Содержание к диссертации
Введение
1 Регенерация у позвоночных животных 11
1.1 Определение и виды регенерации 11
1.2 Модели исследования регенерации и перспективы регенеративной биологии и медицины 12
1.3 Преимущества хвостатых амфибий как объекта для исследования механизмов регенерации; модель регенерации хвоста
2 Ход регенерации хвоста тритона 14
3 Роль раневого эпидермиса в регенерации 17
4 Роль бластемы в регенерации
4.1 Клеточные источники формирования бластемы и их потенции 19
4.2 Регуляция образования, пролиферации и дифференцировки бластемы 21
5 Регенерация мышц 24
5.1 Тканевая регенерация и резервные клеточные популяции 25
5.2 Эпиморфная регенерация и дедифференцировка мышечных волокон 26
6 Регенерация нервной системы 27
6.1 Потенции эпендимных клеток 29
6.2 Регуляторная роль эпендимных клеток 30
7 Механизмы регуляции морфогенеза хвоста 34
7.1 Передне-задняя полярность 34
7.2 Дорсовентральная полярность 35
7.3 Эпигенетические регуляторы регенерации и морфогенеза 37
8. Белки теплового шока как факторы, участвующие в процессах развития и регенерации 38
8.1 Белки теплового шока в развитии амфибий 39
8.2 Белки теплового шока в регенерации 41
9 Амфибии как модельный объект гравитационной биологии развития 42
9.1 Гравитационная биология развития Xenopus leavis 42
9.2 Гравитационная биология развития Pleurodeles waltl 44
9.3 Регенерация Pleurodeles waltl в условиях космического полета и измененной гравитационной
нагрузки 45
9.4 Примеры молекулярных эффектов измененной гравитационной нагрузки
Материалы и методы 50
1 Содержание животных и операции 50
1.1 Общие принципы 50
1.2 Содержание животных на субстрате 50
1.3 Тепловой шок
2 Морфометрическое изучение регенератов хвоста 51
3 Эксперименты по исследованию обратимости морфогенетического эффекта 53
4 Морфологическое изучение регенератов хвоста 54
5 Изучение пролиферативной активности клеток в регенератах хвоста 54
6 Изучение апоптоза в регенератах хвоста 55
7 Ингибирование сигнального пути Shh
7.1 Введение фармакологических агентов в среду 57
7.2 Внутрибрюшинное введение фармакологических агентов 8 Ингибирование белков теплового шока 58
9 Изучение экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)
9.1 Подготовка образцов кДНК 61
9.2 Полуколичественная ПЦР 62
9.3 Количественная ПЦР в реальном времени 63
10 Иммуногистохимическое определение экспрессии белков HSP70 и HSP90 в тканях регенерирующего хвоста 65
Результаты и их обсуждение 69
1 Морфометрические исследования регенератов хвоста в двух группах 69
1.1 Воспроизведение эффекта измененного морфогенеза при содержании на субстрате 69
1.2 Изучение темпов регенерации при содержании в аквариуме и на субстрате 73
1.3 Проверка обратимости изменения формы регенерата при содержании на субстрате 77
2 Проявление эффекта загиба хвоста при регенерации с перегрузкой 2g 80
3 Изучение тканевых и клеточных аспектов измененного морфогенеза регенерирующего хвоста на субстрате 83
3.1 Морфологическое изучение регенератов хвоста в аквариуме и на субстрате 83
3.2 Изучение пролиферативной активности клеток регенерата 89
3.3 Изучение локализации апоптоза в регенерирующих тканях
4 Исследование роли сигнального пути Shh в изменении морфогенеза хвоста 98
5 Морфогенетический эффект теплового шока при регенерации хвоста 103
6 Ингибирование белков теплового шока 107
7 Изучение экспрессии генов теплового шока и локализации соответствующих белков в тканях 111 7.1 Изучение экспрессии генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 методом ПЦР 111
7.2 Изучение экспрессии генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 методом ПЦР-РВ 113
7.3 Изучение локализации белков теплового шока HSP70 и HSP90 116
Заключение 123
Выводы 128
Список литературы 129
- Преимущества хвостатых амфибий как объекта для исследования механизмов регенерации; модель регенерации хвоста
- Регуляция образования, пролиферации и дифференцировки бластемы
- Дорсовентральная полярность
- Гравитационная биология развития Xenopus leavis
Преимущества хвостатых амфибий как объекта для исследования механизмов регенерации; модель регенерации хвоста
В настоящее время регенерация у позвоночных животных интенсивно изучается на множестве моделей. К ним относятся многочисленные животные модели in vivo: регенерация конечности (плавник Danio rerio, конечность взрослых Urodela, конечность головастиков Anura, почка конечности птиц, дистальная фаланга пальца мыши), модель регенерации глаза (сетчатка рыб, хрусталик и сетчатка Urodela, сетчатка птиц), и, наконец, две модели регенерации хвоста (хвост головастиков Anura и взрослых Urodela). Кроме того, получило широкое применение культивирование органов, отдельных тканей, в том числе бластем, и клеток (Карлсон, 1986; Dinsmore, 1991; Carlson, 2007; Han et al.., 2005).
Последние достижения в биологии, в особенности в области молекулярной биологии и биологии стволовых клеток, привели к возрождению активного интереса к регенерации. Наиболее широко обсуждаемыми при этом являются процессы де- и трансдифференцировки клеток, т.е. явления, составляющие основу регенерации путем формирования бластемы. Открытие соматических стволовых клеток привело к осознанию существования латентного регенеративного потенциала многих тканей. Выявлена и активно изучается для получения необходимых доказательств возможность зрелых клеток трансдифференцироваться в клеточные типы, отличные от исходного. Здесь в качестве примера можно привести клетки Мюллера сетчатки позвоночных, способные трансдифференцироваться не только в нейроны, но и в клетки хрусталика (обзор Tanaka, 2003).
Наконец, доказана способность ядра зрелой дифференцированной клетки возвращаться к дедифференцированному состоянию, и разработан протокол получения таких, так называемых, iPS cells – индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Tanaka, 2003). Все эти достижения привели не только к сближению биологии регенерации и биологии стволовых клеток, но и открыли новые подходы к проблеме регенерации у высших позвоночных. Возможность анализа иммунологических, генетических и эпигенетических механизмов, контролирующих регенерацию, и экспериментального вмешательства в них существенно расширили перспективы регенеративной медицины
Хвостатые амфибии (отряд Urodela) являются уникальной группой животных с точки зрения исследования регенерации. Представители этого отряда – Pleurodeles waltl, Ambystoma mexicanum, Notophthalmus viridescens, Cynops pyrrhogaster – способны регенерировать самые разные структуры – конечность, хвост, хрусталик и сетчатку глаза, участки кишечника, печени, сердца и кожи. Испанский тритон Pleurodeles waltl демонстрирует все перечисленные возможности, кроме того, все эти структуры регенерируют у взрослых, прошедших метаморфоз, половозрелых животных. Другими словами, регенерация у испанского тритона, безусловно, является самостоятельным феноменом, и не осуществляется за счет механизмов эмбриональной регуляции. Преимущества испанского тритона как модельного объекта многочисленны. Эти животные в естественных условиях могут не выходить из водоема, и в неволе содержатся в простых аквариумах без террариумного компонента; требования к освещению, чистоте и температуре воды также минимальны. Они достаточно просты в разведении; самки способны запасать сперму после спаривания на длительный срок, что позволяет проводить оплодотворение, например, в условиях космического полета. Эмбриональное развитие медленное, что удобно во многих экспериментах, при этом половозрелости испанский тритон достигает существенно раньше, чем многие другие представители отряда (Васецкий, 1975). В экспериментальном манипулировании они также весьма просты: не требуют стерильности при манипуляциях, особых условий при восстановлении после операций. Как и в случае других низших позвоночных, действующие вещества могут быть доставлены в организм не только путем внутрибрюшинных инъекций, но и через кожу посредством простого разведения в среде. Они не требуют специальной маркировки за счет индивидуального узора меланофоров. Что немаловажно, ткани хвостатых амфибий состоят из крупных клеток, что облегчает гистологическое, иммуногистохимическое и электрофизиологическое исследование тканей. Сами клетки и целые фрагменты органов (например, глаза) легко поддаются культивированию in vitro в средах простого состава без необходимости частой смены среды.
Морфология разных регенерирующих структур Urodela детально описана, вследствие давнего интереса к этому явлению. «Первооткрывателем» регенерации хвостатых амфибий считается Лазаро Спалланцани (Lazzaro Spallanzani, 1729-1799 г.г.), описавший в 1765 году регенерацию конечности и хвоста саламандры. Шарль Бонне (Charles Bonnet) расширил знание о регенерации амфибий, описав регенерацию хрусталика саламандры (цит. по Dinsmore, 1991). С тех пор вышло огромное количество работ, описавших детали регенерации Urodela гистологическими, электронномикроскопическими, иммунохимическими методами; накоплен большой массив данных по разным видам травмирующих воздействий (ампутации, рассечению, денервации, эксплантации ткани), способам культивирования, влиянию на регенерацию различных гормонов, морфогенов, трофических факторов (Карлсон, 1986; Carlson, 2007; Бабаева, 2009). К настоящему моменту найдены многие гены, участвующие в регуляции регенерации, в том числе гомологи генов, известных для других моделей (например, Xenopus laevis). Показано, что в целом, молекулярный механизм при дифференцировке индивидуальных тканей в регенерирующем хвосте сходен с таковым в развитии и задействует те же гены и сигнальные пути. Есть, однако, и отличия, связанные с тем, что регенераты формируются в окружении уже дифференцированных тканей.
С определенного времени хвостатых амфибий стали использовать в качестве очень перспективного и удобного объекта космической биологии. На тритонах изучается влияние факторов космического полета (ФКП) и измененной гравитационной нагрузки на процессы оплодотворения, эмбрионального развития, на состояние тканей и органов взрослого животного, а также на ход регенерации различных органов и тканей. Открытия в этой области могут не только иметь важнейшее практическое применение для обеспечения безопасности здоровья человека в условиях космического полета и орбитальных работ, но и пополнить фундаментальные знания о механизмах контроля регенерации со стороны эпигенетических факторов.
Регенерация хвоста у Urodela заслуживает особого внимания, так как в ходе нее регенерирует и полностью восстанавливает функциональную активность спинной мозг взрослой особи. Исследования в области регенерации хвоста расширяют знания о дифференцировке нейронов и глии, нейральных и глиальных предшественниках в ЦНС взрослого животного, меры пластичности их дифференцировки, и, наконец, механизмах, контролирующих эти процессы. Эти знания, в свою очередь, имеют большую практическую значимость, особенно в регенерационной медицине для поиска лечения тяжелых травм спинного мозга. Таким образом, регенерация хвоста у Urodelа является незаменимой моделью для изучения клеточных и молекулярных механизмов регенерации и роли эпигенетических факторов в этом процессе.
Регуляция образования, пролиферации и дифференцировки бластемы
Нами в первую очередь был проведен предварительный эксперимент для определения оптимального способа введения ингибитора и проверки эффективности выбранных по литературным данным его доз. Для этого использовали 5 групп интактных тритонов: 1) интактный контроль (Int, 4 тритона); 2) группа, подвергавшаяся тепловому шоку без воздействия ингибитора (HS, 3 тритона); 3) группа, подвергавшаяся тепловому шоку после внутрибрюшинной инъекции ингибитора (HS+ip, 3 тритона); группа, подвергавшаяся тепловому шоку после внутримышечной инъекции ингибитора (HS+im, 3 тритона); группа, подвергавшаяся тепловому шоку после наружного нанесения ингибитора (HS+ext, 3 тритона). Обработку ингибитором осуществляли за 6 часов до теплового шока, фиксация материала для выделения РНК проводилась сразу после теплового шока (по Manwell, Heikkila, 2007). Дозировки определяли, принимая во внимание данные работ на клетках млекопитающих и X. laevis (Yokota et al., 2000; Manwell, Heikkila, 2007), где концентрация ингибитора в среде составляла 100 мкМ. Учитывали также результаты работы на мышах in vivo (Koishi et al., 2001), в которой применялись дозировки от 62,5 до 500 мг/кг веса, а в качестве носителя было использовано оливковое масло. Последнее было выбрано нами в качестве носителя в силу отсутствия токсичности, а также большей, чем у водных растворов, вязкости, что было удобно для наружного нанесения. Концентрация ингибитора в масле составила 50 мкг/мл (приблизительно 200 мкМ) для наружного нанесения (по 100 мкл на животное), 500 мкг/мл (приблизительно 2 мМ) для инъекций (по 100 мкл на животное). Инъекции осуществлялись с помощью инсулинового шприца, внутрибрюшинно либо внутримышечно в основание хвоста. Наружно раствор ингибитора наносили следующим способом: на хвост тритона надевалась латексная насадка, сделанная из пальца перчатки; внутрь насадки автоматической пипеткой вносили 100 мкл раствора. Раствор распределялся по поверхности хвоста, после чего насадка фиксировалась у основания хвоста тонкой полоской клейкой ленты. Через 6 часов после обработки ингибитором все животные были подвергнуты тепловому шоку. После этого участок хвоста, взятый от стандартного уровня ампутации, был фиксирован в растворе RNA-later. Из тканей была выделена РНК и проведена ПЦР в реальном времени с использованием праймеров к последовательностям генов Hsp70 и Ef1- (см. раздел 9). В результате чего была показана высокая эффективность наружного нанесения ингибитора в блокировании стресс-индуцированной экспрессии Hsp70 по сравнению с другими способами, даже при использовании в 10 раз более низкой дозы ингибитора. Высокая степень проницаемости кожных покровов тритона для экзогенно вносимых агентов была показана в лаборатории ранее (Новикова и др., 2008). В дальнейших экспериментах использовался именно этот способ обработки.
Поскольку подобные эксперименты не были проведены ранее, нас интересовало влияние ингибитора белков теплового шока, как на нормальный ход регенерации хвоста, так и на развитие специфического морфогенетического эффекта содержания на субстрате, отмеченного нами в предыдущих экспериментах. Все эксперименты проводили на животных, регенерирующих после ампутации дистальной 1/3 хвоста. В данных экспериментах использовали 6 групп животных. 1) группа в аквариуме и группа на субстрате, не получавшие фармакологических веществ и не подвергавшиеся сопутствующим манипуляциям, (отрицательный контроль, по 3 тритона); 2) группа в аквариуме и группа на субстрате подвергавшиеся тем же манипуляциям, что и опытная группа, но получавшие только растворитель без ингибитора, (контроль специфичности, по 3 тритона); 3) группа в аквариуме и группа на субстрате, получавшие раствор ингибитора, (опытная группа, по 8 тритонов).
Сразу после ампутации животных содержали вместе в глубокой воде, так как предшествующие эксперименты показали отсутствие существенного вклада условий содержания на начальном этапе регенерации на дальнейшее развитие морфогенетических эффектов. Через 16 суток после ампутации все животные прошли начальный этап заживления раны, регенераты были сфотографированы с помощью бинокулярной камеры и прошли стандартный морфометрический анализ. На основании его результатов животные были разделены на две группы, не отличавшиеся статистически по стадии регенерации, длине регенерата и ширине его основания, углу загиба хвоста и коэффициенту загиба хвоста К. Одна из полученных групп была оставлена в глубокой воде, вторая была рассажена по контейнерам с влажным субстратом. Через 21 сутки после ампутации все регенераты достигли стадии II (Iten, Bryant, 1976a). В это время мы провели повторный морфометрический анализ регенератов, после чего группа в аквариуме, и группа на субстрате были поделены на три подгруппы (отрицательный контроль, контроль специфичности и опытную группу), не отличавшиеся друг от друга по морфометрическим показателям регенерации. Первое воздействие ингибитором было проведено в тот же день и повторялось далее каждые 2–3 суток вплоть до 47 суток после ампутации (всего 12 раз). Морфометрический анализ регенератов проводили еженедельно вплоть до 49 суток после ампутации так, как описано в разделе 2.
Для изучения использовали ткани интактного хвоста (четыре образца), ткани хвоста, подвергнутого тепловому шоку (четыре образца), а также регенераты хвоста на разных стадиях в аквариальном контроле и группе на субстрате (по три образца для каждой группы через двое суток п/оп, на стадии II – 28 суток п/оп, и на стадии IV – 49 суток п/оп). Материал – около 2 мм интактного хвоста проксимальнее плоскости ампутации или регенераты с 1 мм культи – немедленно после получения взвешивали в холодном растворе 0,1 M PBS (pH 7,5), после чего переносили в раствор TRI Reagent RT (MRC, США) для гомогенизации ткани и выделения тотальной РНК в соответствии с рекомендациями производителя. После гомогенизации и отделения остатков клеток центрифугированием в пробирки с раствором белка нуклеиновых кислот в TRI Reagent RT добавляли 1/5 объема хлороформа. После расслаивания смеси отбирали содержащую РНК водную фазу, добавляли равный объем изопропанола и осаждали РНК центрифугированием. Полученный осадок отмывали очищенным 75% этанолом и хранили в нем при температуре -20С. Для дальнейшей работы осадок высушивали, растворяли в воде, свободной от РНКаз, чистоту и концентрацию полученной тотальной РНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, США). От примесей геномной ДНК образцы освобождали ферментом ДНКазой I (DNase I, RNase-free, Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя. Инкубацию с ферментом проводили в течение 30 мин при 37С. Для ингибирования фермента добавляли ЭДТА до конечной концентрации 2,3 мМ и инкубировали при температуре 65С 15 мин. После этого немедленно приступали к синтезу первой цепи кДНК с помощью набора для проведения обратной транскрипции «Синтез первой цепи кДНК (рэндом)» (Силекс, Россия), содержащего случайные гексапраймеры. В соответствии с рекомендациями производителя, в первую очередь производили отжиг матрицы с гексапраймерами при 70С в течение 10 мин. После добавления в пробирки реакционного буфера, смеси нуклеотидов и обратной транскриптазы M-MLV, смесь инкубировали 10 минут при 25С, а затем 1 час при 37С. Реакцию останавливали прогреванием до 70С в течение 10 мин, а полученную кДНК хранили при -20С. В ходе работы было выяснено, что для эффективной инактивации ДНКазы I недостаточно прогрева до 70С, что проявляется в низком и нестабильном выходе кДНК. Введение дополнительного шага – прогревания смеси при температуре 95С в течение 15 мин после остановки реакции обратной транскрипции – позволило полностью устранить данную проблему. В результате были получены кДНК библиотеки интактного хвоста тритона, тканей хвоста после теплового шока, а также регенератов хвоста через 2 суток после операции и на стадиях регенерации II и IV. Концентрация кДНК во всех библиотеках была измерена спектрофотометрически и доведена до стандартных значений – 500 нг/мкл для сток-растворов и 125 нг/мкл для рабочих разведений. Данная концентрация кДНК была выбрана с учетом рекомендаций по работе на амплификаторах фирмы Applied Biosystems, исходя из следующих значений: концентрация кДНК в реакционной смеси 5 нг/мкл, объем реакционной смеси 25 мкл, объем добавляемого в реакционную смесь раствора кДНК 1 мкл.
Дорсовентральная полярность
При изложении результатов мы придерживаемся той последовательности, в которой проводилось изучение предлагаемой модели, служащей в конечном итоге для объяснения молекулярных механизмов морфогенеза при регенерации у животных. Поскольку модель является новой, то вначале потребовались твердые доказательства изменений морфогенеза регенерирующего хвоста в разных условиях содержания животных (в аквариуме и на субстрате). Для этого были использованы морфометрические исследования, демонстрирующие как собственно эффект, так и его устойчивое воспроизведение.
В первую очередь в ходе работы была проведена проверка наблюдений, сделанных ранее в экспериментах в космосе на биоспутниках Фотон М2 и М3 и в соответствующих контролях. В ходе этих экспериментов было обнаружено, что в группе синхронного контроля, содержавшейся в лаборатории на субстрате, имеет место загиб формирующихся регенератов хвоста. Для воспроизведения обнаруженного эффекта и его изучения провели дополнительные лабораторные тесты. Для этого прооперировали 20 тритонов, по 10 для аквариального контроля и группы на субстрате. На протяжении эксперимента регенераты хвоста каждого из 20 тритонов фотографировали 8 раз, 1 раз в неделю. На рисунке 1А отражен прогресс регенерации в двух группах на примере типичных регенератов. Видно, что регенераты из аквариального контроля и группы на субстрате начали различаться по форме, начиная с 21-го дня регенерации: осевые структуры в регенератах из группы на субстрате формировались под углом к переднезадней оси хвоста. По мере дальнейшего формирования осевых структур отличия становились более очевидными и загиб регенерата в большей или меньшей степени проявился у всех животных из группы на субстрате, за исключением единственного случая, в котором регенерат имел нестандартную форму (рис. 1Б) и был исключен из дальнейшего анализа. Таким образом, в лабораторных условиях впервые был воспроизведен эффект, отмеченный в экспериментах по регенерации у тритонов того же вида, экспонированных в условиях измененного (сниженного) влияния гравитации на борту космических аппаратов Фотон М2 и М3 и в синхронном контроле на субстрате при 1g (Grigoryan et al., 2008). Устойчивое воспроизведение в условиях лаборатории направленных изменений морфогенеза при регенерации хвоста позволило провести детальный морфометрический анализ. Рис. 1. А. Прогресс регенерации в течение 49 дней п/оп на примере типичных образцов из аквариального контроля (верхний ряд) и группы на субстрате (нижний ряд). Б. 49-дневный регенерат аномальной формы, образовавшийся в группе на субстрате.
Полученные изображения формирующихся регенератов были обработаны с помощью компьютера (см. раздел 2 главы «Материалы и методы»): были измерены значения длины регенерата и угла загиба хвоста (УЗХ). В силу того, что в некоторых случаях наблюдалось отклонение распределения этих величин от нормального, сравнение аквариального контроля и группы на субстрате проводили непараметрическими методами, используя критерии Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова для сравнения двух независимых выборок. На рисунках 2А, Б отражены изменения медианных значений указанных величин в ходе регенерации. Рис. 2. А. Изменение медианных значений угла загиба хвоста (УЗХ) в двух группах в ходе регенерации. Б. Изменение медианных значений длины регенерата в двух группах в ходе регенерации. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графиках приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.
Важно, что кривые изменения медианных значений УЗХ для контрольной группы и группы на субстрате начинают расходиться с 14 дня после ампутации. Оба использованных критерия для сравнения двух независимых выборок показали статистическую достоверность этих отличий на всех сроках регенерации, кроме 7-го дня п/оп. Кривые изменения медианных значений длины регенерата в двух группах несколько расходятся в период с 14 до 28 дней п/оп, однако статистически значимыми отличия длины регенерата на основании использованных критериев можно признать лишь через 7 и 14 дней п/оп. Тем не менее, нельзя исключить, что несколько большая длина регенератов в группе на субстрате в первые 28 дней п/оп оказала влияние на значения УЗХ в этот период, в то время как истинные отличия, связанные только c изменением формы регенерата, по-видимому, в полной мере проявляются через 28 дней после ампутации, вместе с морфогенезом осевых структур.
Чтобы избежать искажений, связанных с вариациями длины регенерата, было решено использовать для оценки формы регенерата коэффициент К, указывающий положение проекции кончика хвоста на основание регенерата (см. раздел 2 главы «Материалы и методы»). Так же, как и исследованные ранее величины, значения К в двух группах сравнивали с помощью критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Рисунок 3 показывает изменение медианных значений коэффициента К в ходе регенерации.
Видно, что значение коэффициента К подвержено более значительным вариациям в обеих группах, нежели значения длины регенерата или УЗХ; в результате отличия между группами признаются достоверными лишь на более поздних стадиях регенерации (в данном случае, лишь через 49 дней п\оп), когда определяющие их структуры сформировались. Оценка по коэффициенту К является дополнительной и позволяет с большой уверенностью констатировать наличие или отсутствие отличий в конце эксперимента.
На рисунке 3 видно, что график изменения коэффициента К в ходе регенерации является двухфазным: в первой фазе (в данном случае между 7 и 28 днями п/оп) имеет место равномерное уменьшение К, идущее одинаковыми темпами в аквариальном контроле и в группе на субстрате; во второй фазе (между 28 и 49 днями п/оп) значение К в группе аквариального контроля выходит на плато, в то время как в группе на субстрате продолжает уменьшаться. Такой характер изменения К хорошо согласуется с характером протекания регенерационных процессов. Так, первой фазе графика изменения К соответствуют стадии II и III регенерации, когда происходит рост бластемы и начало дифференцировки в ее проксимальной части тканей и органов хвоста. При этом дистальный конец регенерата, изначально определяющийся как наиболее выступающая точка округлой бластемы (и потому находящийся посередине дорсо-вентральной проекции хвоста), начинает определяться положением дистальной части осевых структур, и, соответственно, смещается в вентральную сторону. Второй фазе графика соответствуют стадии IV и V, т.е. стадии дальнейшей дифференцировки тканей в проксимо-дистальном направлении, рост и созревание всех структур. Стабилизация К в аквариальном контроле отражает рост осевых структур в горизонтальной плоскости; а продолжающееся уменьшение К в группе на субстрате связано с отклонением от нее, все более явно проявляющимся по мере увеличения длины регенерата. По всей видимости, в группе на субстрате на границе двух фаз (в данном случае, около 4 недель п/оп) происходит либо закладка регенерирующих структур под углом к интактным структурам, либо изменение исходно регулярной формы раннего регенерата.
Таким образом, полученные результаты с одной стороны доказывали устойчивое проявление эффекта изменения формы регенерата в зависимости от условий содержания (предположительно, гравитационной нагрузки), с другой стороны требовали уточнений скорости роста регенератов, вносящих коррективы и необходимых для объективной оценки эффекта.
Гравитационная биология развития Xenopus leavis
Поскольку, как было показано нами выше, и тепловой шок, и KNK437 влияют на уровень экспрессии гена Hsp70, следует предполагать, что именно его белок обладает такими эффектами. Тем не менее, весьма вероятно, что он не является единственным, а только находится в системе взаимодействий с другими морфогенетическими регуляторами. Нельзя также исключить, что набор белков теплового шока, участвующих в морфогенетических изменениях регенерата, также меняется в зависимости от внешнего воздействия. Уточнение этого вопроса остается в перспективе дальнейших исследований.
Первым этапом проверки предположения об участии белков теплового шока в становлении морфогенетического эффекта внешних воздействий со стороны условий содержания (разные «дозы» гравитации, тепловой шок) было изучение регуляции экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 на уровне транскрипции. Для этого использовали методы ПЦР и ПЦР в реальном времени. Выделение РНК и синтез кДНК-библиотек провели для тканей интактного хвоста (4 образца), хвоста после теплового шока (4 образца) и регенератов из аквариального контроля и группы на субстрате через 2 дня п/оп, на стадии II (28 дней п/оп) и на стадии IV (49 дней п/оп) (по 3 образца в каждой группе на стадию). На рисунке 25 представлены электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученных с использованием праймеров для генов Ef1-, Gapdh, -Actin, Hsp70, Hsp90. Для первых трех генов из списка, рассматриваемых в качестве генов «домашнего хозяйства» и используемых в связи с этим в качестве внутреннего контроля в ПЦР, во всех пробах наблюдали полосы ожидаемого размера приблизительно одинаковой интенсивности. Таким образом, в данных тканях экспрессия этих генов может рассматриваться как достаточно стабильная, а качество проб в разных группах – как сравнимое. Таким образом, заметные отличия в интенсивности полос ПЦР-продуктов, соответствующих мРНК Hsp70, Hsp90 можно рассматривать как свидетельство изменения экспрессии соответствующих генов.
Полосы ПЦР-продукта, соответствующего мРНК Hsp70, имели ожидаемую длину, наблюдались во всех образцах интактного контроля и обладали невысокой интенсивностью окрашивания; имело место небольшое количество побочного продукта меньшей длины. В группе теплового шока интенсивность свечения полос ПЦР продукта была заметно выше, а побочный продукт отсутствовал. Через 2 дня п/оп наблюдалось снижение яркости полос ПЦР продукта в аквариальном контроле и исчезновение как основного, так и побочного продукта в группе на субстрате. На стадиях II и IV полосы ПЦР продукта соответствовали описанию для интактного контроля в обеих группах. Это позволило заключить, что уровень экспрессии гена Hsp70 значительно увеличивается после теплового шока, что было ожидаемо. Неожиданным явилось снижение экспрессии Hsp70 после ампутации. При этом имеется расхождение данных ПЦР-РВ и качественной ПЦР в отношении образцов, взятых через 2 дня п/оп. По всей видимости, кажущееся снижение экспрессии Hsp70, наблюдаемое методом качественной ПЦР, обусловлено общим более низким уровнем транскрипции на этой стадии. Отсутствие видимого снижения экспрессии Ef1- может объясняться намного более высоким уровнем его экспрессии по сравнению с Hsp70, и выходом на плато на ранних циклах ПЦР, что исключит заметные различия к 40-му циклу, на котором проводили анализ ПЦР-продуктов.
Полосы ПЦР-продукта ожидаемой длины с мРНК Hsp90 наблюдали во всех образцах; побочные продукты отсутствовали. Тепловой шок не увеличивал яркость полос ПЦР-продукта, однако увеличение интенсивности свечения наблюдалось с ходом регенерации; так, наибольшую толщину и яркость имели полосы из аквариального контроля на стадии IV. По всей видимости, экспрессия гена Hsp90 не индуцируется стрессовыми факторами, но возрастает в ходе регенерации.
Электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученные на матрице кДНК из тканей интактного хвоста (4 образца), хвоста после теплового шока (4 образца), через 2 дня п/оп и из регенератов на II и IV стадиях (отдельно для аквариального контроля и группы на субстрате – по 3 образца в группе на стадию) с использованием праймеров, сконструированных по нуклеотидным последовательностям мРНК генов Ef1-, Gapdh, Actin, Hsp70, Hsp90 тритона. Визуализация ПЦР-продуктов с помощью интеркалирующего красителя бромистого этидия при УФ освещении.
Для проверки описанных закономерностей и количественной оценки уровня экспрессии мРНК изучаемых генов был использован метод ПЦР в реальном времени. Все эксперименты проводили в использованием тех же кДНК-библиотек и тех же праймеров, что и эксперименты по качественной ПЦР; в качестве внутреннего контроля использовался ген Ef1-. Причины, обусловившие выбор данного гена, описаны в разделе 9.3 главы «Материалы и методы».
С помощью ПЦР в реальном времени было показано, что аннотированный в базе данных GenBank ген Hsp70 тритона является индуцируемым: после теплового шока количество мРНК увеличивалось в пробах примерно в 950 раз (рис. 26). Менее значительное, но статистически достоверное увеличение количества мРНК Hsp70 было отмечено также через 2 дня п/оп – в 15 раз в аквариальном контроле и в 8 раз в группе на субстрате. На стадиях регенерации II и IV наблюдалась тенденция к повышению уровня экспрессии Hsp70 в 2–7 раз по сравнению с интактным контролем, в некоторых группах почти достигавшая уровня статистической значимости (например, в аквариальном контроле на стадии IV; p = 0,063). В работе, посвященной анализу экспрессии Hsp70 в развивающихся и регенерирующих конечностях Ambystoma mexicanum, показали наличие экспрессии данного гена в интактных тканях и ее увеличение в 1,5–2,0 раза через 24 часа п/оп и в 2,5 раза на стадии лопатки (примерно соответствует стадии II при регенерации хвоста) (Levesque et al., 2005). Эти значения соответствуют наблюдаемым нами тенденциям и подкрепляют возможность того, что за ними стоят отличия, не признанные нами статистически значимыми в силу высокого разброса значений. Ни на одной стадии регенерации, однако, нами не было выявлено статистически достоверных отличий уровня экспрессии Hsp70 в аквариальном контроле и группе на субстрате. Необходимо отметить существенные вариации значений, полученных для каждой группы; они намного превышают уровень чувствительности метода ПЦР-РВ, поэтому возможно, что уменьшение этих вариаций путем увеличения выборок и количества проведенных экспериментов может позволить обнаружить более тонкие отличия между группами.
Таким образом, при изучении экспрессии гена Hsp70 с помощью количественной ПЦР выявлена тенденция увеличения экспрессии через 2 дня после операции относительно интактного контроля, прослеживающаяся и в дальнейшем в ходе регенерации. Увеличение при этом не было столь значительным, как при тепловом шоке, и существенно варьировало от образца к образцу. На этом фоне детектировать различия между группами животных, содержащихся в аквариуме и на субстрате при стандартных одинаковых температурах, оказалось затруднительным. Тем не менее, результаты данного раздела исследования впервые выявили экспрессию гена Hsp70 при регенерации хвоста у тритона P. waltl вне теплового шока.
Для аннотированной последовательности гена Hsp90 тритона была показана высокая стабильность экспрессии после теплового шока и в ходе регенерации. Это дает основания считать, что данный ген кодирует конститутивную форму белка HSP90. К сожалению, в настоящее время для тритона недоступны последовательности, кодирующие другие формы белка HSP90, кроме использованной нами для синтеза праймеров. Этот факт затрудняет анализ экспрессии индуцируемой формы Hsp90 у тритона.