровня экспрессии генов a-SMA - в 6 раз, TGF-Р - в 1,3 раза и TIMP-1 - в 1,6 раз, по сравнению с данными показателями в группе мышей с индуцированным фиброзом.
Результаты, полученные в данном исследовании можно объяснить влиянием МГТБ, выделенного из печени крысы, на клеточные источники регенерации в ткани печени. Тем более, что при культивировании фибротической печени в присутствии данного биорегулятора было продемонстрировано его протекторное действие, предотвращающее тотальную гибель гепатоцитов. В этом аспекте стоит отметить, что для ряда МГТБ, выделенных из других тканей, была показана их способность стимулировать процессы восстановлении и репарации в патологически измененных тканях, за счет способности дополнительно активировать источники регенерации (Ямскова и др., 2012).
При ежедневном чередовании приема МГТБ, выделенного из печени крысы, и МГТБ, выделенного из сыворотки крови КРС, удалось добиться более яркого гепатопротекторного эффекта по сравнению с действием только МГТБ, выделенного из печени крысы. Это выражалось в снижении степени коллагенизации ткани печени в 2 раза - на 30-е и 1,4 раза - на 60-е сутки эксперимента, снижении в сыворотке крови уровня ферментов АЛТ - в 1,4 раза, АСТ - в 1,2 раза, а также снижении уровня экспрессии генов a-SMA - в 2 раз, TGF-Р - в 1,3 раза и TIMP-1 - в 1,3 раза, по сравнению с данными показателями в группе мышей с индуцированным фиброзом, принимавших с питьевой водой МГТБ, выделенный из печени крысы.
Это можно объяснить тем, что МГТБ, выделенный из сыворотки крови КРС, может активировать регуляторные механизмы, затрагивающие и другие системы органов, которые опосредованно могут влиять на заместительную регенерацию печени.
Проведенное исследование также показало выраженный тканеспецифический характер протекторного действия МГТБ, выделенного из печени крысы, и его значительное отличие от действия МГТБ, выделенного из сыворотки крови КРС. Следует отметить, что, возможно, МГТБ, выделенный из сыворотки крови КРС, также проявил тканеспецифическое протекторное действие, предотвращая гибель клеток в области портальных трактов при роллерном огранотипическом культивировании фибротической печени.
Ранее было высказано предположение о том, что клеточными источниками заместительной регенерации (т.е. при фиброзе) являются клетки Ито, гепатоциты, портальные фибробласты и фибробласты костномозгового происхождения (Hernandez-Gea, Friedman, 2011). Можно предположить, что, МГТБ, выделенный из печени крысы, оказывает протекторное действие, как на клетки Ито, так и на гепатоциты; МГТБ, выделенный из сыворотки крови КРС, влияет только на соединительно-тканные клетки – на портальные фибробласты и фибробласты костномозгового происхождения.