Введение к работе
Актуальность проблемы. Хрусталик глаза позвоночных на протяжении десятилетий широко используется как модельный объект в эмбриологии, цитологии, а в последнее время и молекулярной биологии развития. Разделение структурных водорастворимых белков хрусталика - кристаллитов - на три основных класса, а, р и 7-кристаллины, было обосновано Мернером еще в 1894 году (Мбгпег, 1894). Специфичной укладкой именно этих белков, по массе составляющих около 90% всех белков хрусталика, объясняют его важнейшие свойства: прозрачность и способность фокусировать изображение на сетчатке. Уникальность хрусталика состоит также и в том, что клетки его эпителия дифференцируются в волокна на протяжении всей жизни органа; при этом клетки различных стадий дифференцировки занимают в хрусталике различные, но строго определенные зоны. Указанные особенности делают хрусталик удобным объектом исследования механизмов действия разнообразных дифференцировоч-ных факторов посредством выделения различных его частей. Кроме того, именно линза амфибий позволяет исследовать свойственный некоторым их видам процесс регенерации хрусталика из радужки (вольфовская регенерация; см. Лопашов, Строева, 1963).
Изучение перечисленных выше процессов требует наличия маркеров, позволяющих как идентифицировать хрусталиковые клетки, так и определять отдельные стадии их дифференцировки, в частности In vitro при формировании атипичных хрусталиков или единичных хрус-таликовых клеток. Совершенствование методов белковой химии привело к ситуации, при которой более изощренными методами идентифицировалось все большее количество белков. Так, методом изота-хофореза выявляются 14 р- и IS 7-кристаллинов (Boura, Delmotte, 1979). Принципиально новые возможности исследований создает применение технологии рекомбинантных ДНК. Фракционирование кодирующих кристаллины генов посредством их клонирования позволяет не только изучать процессы дифференцировки и регенерации на более ранних этапах, используя клонированные последовательности в качестве зондов, изучать активность, но и определять структуру генов, а, соответственно, и их количество для всех классов кристалликов.
Цель и задачи исследования. Основная цель данного исследования состояла в получеіши банка структурных генов, содержащего кодирующие последовательности всего спектра водорастворимых белков хрусталика глаза - кристаллитов, что создает основу для изучения механизмов дифференцировки и регенерации хрусталика амфибий вплоть до самых ранних этапов этих процессов и открывает возможность анализа непосредственно самих кристаллиновых генов. Для достижения указанной цели было необходимо:
выделить и оценить физико-химические характеристики матричной поли(А)+РНК хрусталика травяной лягушки Rana temporaria;
используя поли(А)РНК"1" в качестве матрицы, синтезировать полноразмерную двуспиральную комплементарную ДНК (дек ДНК);
встроить дек ДНК в вектор и проклонировать ее в клетках Escherichia coll;
провести скрининг полученной клонотеки, выделить и охарактеризовать клоны, кодирующие кристаллины;
выделить и провести рестрикционный анализ клонов, содержащих последовательности наиболее гетерогенного и трудно идентифицируемого поликлональными антисыворотками белков хрусталика -р-кристаллинов.
Научная новизна. В данной работе впервые в нашей стране осуществлено клонирование двуспиральной комплементарной ДНК. В результате получен первый в мире банк клонов, содержащих последовательности, кодирующие кристаллины.
Практическая значимость. Выявленные в результате проведенного исследования кристаллинспвцифичные клоны использованы в работах по изучению ранних стадий дафференцировки клеток хрусталика лягушки Rana temporaria, а также структурном анализе кристаллиновых генов. Вследствие значительной межвидовой гомологии кристал-линов полученные данные могут быть использованы исследователями, изучающими кристаллины других видов позвоночных, а также регенерацию хрусталика.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: XIY International Embryological Conference (Patras, Greece, 1980); Second Soviet-Italian Symposimn (Puahchino, 1980); VI Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981); Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" (Пущино, 1982); Двустороннем симпозиуме
СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982); 16th PEBS Congress (Moscow, 1984).
Апробация диссертации проведена на заседании объединенного семинара по гистологии, цитологии и гистогенезу Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 6 апреля 1998 г.
Публикации. Основные данные по теме диссертации представлены в 8 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуздения полученных результатов, заключения и выводов. Работа изложена на 179 страницах, включая 119 страниц машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками и 2 таблицами. Список цитированной литературы включает 12 работ отечественных и 324 - иностранных авторов.