Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Регенерация в периферической и центральной нервной системе млекопитающих 11
2. Развитие неокортекса у грызунов
2.1. Нейрогенез 17
2.2. Глиогене
3. Регенерация в развивающемся и зрелом мозге 25
4. Нейротрансплантация
4.1. История нейротрансплантации 30
4.2. Источники малодифференцированных клеток 32
4.3. Методы визуализации трансплантированных клеток 5. Миграция и дифференцировка трансплантированных клеток 39
6. Интеграция трансплантированных клеток 41
7. Иммунологические аспекты нейротрансплантации 44
8. Медицинское применение нейральных стволовых клеток 46
Материалы и методы 50
1. Получение фетальной ткани 50
2. Нейротрансплантация 50
3. Фиксация головного мозга 51
4. Гистологическое окрашивание 51
5. Иммуногистохимическое маркирование 51
6. Характеристика антител 52
7. Контроль нейротрансплантации 52
Результаты 55
1. Исследование развития тканевых и суспензионных трансплантатов неокортекса эмбрионов 12,5 суток развития з
1.1. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 7-е сутки 55
1.2. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 30-е сутки 63
1.3. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 60-е сутки 70
2. Исследование развития тканевых и суспензионных трансплантатов неокортекса эмбрионов 14,5 суток развития 75
2.1. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 7-е сутки 75
2.2. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 30-е сутки 85
2.3. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 60-е сутки 89
3. Исследование развития тканевых и суспензионных трансплантатов неокортекса эмбрионов 19,5 суток развития 93
3.1. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 7-е сутки 94
3.2. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 30-е сутки 99
3.3. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 60-е сутки 104
4. Подтверждение специфичности нейротрансплантации 109
4.1. Иммуногистохимический контроль 109
4.2. Негативный контроль к нейротрансплантации ткани, маркированной зеленым флуоресцентным белком 109
Обсуждение 112
1. Дифференцировка, морфология и миграция клеток донора в ткани реципиента 112
2. Пролиферация клеток донора и реципиента 118
3. Глиальная реакция реципиента 119
4. Реципрокный рост волокон между донором и реципиентом 119
Заключение 124
Выводы 127
Список литературы
- Регенерация в развивающемся и зрелом мозге
- Иммуногистохимическое маркирование
- Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 30-е сутки
- Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 60-е сутки
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Низкая способность центральной нервной системы (ЦНС) млекопитающих к регенерации становится серьезным препятствием на пути к восстановлению нормального функционирования мозга при возможных травмах и нейродегенеративных заболеваниях. Одним из многообещающих подходов для изучения регенерации ЦНС является метод ней-ротрансплантации, т.е. пересадка тканей донора в мозг реципиента. В начале XX века было обнаружено, что в отличие от дифференцированных тканей взрослого организма, трансплантация эмбриональной ткани дает наиболее перспективные результаты. В настоящее время считается, что клетки эмбрионального мозга являются эффективным материалом для клеточной терапии. Таким образом, изучение механизмов возможного замещения поврежденных структур мозга и/или стимуляции собственного регенеративного потенциала с помощью трансплантированной эмбриональной нервной ткани является необходимым и востребованным, как для фундаментальной науки, так и для возможного клинического применения. Развитие и совершенствование методики подбора индивидуального материала для трансплантации позволит сделать важный шаг в сторону персонализированной медицины.
Степень разработанности темы исследования. На данный момент существует большое разнообразие клеток, которые потенциально могут рассматриваться, как подходящие для нейротрансплантации. Такие клетки могут быть получены, например, из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), клеток нервного гребня, мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и других видов клеток. Однако получение этих типов клеток требует сложных протоколов культивирования, более того, они могут быть опасны из-за риска образования тератокарцином. Клетки зачатков нервной системы развивающихся организмов лишены этих недостатков – они не требуют длительных манипуляций и безопасны в применении. Фетальная ткань может служить «точкой отсчета» при сравнении поведения различных типов клеток после трансплантации. Клетки эмбриональной нервной ткани принято называть "золотым стандартом" (Nelander et al., 2013). Активное внедрение новейших технологий позволяет изучать процессы развития и интеграции трансплантатов эмбриональной нервной ткани на новом методическом уровне. В частности, появились новые методы визуализации трансплантированных клеток. Пересадка ткани трансгенных животных, в чьих клетках синтезируются флуоресцентные белки, позволяет достоверно различать трансплантированные клетки донора в окружающей ткани реципиента. Однако вопрос выбора возраста ткани донора для пересадки и типа трансплантата (цельные 3D-фрагменты или суспензии клеток) до сих пор остается открытым.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение особенностей развития клеточных и 3D-тканевых трансплантатов неокортекса различной степени дифференцировки, полученного от трансгенных GFP-мышей, в интакт-
ном мозге реципиента. Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить возможность и характер процесса дифференцировки, а также способность к пролиферации клеток суспензионных и 3D-тканевых трансплантатов эмбрионального неокортекса стадии начала (Э12,5), пика (Э14,5) и завершения (Э19,5) генерации нейронов.
-
Проанализировать пути миграции и морфологию клеток суспензионных и 3D-тканевых трансплантатов неокортекса эмбрионов стадий Э12,5, Э14,5, Э19,5.
-
Изучить клеточные ответы в ткани мозга реципиента на трансплантацию эмбрионального неокортекса, в частности, глиальную реакцию, врастание нейральных волокон.
-
Изучить характер распространения отростков клеток суспензионных и 3D-тканевых трансплантатов неокортекса эмбрионов стадий Э12,5, Э14,5, Э19,5.
-
Выявить оптимальный возраст (согласно степени дифференцировки эмбриональной трансплантируемой ткани) и тип (тканевые 3D- или суспензионные трансплантаты) донорского материала для нейротранспланта-ции.
Научная новизна работы. Впервые в рамках одной работы проведен сравнительный анализ развития суспензионных и 3D-тканевых трансплантатов неокортекса разных стадий генерации нейронов (от эмбрионов мышей стадий Э12.5, Э14,5, Э19.5). Выделенный 3D-фрагмент нативной ткани является системой, в которой сохранена цитоархитектоника, связи клеток, внеклеточный матрикс и микроокружение клеток. В суспензионном трансплантате клетки теряют связи друг с другом, отсутствует или изменяется внеклеточный матрикс и соответствующее микроокружение. В отличие от большинства используемых в настоящее время моделей, работа проводилась на исходно неповрежденном (интактном) мозге реципиента, что является крайне важным, поскольку повреждение мозга приводит к преждевременному выделению факторов, стимулирующих регенерацию. Фрагменты ткани и суспензии клеток не подвергались предварительному культивированию перед трансплантацией. В работе использовался стандартизованный комплекс современных методов описания ткани и идентификации клеток донора и реципиента, включая применение трансгенных животных, в нервных клетках которых синтезируется зеленый флуоресцентный белок (GFP); специфическое иммунохимическое маркирование нейронов разной степени зрелости и глиальных клеток; 2D-и 3D-визуализация с использованием конфокального микроскопа и цифрового флуоресцентного микроскопа. Комплекс примененных методик позволил установить судьбу трансплантированной ткани с разрешением до единичных клеток и их отростков. На основе полученных данных выявлены оптимальные сроки для тканей донора, при ко-4
торых пересаженная ткань остается жизнеспособной в исходно не поврежденном мозге реципиента не менее 2-х месяцев, в ней поддерживается пролифера-тивная активность, клетки способны дифференцироваться в нейрональном и глиальном направлениях. При этом клетки донора формируют плотную сеть отростков в ткани мозга реципиента и не препятствуют врастанию волокон нервной ткани реципиента в трансплантат. Обнаружено, что при идентичных условиях трансплантации процесс интеграции цельных 3D-фрагментов ткани эмбрионального неокортекса в мозг реципиента происходит быстрее, чем полученной из аналогичной области суспензии клеток.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные фундаментальные данные имеют большое значение для дальнейшего развития методов восстановительной и регенеративной медицины. Так, на основе результатов данной работы станет возможным индивидуально подбирать материал для трансплантации. Клеточные и тканевые трансплантаты первичной эмбриональной нервной ткани могут служить в качестве определенного стандарта при анализе результатов трансплантации модифицированных клеток (например, клеток не нейрального происхождения, подвергшихся культивированию и репрограм-мированию). Полученные в работе результаты могут быть использованы в курсах лекций по нейробиологии в высших учебных заведениях, а также для специалистов соответствующего профиля на курсах повышения квалификации.
Апробация работы. Результаты были неоднократно доложены в форме устных (7) и стендовых (5) докладов на ряде российских и международных конференций: 1) Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва; 2013, 2014, 2015). 2) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва; 2009, 2013; 2014). 3) Всероссийская конференция «Регенеративная биология и медицина» (Москва; 2011). 4) Всероссийская научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» с международным участием (Москва; 2014, 2016). 5) Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Россия; 2013, 2014). 6) Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург; 2015). Также материалы работы и примененные в ней методики были использованы в курсе лекций и практических занятий при проведении Всероссийских школ по флуоресцентным методам визуализации в биомедицинских исследованиях, проводимых на базе ИБР РАН: 1) «Современные методы флуоресцентной визуализации в биомедицинских и биотехнологических исследованиях» (Москва; 2010, 2012). 2) «Оптическая микроскопия и флуоресцентные методы в биомедицинских исследованиях» (Москва; 2013). Автор работы является руководителем гранта РФФИ "мол_а" № 14_04_31117.
Личное участие автора. Личный вклад автора состоял в анализе литературных данных, планировании и выполнении экспериментов, анализе полученных результатов, подготовке данных для публикаций и конференций. Все этапы экспериментальной работы, куда вошли как микрохирургические методы, так и методы иммуногистохимии и визуализации с применением современных мето-
дов микроскопии, были полностью выполнены автором. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах, содержит 55 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает 217 источников.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и РИНЦ, и соответствующих Перечню ВАК, а также 12 тезисов докладов и материалов конференций.
Регенерация в развивающемся и зрелом мозге
В конце XIX века было установлено, что аксоны клеток поврежденной центральной нервной системы (ЦНС) не способны заново прорастать на длинные дистанции и восстанавливать связи, которые были нарушены. Уже в то время исследователи обратили внимание на разницу между плохо регенерирующими аксонами ЦНС и, как правило, хорошо регенерирующими аксонами периферической нервной системы (ПНС). Сантьяго Рамон-и-Кахаль суммировал представления ученых того времени о регенерации нервной системы в своей книге "Regeneration and Degeneration of the Nervous System" (1913 год издания) (Silver et al., 2015). Рамон-и-Кахаль и его коллеги проводили эксперименты по трансплантации и повреждению ПНС и ЦНС. Перерезая периферический нерв, они обратили внимание на то, что окончания некоторых аксонов имели активные и пластичные структуры. Эти образования напоминали конусы роста аксонов эмбриональных клеток и были чувствительны к химическим и механическим сигналам окружающей среды. Таким образом, аксонам удавалось маневрировать между фрагментами разрушенного нерва и прокладывать себе путь к мишени. В результате, связь в рассеченном нерве восстанавливалась. Рамон-и-Кахаль предположил, что в клетках ПНС, расположенных вдоль аксонов периферического нерва (шванновских клетках), есть нечто, что направляет аксоны. В 1892 году он сформулировал теорию хемотаксиса, согласно которой "амебоподобная" часть аксона (конус роста) ориентируется в зависимости от аттрактивных и нейротрофических стимулов. Трансплантируя фрагмент мертвого периферического нерва в поврежденный седалищный нерв, Рамон-и-Кахаль установил, что прорастания аксонов не происходит, т.к. погибшие шванновские клетки не в состоянии стимулировать регенерацию. Также он изучал регенерацию зрительного нерва. Вместе с коллегами (Телло, Леоц, Аркуат) ему удалось показать, что пересеченный зрительный нерв не регенерирует, аксоны не могут преодолеть рубец, который образуется в области повреждения. Однако при имплантации периферического нерва в зрительный, аксоны последнего восстанавливали способности к регенерации и прорастали в подсаженный периферический нерв. Рамон-и-Кахаль с коллегами изучал регенерацию и в головном мозге. Ему удалось обнаружить, что периферический нерв, трансплантированный в неокортекс, является привлекательным субстратом для волокон мозолистого тела реципиента. В то время как, в поврежденном мозге без трансплантации регенерация не наблюдалась. Он связывал проблемы регенерации в ЦНС с недостатком веществ, которые бы стимулировали, привлекали, направляли, и поддерживали аксоны (Lobato, 2008). Таким образом, результаты работ того времени показали, что периферические нервы являются отличным субстратом для стимуляции роста поврежденных аксонов, как ЦНС, так и ПНС (Silver et al., 2015).
В 1980-ых годах Агуайо выполнил работы по пересадке периферического нерва в ЦНС, ставшие впоследствии классическими (Friedman, Aguayo, 1985; Vidal-Sanz et al., 1991). Агуайо показал, что аксоны клеток ЦНС способны к росту, находясь в микроокружении ПНС. Так, в одной из работ Агуайо соединил с помощью "мостика" из периферического нерва грудной отдел спинного мозга с продолговатым мозгом крысы. Используя красители, маркирующие аксоны, удалось установить, что спустя 25 недель после операции отростки клеток ЦНС росли по "мостику" из периферического нерва. Однако когда они вновь попадали в микроокружение ЦНС, рост прекращался (David, Aguayo, 1981). Более того, в другой работе проксимальную часть перерезанного зрительного нерва соединили «мостиком» из периферического нерва с верхним четверохолмие мозга. Электрофизиологические исследования показали, что при предъявлении светового стимула глазу, регистрируется возбуждающий и тормозный постсинаптичский потенциал в области четверохолмия (Keirstead et al.,1989). Эти эксперименты наглядно демонстрирует разницу между микроокружением ЦНС и ПНС. Чем могут объясняться такие большие различия в способностях к регенерации в ЦНС и ПНС?
Известно, что после травмы периферического нерва, дистальная часть аксона, "отрезанная" от клеточного тела проходит Валлерову дегенерацию (Рис. 1). Это активный процесс, который заключается в фрагментации и распаде аксона (Huebner, Strittmatter, 2009). Образуется значительное число дебриса, от которого необходимо быстро избавиться. В этом активное участие принимают не только макрофаги (клетки, обладающие макрофагальной активностью: микроглия и периваскулярные макрофаги), но и шванновские клетки (Perry, Teeling, 2013). Шванновские клетки помогают избавиться от дебриса следующими путями: разрушают свой миелин, фагоцитируют внеклеточный миелиновый дебрис, презентируют миелин макрофагам и привлекают их с помощью хемокинов и цитокинов. Процесс очистки от дебриса в ПНС занимает 7-14 дней. Шванновские клетки начинают пролиферировать и в результате образуют трубку, по которой затем пройдет регенерирующий аксон. Шванновские клетки начинают экспрессировать множество нейротрофинов: фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF), нейротрофический фактор мозга (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), фактор роста из клеток глии (glial cell line-derived, GDNF), цилиарный нейротрофический фактор (cilliary neurotrophic factor, CNTF), лейкемический ингибиторный фактор (leukemia inhibitory factor, LIF), фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor, FGF), что в свою очередь создает благоприятные условия для регенерации (Vargas, Barres, 2007). В результате, в проксимальной части аксона активируется регенерация, и он заново иннервирует свои мишени (Huebner, Strittmatter, 2009)
Иммуногистохимическое маркирование
Не стадии Э14,5 в неокортексе идет процесс генерации нейронов V, IV слоя коры, ткань представлена пролиферирующими клетками радиальной глии, нейробластами, а также мигрирующими незрелыми нейронами. Начинаются процессы дифференцировки клеток и образования связей.
Анализ срезов головного мозга мышей с трансплантированной тканью неокортекса Э14.5 показал следующее.
Через 7 суток после трансплантации неокортекса Э14,5, используя окраску крезилвиолетом, удалось выявить значительное число лимфоцитов вокруг тканевых и суспензионных трансплантатов. В тканевых трансплантатах наблюдались полости. Клетки самих трансплантатов располагались достаточно плотно и образовывали группы, имели несколько ядрышек в ядре и начинали формировать отростки. Наблюдались отдельные крупные клетки (18-20 мкм) и большое число клеток среднего размера (8-12мкм) (Рис. 25. А-Г). Клетки трансплантатов, как правило, имели морфологию недифференцированных клеток (Рис.26. В). В случае трансплантации цельного фрагмента, в верхней части стриатума (под мозолистым телом) наблюдался плотный тяж из мигрирующих клеток (Рис.26. А,Б). Единичные мигрирующие клетки суспензионного трансплантата наблюдались у желудочка мозга реципиента (Рис.26. Г).
В тканевом трансплантате в областях с большей плотностью клеток присутствовало значительное число глиальных клеток, в отличие от областей с рыхло расположенными клетками (Рис.27.А-В). Практически все глиальные клетки принадлежали донору, что выявляется по двойной окраске. Такое распределение глиальных клеток в трансплантате можно связать с тем, что в процессе трансплантации фрагмент деформируется. Нельзя исключить, что околожелудочковая зона с клетками радиальной глии (где наибольшая плотность клеток) занимает случайное положение. Возможно, что повреждение клеток радиальной глии (нарушения апикально-базальных контактов) стимулирует их дифференцировку в астроциты. Подобно тому, что наблюдается при нормальном развитии, когда радиальная глия втягивает отростки и дифференцируется в астроциты. Интересно, что астроциты трансплантата охватывают капилляры так же, как в норме (Рис.27. Г-Е). Возможно, что они участвуют в формировании ГЭБ. В суспензионных трансплантатах также отдельные клетки дифференцируются в глиальном направлении, о чем свидетельствует совпадение окрасок GFP и GFAP (Рис.27. Ж-И). Клеток экспрессирующих NeuN не было ни среди тканевых, ни среди суспензионных трансплантатов. Клетки тканевых и суспензионных трансплантатов были положительны к маркеру мигрирующих нейробластов - даблкортину (Рис.28.А-И). Интересно, что при трансплантации фрагмента неокортекса, клетки, которые непосредственно находятся в мозолистом теле не синтезируют DCX (Рис.28.Г-Е).
Клетки, находящиеся в скоплениях активно пролиферировали (Рис.29. А, В). Также наблюдались клетки на стадии митоза и пролиферирующие клетки реципиента (Рис.29.Б). Помимо пролиферации клеток в трансплантате, была обнаружена умеренная пролиферация клеток в субвентрикулярной зоне в случае трансплантации суспензии, в случае трансплантации фрагмента удалось обнаружить единичные клетки в ростральном миграционном пути.
Трансплантированная ткань вызывала умеренную глиальную реакцию реципиента, глиальный рубец не образовывался (Рис.29. А, Б). Использование антител против TH позволило выявить врастание тиразингидроксилазных волокон реципиента в трансплантат (Рис.30. А,Б). В стриатуме плотность врастания волокон в трансплантат была невысокая. В части трансплантата, находящейся в неокортексе были обнаружены лишь отдельные TH волокна. Среди клеток донора в трансплантате были обнаружены единичные клетки детектируемые антителами против тирозингидроксилазы (Рис.30. В,Г). В случае трансплантации суспензии также наблюдались отдельные врастающие TH положительные волокна реципиента в краевых зонах трансплантата.
С помощью антител против GFP удалось обнаружить отростки клеток донора в мозге реципиента. Уже через 7 суток наблюдалась плотная сеть отростков, идущая от тканевого трансплантата. Наибольшая плотность отростков была в дорсальной области стриатума (Рис.31. А). Отдельные волокна распространялись также и по I, V-VI слоям неокортекса (Рис.31. Б). В ростральном направлении они распространялись на 1 мм, а в каудальном и 500 мкм. Интересно, что единичные волокна наблюдались в капсуле интерна (внутренняя капсула, internal capsule) (Рис.31.В). От клеток суспензионных трансплантатов распространялись только единичные отростки по волоконным трактам стриатума и в капсуле интерна (Рис.31. Г).
Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 30-е сутки
Через 60 суток после операции трансплантат фрагмента неокортекса Э14,5 был обнаружен в желудочке. В случае трансплантации суспензии часть также была обнаружена в желудочке. Анализ препаратов окрашенных крезилвиолетом показал, что в случае тканевого трансплантата, клетки располагаются равномерно на расстоянии друг от друга (Рис.36. А,В). Однако в случае суспензионного трансплантата выявлялась слоистая структура: в центре практически не было клеток, затем были слои нейронов, на периферии находились отдельные глиальные клетки (Рис.37. В, Г). С помощью флуоресцентной микроскопии в тканевом трансплантате были обнаружены клетки, напоминающие пирамидные, однако в основном клетки не были различимы из-за сильного фонового свечения, характерного для взрослого мозга (Рис.38 А,Б). Наблюдалась миграция клеток под мозолистым телом от суспензионных трансплантатов. Также была выявлена мигрировавшая в стриатум клетка, имеющая морфологию интернейрона (Рис.38. В-Г).
В тканевых и суспензионных трансплантатах выявлялись клетки, дифференцированные в нейрональном и глиальном направлениях (Рис.39. А, Б, Г, Д). Астроциты реципиента проникали в часть трансплантата, которая находилась в желудочке (Рис.39. А). Интересно, что клетки в краевой области части трансплантата, которая находится в желудочке дифференцировалась в астроциты, тем самым отгораживая нейроны (Рис.39. В). Глиального рубца не наблюдалось (Рис.39. Б). В случае трансплантации суспензии наблюдалась значительная пролиферация в субвентрикулярной зоне реципиента (СВЗ). Более того в СВЗ реципиента обнаруживались DCX+ клетки, однако DCX+ клеток в трансплантате не было (Рис.39. Е). Пролиферация самих клеток трансплантата, также как и через 30 суток отсутствовала.
От тканевого трансплантата, который располагался в желудочке, отходили отростки клеток и образовывали сеть в своде мозга (fornix) реципиента (Рис.40. А). Отростки клеток суспензионного трансплантата образовывали плотную сеть в стриатуме и I слое неокортекса реципиента, наибольшая плотность достигалась в верхней области стриатума (под мозолистым телом) (Рис.40. Б). Единичные отростки распространялись от трансплантата по VI слою неокортекса реципиента на 600 мкм в каудальном направлении и до начала фронтальной коры в ростральном направлении. Тирозингидроксилазные волокна реципиента проникали в суспензионный трансплантат (Рис.34. В). А »ш " ч
Тканевые (А, В) и суспензионные (Б, Г) трансплантаты неокортекса Э14,5 через 60 дней после операции. Окраска крезилвиолетом. А, В – тканевый трансплантат разрастается в желудочке мозга, клетки находятся на расстоянии друг от друга (красные треугольники). В трансплантате обнаруживаются сосуды (красная стрелка). Б, Г – слоистая организация клеток в части суспензионного трансплантата, которая находится в желудочке (красные треугольники). Т – трансплантат. Масштабный отрезок: А, Б – 300 мкм, В – 20 мкм, Г – 100 мкм.
Примеры морфологии и миграции клеток тканевых (А, Б) и суспензионных (В, Г) трансплантатов неокортекса Э14,5 через 60 суток после операции. А, Б – тканевый трансплантат имеет гомогенное свечение, однако можно видеть отдельные клетки, напоминающие пирамидные. В – суспензионный трансплантат, расположенный в стриатуме и желудочке (звездочка). Г – мигрирующая в стриатум клетка суспензионного трансплантата с морфологией интернейрона. Т – трансплантат. Масштабный отрезок: А, В – 300 мкм, Б, Г – 20 мкм. Глиальная (А-Е) и нейрональная (Ж-И) дифференцировка тканевых и суспензионных трансплантатов неокортекса Э14,5 через 60 суток после операции. А-Е – положительная иммунохимическая реакция к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) в тканевых (А-В) и суспензионных (Г-Е) трансплантатах. Белыми стрелками отмечены GFAP положительные клетки донора, синими стрелками отмечены GFAP положительные клетки реципиента, проникшие в трансплантат. Ж-М – положительная иммуногистохимическая реакция к маркеру зрелых нейронов NeuN клеток тканевых (Ж-И) и суспензионных (К-М) трансплантатов. Т – трансплантат. Масштабный отрезок: А-В, Ж-М – 20 мкм, Г-Е – 50 мкм. Таким образом, трансплантированные клетки неокортекса Э14 через 60 суток после операции дифференцировались в нейрональном и глиальном направлениях. Ткань, обнаруженная в желудочке, формировала структуры, схожие по строению с неокортексом.
Рис.39. Реципрокный рост отростков клеток тканевых и суспензионных трансплантатов неокортекса Э14,5 через 60 суток после операции. А-В – тирозингидроксилаза-иммунопозитивные (TH) волокна реципиента врастают в суспензионный трансплантат (отмечены белыми треугольниками). Г – отростки клеток тканевого трансплантата в своде мозга (fornix) реципиента (белые треугольники). Д – сеть отростков клеток суспензионного трансплантата в верхних слоях неокортекса реципиента. Е – плотная сеть отростков клеток суспензионного трансплантата в дорсальной части стриатума реципиента и менее плотная в VI слое неокортекса. Т – трансплантат, МТ – мозолистое тело. Масштабный отрезок: А-Д– 20 мкм, Е – 50 мкм.
Не стадии Э19,5 заканчиваются процессы генерации III, II слоя неокортекса и идет процесс дифференцировки нейронов и образования связей. Клетки радиальной глии перестают продуцировать нейроны, и начинается глиогенез.
Анализ срезов головного мозга мышей с трансплантированной тканью неокортекса Э19.5 показал следующее. 3.1. Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 7-е сутки
Через 7 суток после операции видно, что суспензионные трансплантаты неокортекса Э19,5 значительно меньше по размерам, чем тканевые и суспензионные трансплантаты других сроков. Окраска крезилвиолетом тканевых трансплантатов выявила наличие небольшого числа лимфоцитов в трансплантате и в ткани реципиента, тем не менее, в трансплантатах наблюдались полости (Рис.40. А, В). Клетки трансплантата были расположены группами на расстоянии друг от друга. Клетки имели размер 10-15мкм, в ядре содержалось несколько ядрышек. Наблюдался ободок базофильной цитоплазмы вокруг ядра. Окраска крезилвиолетом суспензионных трансплантатов показала следующее: в трансплантатах выявлялось множество лимфоцитов, клетки трансплантата располагались одиночно на расстоянии друг от друга (Рис.40 Б, Г). Морфологически клетки трансплантатов данного срока имели округлое тело и длинным отростком, также можно было обнаружить астроцитоподобные клетки (Рис.41. А, Б). По флуоресценции GFP удалось выявить редкие мигрирующие от трансплантата клетки. Миграция наблюдалась как в паренхиму, так и по сосудам. Клетки суспензионных трансплантатов находились в коре и не имели четкую морфологию, дальней миграции не наблюдалось (Рис.41.).
Морфологическая характеристика, дифференцировка и интегративные взаимодействия клеток трансплантатов в интактном взрослом мозге на 60-е сутки
В работе исследовали развитие трансплантатов эмбрионального неокортекса различных стадий дифференцировки в микроокружении взрослого мозга без предварительного повреждения. Для этого проводилась трансплантация 3D-фрагментов и суспензий клеток неокортекса эмбрионов мышей стадий Э12,5, Э14,5, Э19,5 в интактный мозг взрослого реципиента. Использование трансгенных животных, в клетках которых синтезируется GFP белок, современных методов иммуногистохимии, флуоресцентной и конфокальной микроскопии позволило визуализировать и изучить развитие индивидуальных клеток трансплантатов. Было установлено, что вне зависимости от возраста донора, трансплантированная ткань успешно интегрировалась в неповрежденный мозг взрослого реципиента. Клетки трансплантатов мигрировали, пролиферировали, дифференцировались в нейрональном и глиальном направлении, образовывали плотные сети отростков. Это было характерно и для тканевых 3D трансплантатов и для клеточных суспензий, однако, клетки суспензионных трансплантатов имели более длительный период адаптации.
В неокортексе Э12 идет активный процесс пролиферации клеток радиальной глии и нейробластов, рождаются нейроны VI слоя, после трансплантации клетки этого срока могут дифференцироваться в любые нейроны в соответствии с микроокружением в которое клетки поместили (Greig et al., 2013). На стадии Э14 многие клетки уже коммитированы, однако пролиферативная активность еще продолжается. На стадии Э19 нейрогенез уже закончен, все нейроны выходят в дифференцировку. Пик глиогенеза приходится уже на постнатальный период (Sauvageot, 2002). В данной работе было показано, что уже через 7 суток после пересадки клетки в тканевых и суспензионных трансплантатах дифференцировались в глиальном направлении, причем вне зависимости от стадии развития эмбрионов-доноров.
Известно, что в процессе развития неокортекса радиальная глия приматов экспрессирует глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), в то время как радиальная глия грызунов не экспрессирует GFAP, т.е. этот маркер является видоспецифичным (Malatesta et al., 2000). Однако GFAP экспрессируют фиброзные астроциты взрослых грызунов в норме, а после повреждения ткани GFAP начинают экспрессировать и протоплазматические астроциты. Первые транскрипты GFAP появляются у грызунов между стадиями Э9.5 и Э11,5, однако иммуногистохимически GFAP+ клетки еще длительное время не выявляются. В кортексе можно выявить GFAP+ клетки только начиная со стадии П0, т.е. в период пика глиогенеза на трансплантации. (Mamber et al., 2012). Однако в некоторых работах указывается, что редкие GFAP+ клетки можно обнаружить на стадии Э15 у крыс (Э14 у мышей), но объективно детектировать клетки можно только на поздних сроках (Abney et al., 1981). Таким образом, из настоящей работы на мышах следует, что клетки трансплантатов через 7 суток, которые экспрессируют GFAP не могут быть радиальной глией (клетки неокортекса Э12,5 через семь суток по возрасту соответствуют нормальному неокортексу Э19,5). Поскольку пик глиогенеза в ходе нормального развития приходится на более поздний период, то можно предположить ускорение глиальной дифференцировки. GFAP+\GFP+ клетки обнаруживались и через 30 и 60 суток, но это не является отклонением от нормы, т.к. соотносится с нормальным развитием. С нормальным развитием соотносится и наличие GFAP+\GFP+ клеток в трансплантатах от донора стадий Э14,5 (через 7 дней это эквивалент стадии П1) и Э19,5 (через 7 дней это эквивалент стадии П6). Некоторые клетки донора приобретали морфологию астроцитов уже через 7 суток, хотя были и недифференцированные GFAP+ клетки. Трансплантированные клетки с характерной морфологией фиброзных и протоплазматических астроцитов наблюдались на более поздних сроках после
Клетки трансплантатов дифференцировались как в глиальном, так и нейрональном направлении. Удалось обнаружить DCX+\GFP+ клетки, это говорит о том, что среди клеток трансплантата есть незрелые нейроны. Пересаженные клетки экспрессировали даблкортин (DCX) через 7 дней после трансплантации вне зависимости от типа и стадии развития ткани донора, однако через 30 суток экспрессии DCX не наблюдали. Известно, что даблкортин играет ключевую роль в процессах миграции нейрональных клеток развивающейся нервной ткани (Kunze et al., 2015). Интересен случай (тканевый трансплантат от Э14,5 через 7 суток после операции), в котором экспрессия даблкортина была в части трансплантата, которая находилась в стриатуме, но ее не было в части, которая находилась в мозолистом теле. Можно предположить, что мозолистое тело, являясь миелинизированным волоконным трактом, подавляет нейрональную дифференцировку, поскольку известно, что миелин является ингибитором роста аксонов и регенерации в ЦНС (Huebner, Strittmatter, 2009).
Важно, что NeuN+\GFP+ клетки обнаруживались в тканевых и суспензионных трансплантатах неокортекса Э12,5 и Э14,5 не через 7 суток, а через 30 дней после трансплантации. Можно предположить, что при трансплантации ткани от эмбрионов раннего срока развития происходит торможение нейрональной дифференцировки и ускорение глиальной. Переход от нейрогенной дифференцировки в глиогенную очень тонкий и связан с процессом деметилирования глиальных генов (Miyata et al., 2010;Kanski et al., 2014). Возможно, что влияние микроокружения взрослого мозга, а также стресс клеток во время самой процедуры трансплантации затрагивает подобные молекулярные процессы.
Наличие NeuN+ клеток связано не только с возрастом ткани и процессом дифференцировки, но и состоянием ткани. Даже через 30 и 60 суток после трансплантации экспрессия может быть в той или иной степени подавлена, особенно в суспензионных трансплантатах. Трансплантированная ткань Э19,5 через 7 дней также не экспрессирует NeuN. Стоит подчеркнуть, что эмбрион стадии Э19,5 уже содержит NeuN положительные клетки. Такое подавление экспрессии может быть следствием повреждения клеток в процессе приготовления суспензии, поскольку известно, что при травме ткани мозга экспрессия NeuN падает и выявить иммуногистохимически нервные клетки практически невозможно (Cannon, Greenamyre, 2009; Blaya et al., 2015). Причем отсутствие NeuN+ клеток не всегда является следствием того, что нейроны погибают или клетки не являются зрелыми нейронами, но является следствием того, что клетки находятся в стрессе (Unal-Cevik et al., 2004).
Однако в работе Пражеровой дифференцировка клеток происходила иначе. В этой работе в интактный и поврежденный взрослый мозг трансплантировали суспензию кортикальных прогениторов, которые были получены после культивирования клеток эмбриона мыши стадии Э12. Через неделю и в интактном и поврежденном мозге пересаженные клетки экспрессировали маркеры незрелых нейронов - DCX, BIIIub, а также зрелых нейронов - Map-2, NeuN, нейрофиламенты. Однако клеток экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый практически не было. При этом в культуре GFAP+ клетки отмечались (Prajerova et al., 2010). Некоторые авторы полагают, что в области повреждения присутствуют сигналы, которые направляют дифференцировку трансплантированных клеток более в нейрональное направление, чем глиальное (Darsalia et al. 2007; Prajerova et al., 2010). Более того, в некоторых работах указывается на то, что зрелые астроциты могут репрограммироваться после повреждения и становиться нейрональными прогениторами (Feng et al., 2014). В работе по трансплантации клеток ганглионарного бугорка (стадия Э13), синтезирующих GFP белок, в моторный кортекс неонатальных мышей, также обнаруживается, что через 6 недель большая часть клеток была NeuN+\GFP+, при этом GFAP+\GFP+ клеток практически не было, т.е. основная масса клеток дифференцировалась в нейроны, а не глию (Tanaka et al., 2011). С другой стороны, в аналогичных работах по трансплантации суспензии фронтального неокортекса крыс стадии Э15 в интактный и поврежденный взрослый мозг показано, что при трансплантации в интактный мозг клетки хуже выживали и в основном оставались недифференцированными (несмотря на то, что иммуногистохимическое исследование проводили через 5 недель после трансплантации). Некоторые из клеток экспрессировали GFAP и имели неоформленную морфологию. При этом они также не экспрессировали маркеры зрелых астроцитов (ALDH1L1), олигодендроцитов (olig2), реактивной микроглии (Iba1). Клеток, экспрессирующих маркер зрелых нейронов NeuN, было также мало. Однако среди клеток, пересаженных в поврежденный мозг, было значительно больше NeuN+ клеток (Blaya et al., 2015).