• Роль циркулирующих в крови опухолевых клеток и опухолевой ДНК для оценки гетерогенности и клональной эволюции рака толстой кишки
• Адъювантная химиотерапия при раке ободочной кишки
• Влияние поддержания дозовой интенсивности иринотекан и оксалиплатин содержащих режимов химиотерапии на выживаемость больных метастатическимраком толстой кишки
• Клиническая эффективность противоопухолевого лечения в популяции больных метастатическим раком толстой кишки в рутинной клинической практике

Роль циркулирующих в крови опухолевых клеток и опухолевой ДНК для оценки гетерогенности и клональной эволюции рака толстой кишки

Как видно из таблицы 1, одними исследователями показано отсутствие конкордантности, другими, наоборот, выявлен высокий процент соответствия. Наибольшая дискордантность наблюдается между первичной опухолью и метастазами в лимфоузлы и циркулирующими в крови опухолевыми клетками (ЦОК) [10; 13; 16; 23; 33].

В более современных работах, исследователи сравнивают не только первичные опухоли и метастазы, но и отдельные участки в самой опухоли. Так Baldus с соавторами с помощью метода микродиссекции изучили мутационный статус генов KRAS, BRAF, PIK3CA в перферических и центральных участках первичной опухоли (n=100), в метастазах в лимфоузлы (n=55) и в метастазах в печени (n=20). При сравнении центральных отделов и фронта инвазии опухоли отмечена дискордантность по мутационному статусу генов KRAS, BRAF, PIK3CA, которая составила 8%, 1% и 5%, соответственно [10]. Еще в трех работах выявленная дискордантность по мутационному статусу в гене KRAS в различных отделах первичной опухоли была значимо выше и составляла от 35 до 47% [1; 11; 29]. Это послужило причиной рекомендации авторами забирать материал для мутационного анализа из центральных участков опухоли [29].

Наиболее крупная работа, посвящённая оценке конкордантности статуса гена KRAS при раке толстой кишки между первичной опухолью и метастазами в печени, была опубликована в 2011 году. В исследование было включено 305 пар образцов опухоли. Выявлен высокий процент конкордантности по мутационному статусу гена KRAS — 96,4% [12]. Авторы исследования объясняют такое высокое соответствие мутационного статуса между первичной опухолью и метастазами большим количеством больных, включенных в анализ (n=305), однородностью локализации метастатических очагов (только печень), исследовался только один ген (KRAS). Тогда как в других работах, по их мнению, недостаточно было мощности для исключения ложно негативных результатов (n=10-110) (таблица 1). Кроме этого метастазы локализовались в различных органах.

Случаи расхождения в статусе гена авторы разных работ объясняют тем, что процесс метастазирования шел раньше приобретения тех или иных мутаций в клетках первичной опухоли. Другим объяснением может служить гетерогенность опухоли по статусу гена KRAS. Также можно спекулировать на тему не выявленных вторых первичных опухолей в толстой кишке, как источника метастазов с другим мутационным статусом гена. Следует учитывать и метод детекции мутаций в гене KRAS. Так, например, при сравнении трех методов — cobas kras Mutation Test kit, Therascreen kras PCR kit и секвенирование по Сенгеру — только первый показывал высокую чувствительность к выявлению мутантных аллелей гена KRAS [30]. Применение наиболее чувствительных методов чаще приводит к выявлению полного соответствия по мутационному статусу первичной опухоли метастазам рака толстой кишки [8]. Однако встает вопрос о клинической релевантности низкого уровня мутантных аллелей, выявляемых высокочувствительными методами, в отношении эффективности анти-EGFR моноклональных антител. Так как, например, в работе Tougeron с соавторами, частота объективного эффекта комбинации анти-EGFR антител с химиотерапией составила 37% при диком типе гена KRAS против 6,7%, в случаях, когда выявлялся незначительный процент ( 10%) мутантных аллелей данного гена [31]. Нельзя исключать банальные ложноположительные и ложно-негативные результаты тестов [32].

Что касается мутаций в гене BRAF, то заслуживают внимания результаты Швейцарского исследования. Было изучено 100 гистологических образцов первичной опухоли и метастазов от 13 больных. Оценили экспрессию белка VE1, являющейся отражением наличия в опухолевой клетке мутации в гене BRAF (V600E), а также и наличие самой мутации BRAF в 123 различных участках опухоли. У 4 пациентов в первичной опухоли была выявлена мутация, при этом никакой гетерогенности в отношении данной мутации в различных участках и метастазах опухоли получено не было [34]. С мутацией в гене BRAF также ассоциирована и экспрессия транскрипционного фактора SOX2, который участвует в поддержании стволовых свойств опухолевых клеток. При изучении конкордантности экспрессии SOX2 в первичной опухоли и метастазах рака толстой кишки выявлено, что позитивные по SOX2 опухоли сохраняют высокую экспрессию SOX2 и в метастазах [35].

Такая высокая конкордантность по изменению в гене BRAF между клетками первичной опухоли и метастазов раках толстой кишки исследователями объясняется тем, что мутация в данном гене носит характер драйверной и является ранним событием в одном из вариантов канцерогенеза злокачественных опухолей толстой кишки, развивающихся из так называемых зубчатых полипов [36].

Внутриопухолевая гетерогенность проявляется не только по различию в мутационном статусе, но и по экспрессии неизмененных генов. Так при иммуногистохимическом исследовании (ИГХ) 6 белков (MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B и MUC6) в клетках по периферии и в центре первичной опухоли и метастазов рака толстой кишки в печени, полученных от 11 больных, исследователи выявили, что если экспрессия MUC1 и MUC2 не различалась между первичной опухолью и метастазами, то для экспрессии оставшихся белков была характерна выраженная внутриопухолевая гетерогенность как между очагами, так и внутри первичной опухоли. У 36% больных выявлена зональная экспрессия муцина в опухоли. Чаще отмечалось снижение экспрессии муцина в клетках метастазов, что может свидетельствовать о снижении степени дифференцировки [37]. В другом исследовании данные находки в отношении зональности экспрессии муцина в опухоли не были выявлены, что, возможно, объясняется недостаточным количеством опухолевых блоков, вошедших в анализ от одного больного [38]. Также отмечено, что клетки метастазов рака толстой кишки в лимфоузлы чаще показывают диффузную экспрессию р53, а клетки первичной опухоли — c-myc [39].

Как видно из таблицы 1, при изучении конкордантности между первичной опухолью толстой кишки и метастазами в 80-100% случаях отмечается совпадение мутационного статуса генов KRAS, BRAF. Это же подтверждает и метаанализ исследований, опубликованный в 2012 году, включивший результаты 19 работ, посвященных изучению конкордантности мутационного статуса гена KRAS, которая составила 94,1% в отношении всех метастазов и 81,3% в отношении метастазов в лимфоузлы [40]. В 2015 году опубликован аналогичный метаанализ уже 46 исследований, показавший общую конкордантность по мутации гена KRAS — 92% (73,4% — при метастазах в лимфоузлы), BRAF — 96,8%, по мутации PIK3CA — 93,9% [41]. Однако в большинстве исследований, включенных в метаанализы, сравнивалась первичная опухоль с синхронно возникающими метастазами. Также не учитывалось возможное влияние характера системной терапии на эволюционный отбор резистентных клонов. Это подчеркивает необходимость проведения дополнительных исследований.

В итоге, если мы принимаем, что опухоль изначально гетерогенна по различным мутационным изменениям, то и процесс прогрессирования заболевания следует рассматривать не как последовательный, а как параллельное развитие первичной опухоли и метастазов. Это подтверждается наличием различий в мутационном статусе генов между первичной опухолью и метастазами. То есть, для развития метастазов не требуется тот же набор мутационных изменений, который требуется для роста первичной опухоли [42].

Адъювантная химиотерапия при раке ободочной кишки

Роль микросателлитной нестабильности при раннем раке толстой кишки Канцерогенез рака толстой кишки характеризуется накоплением мутаций в генах, контролирующих рост и дифференцировку эпителиальных клеток, что приводит к их генетической нестабильности. Описано два независимых патогенетических пути развития генетической нестабильности. Первый путь выявлен в большинстве злокачественных опухолей и называется хромосомной нестабильностью, которая проявляется хромосомными амплификациями, трансформациями, анеуплоидией и потерей гетерозиготности. Опухоли, развивающиеся вследствие активации второго пути, характеризуются нарушением механизма репарации неспаренных оснований ДНК. Это приводит к тому, что мутации накапливаются со значительно большей скоростью в геноме клетки, чем в нормальном состоянии [189].

Система репарации неспаренных оснований ДНК (mismatch repair system — MMR) ответственна за распознавание и удаление неправильно спаренных оснований, образованных в результате ошибок в процессе репликации ДНК. На первом этапе белковый комплекс MSH распознает неправильно спаренные основания, что инициирует присоединение к комплексу белков MLH1/PMS2 и MLH1/MLH3. Они в свою очередь привлекают к участию в процессе устранения ошибок экзо- и эндонуклеазы, осуществляющие удаление измененного участка ДНК. В дальнейшем рекрутируются факторы репликации, которые восстанавливают нуклеотидную последовательность цепи ДНК. Нарушения в системе репарации неспаренных оснований ДНК приводят к образованию мутаций со сдвигом рамки считывания, что характеризуется ранним появлением стоп-кодона и инактивацией гена [189].

За работу системы репарации неспаренных оснований ДНК отвечают 6 генов: MSH2, MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 и MLH3. Наличие герминальных мутаций в этих генах приводит к развитию синдрома наследственного неполипозного колоректального рака (HNPCC) (синдрома Линча). Частота наследственных мутаций в генах системы репарации составляет 2-4% среди больных раком толстой кишки, однако более 15% всех пациентов имеют высокий уровень микросателлитной нестабильности в опухолях [189-192].

Генетическим биомаркером описанных нарушений репаративной системы является микросателлитная нестабильность. Микросателлитные повторы ДНК — полиморфные последовательности ДНК, длиной в 1-5 пар оснований, которые могут повторяться 15-30 раз, и распределены по всему геному. Длина таких повторов при раке толстой кишки различается между опухолевыми клетками и нормальными клетками толстой кишки у одного и того же пациента [190]. В настоящее время для определения уровня микросателлитной нестабильности наиболее часто применяются следующие методы: полимеразная цепная реакции и иммуногистохимический метод.

Полимеразная цепная реакция амплифицирует микросателлитные повторы в ДНК, и путем сравнения длины микросателлитных повторов между опухолевыми и нормальными клетками может быть определен уровень нестабильности генома. Применяемая референсная модель в 5-10 микросателлитов позволяет выделить 3 варианта микросателлитной нестабильности (MSI): MSI-Н — высокий уровень — 30% используемых маркеров нестабильны; MSI-L — нестабильны 10-30% маркеров; MSS — микросателлитная стабильность [191]. Альтернативой может служить иммуногистохимический метод — определяется уровень белков системы репарации неспаренных оснований ДНК. В случае дефицита белков данной репаративной системы диагностируется микросателлитная нестабильность [192].

Пациенты с опухолями с MSI-H имеют отличающие их фенотипические характеристики: проксимальная локализация первичной опухоли, низкая дифференцировка, муцинозный гистологический тип, выраженная лимфоцитарная инфильтрация опухоли, большая частота диплоидий и редкость потери гетерозиготности длинного плеча 18 хромосомы [193]. И хотя данный фенотип подтвержден не во всех исследованиях [194; 195], тем не менее, данные признаки могут быть полезны в качестве диагностических маркеров.

Выявлены и молекулярные особенности опухолей с микросателлитной нестабильностью. По неясным пока причинам, мутации гена BRAF часто (до 50%) обнаруживается в спорадических опухолях толстой кишки с MSI-H. Тогда как в опухолях у больных с синдромом Линча, для которого свойственна микросателлитная нестабильность, мутации в гене BRAF не описаны [196].

В настоящее время определение функции системы репарации неспаренных оснований ДНК рекомендовано NCCN (National Comprehensive Cancer Network) в США у всех пациентов с впервые диагностированным раком толстой кишки или при отягощенном семейном анамнезе для исключения синдрома Линча (рекомендации NCCN версия 2.2017).

Следует отметить, что опухоли с MSI-H и опухоли с MSS имеют различный прогноз течения болезни и, возможно, обладают различной чувствительностью к химиотерапии [197]. При II стадии рака толстой кишки микросателлитная нестабильность выявляется в 22% случаях, III стадии — в 12%, IV — в 2% случаях [198]. Эти данные доказывают, что опухоли с MSI-H не склонны к метастазированию и имеют благоприятный прогноз. Так же в большинстве ретроспективных исследований высокий уровень микросателлитной нестабильности ассоциирован с более высокими показателями выживаемости при раке толстой кишки [199]. Эти находки были подтверждены результатами мета-анализа 32 исследований, доказавших прогностическое значение уровня микросателлитной нестабильности у 7642 больных [200]. С другой стороны, используя многофакторный анализ признаков, влияющих на риск развития рецидива, в исследовании QUASAR было показано, только отсутствие микросателлитной нестабильности и показатель Т4 имели независимое негативное прогностическое значение [201].

Влияние поддержания дозовой интенсивности иринотекан и оксалиплатин содержащих режимов химиотерапии на выживаемость больных метастатическимраком толстой кишки

При этом данный фактор (индекс массы тела) подтвердил свое независимое влияние на выживаемость при многофакторном анализе в отношении безрецидивной выживаемости (ОР 0,48, 95% ДИ 0,32-0,71, р 0,01), но не в отношении общей выживаемости (таблицы 30, 31).

Следует отметить и влияние уровня РЭА и СА19-9 до операции на выживаемость. Несмотря на то, что показатели данных онкомаркеров были определены лишь у 27,9% и 24,7% больных, соответственно, удалось выявить, что только нормальные значения РЭА (менее 5 нг/мл) значимо ассоциированы с улучшением показателей безрецидивной и общей выживаемости (рисунки 36, 37). При этом уровень РЭА обладал независимым влиянием на показатели выживаемости при многофакторном анализе: ОР 0,47, 95% ДИ 0,23-0,99, р=0,04 для безрецидивной выживаемости и ОР 0,42, 95% ДИ 0,2-0,88, р=0,02 для общей выживаемости.

При анализе влияния на выживаемость таких биохимических параметров, как уровень общего белка, альбумина, креатинина, билирубина, трансаминаз печени, щелочной фосфатазы, ни один из перечисленных признаков не обладал независимым влиянием по данным многофакторного анализа ни на безрецидивную, ни на общую выживаемость. В тоже время уровень гемоглобина до операции более 115 г/л был ассоциирован с независимым благоприятным влиянием на общую (ОР 0,63, 95%ДИ 0,47-0,85, р 0,01), но не на безрецидивную выживаемость (рисунки 38, 39).

Нами также изучено влияние различных маркеров воспаления на выживаемость пациентов. С помощь ROC-кривых определили пороговые значения параметрических показателей в отношении предсказания развития прогрессирования и смерти. Для лейкоцитов таким значением явился уровень 9000 клеток в 1 мкл, для нейтрофилов — 5 500 клеток в 1 мкл, для нейтрофильно-лимфоцитарного отношения — показатель 2,18. Однако при многофакторном анализе значимое влияние на выживаемость данных параметров не было подтверждено (таблицы 30, 31).

Анализ влияния различных факторов, отражающих особенности

хирургического лечения на выживаемость больных ранними стадиями рака толстой кишки подтвердил, что операция на фоне непроходимости ассоциирована с низкими показателями безрецидивной и общей выживаемости (рисунки 40, 42): ОР 1,9, 95% ДИ 1,0-3,79, р=0,05 для безрецидивной выживаемости и ОР 2,0, 95% ДИ 0,93-4,26, р=0,07 для общей выживаемости.

Аналогично и резекция смежных органов была ассоциирована с низкими показателями безрецидивной и общей выживаемости (рисунки 41, 43): ОР 1,8, 95% ДИ 1,3-2,51, р 0,01 для безрецидивной выживаемости и ОР 1,6, 95% ДИ 1,1-2,4, р=0,02 для общей выживаемости.

При многофакторном анализе выполнение операции на фоне непроходимости утратило свое прогностическое значение, а резекция смежных органов во время операции оказывала независимое негативное влияние на безрецидивную выживаемость (ОР 1,72, 95% ДИ 1,04-2,85, р=0,04), но не общую выживаемость по данным многофакторного анализа (таблицы 30, 31). Находкой оказалось влияние развития послеоперационных осложнений как негативного прогностического фактора как в отношении безрецидивной (ОР 1,6, 95% ДИ 1,14-2,45), р 0,01), так и общей выживаемости (ОР 1,8, 95% ДИ 1,24-2,66, р 0,01). Но так как это являлось следствием распространения болезни, сопутствующей резекции смежных органов, то при многофакторном анализе данный признак уже не оказывал значимого влияния на выживаемость пациентов (таблицы 30, 31).

Проведен анализ влияния на выживаемость еще одного признака, отражающего с одной стороны квалификацию хирурга, с другой — опыт морфолога — число удаленных (или изученных) лимфатических узлов в операционном материале. Выявлено, что в отношении безрецидивной выживаемости удаление/изучение менее 10 лимфоузлов в операционном материале является независимым негативным прогностическим фактором: ОР 0,53, 95% ДИ 0,34-0,83, р 0,01 (рисунок 44, таблица 30). В отношении общей выживаемости независимого влияния данного параметра по результатам многофакторного анализа подтвердить не удалось (рисунок 45, таблица 31).

Важным в прогностическом отношении является состояние лимфатических узлов. При многофакторном анализе, наличие любых неопухолевых изменений («реактивные изменения в лимфоузлах», синусгистиоцитоз, липоматоз, гиперплазия фолликулов) не обладало независимым прогностическим влиянием (таблицы 30, 31).

Выраженным независимым негативным влиянием как на безрецидивную, так и общую выживаемость обладал фактор наличия метастазов в лимфоузлах: ОР 1,98, 95% ДИ 1,54-2,56, р 0,01, и ОР 2,04, 95% ДИ 1,64-2,53, р 0,01, соответственно (рисунки 46, 47; таблицы 30, 31). При этом поражение 4 и более лимфоузлов метастазами предполагало прогрессирование болезни у 50% больных в течение первых двух лет наблюдения.

Также и степень инвазии опухоли стенки кишки (индекс T4) оказывала самостоятельное (независимо от показателя pN) влияние на безрецидивную выживаемость и общую выживаемость: ОР 1,43, 95% ДИ 1,06-1,95, р=0,02 и ОР 1,28, 95% ДИ 0,99-1,66, р=0,06, соответственно (рисунки 48, 49).

Влияние степени инвазии опухоли стенки кишки (pT) на общую выживаемость Из всех морфологических характеристик опухоли, включая инфильтрацию нейтрофилами и/или лимфоцитами опухоли, периваскулярный или периневральный рост образования, наличие некрозов, муцинозного компонента, компонентов перстневидно-клеточного или нейроэндокринного рака, степени дифференцировки опухоли, только наличие инвазии в кровеносные или лимфатические сосуды оказывало независимое негативное влияние на безрецидивную выживаемость (ОР 1,89, 95% ДИ 1,08-3,3, р=0,03), но не на общую выживаемость (таблицы 30, 31).

Хотелось также подчеркнуть независимое влияние и сроков лечения (до 2007 года и после 2007 года) на общую выживаемость. Среди пациентов, получавших лечение в 2007 году и позже, реже развивалось прогрессирование болезни, и они жили значимо дольше независимо от характеристик болезни (рисунки 50, 51; таблицы 30, 31).

Клиническая эффективность противоопухолевого лечения в популяции больных метастатическим раком толстой кишки в рутинной клинической практике

Первым таким исследованием, было исследование GERCOR с перекрестным дизайном, в котором проводилось сравнение последовательного назначения FOLFOX, а затем FOLFIRI или наоборот. Выживаемость без прогрессирования и общая выживаемость не различались. Число операций по удалению операбельных метастазов было статистически значимо выше в группе больных, получавших FOLFOX, что, однако не привело к достоверному улучшению продолжительности жизни [266]

В 2008 году исследователи из США представили обновленные результаты рандомизированного исследования N9741. В этом исследовании сравнивали комбинацию FOLFOX с режимом IFL, где иринотекан сочетался со струйным введением 5-фторурацила и лейковорина, или IROX, совместным назначением иринотекана и оксалиплатина. Последняя комбинация оказалась токсичной, и набор больных в эту группу был прекращен. Комбинация FOLFOX продемонстрировала достоверно более высокую частоту объективных эффектов, увеличение продолжительности выживаемости без прогрессирования и общей продолжительности жизни. Такое преобладание в эффективности режима с оксалиплатином объясняется струйным введением 5-фторурацила в режиме IFL, и большим количеством больных, кто получал химиотерапию второй линии в группе FOLFOX (64% больных из группы получили иринотекан после прогрессирования болезни) по сравнению с группой IFL (оксалиплатин был назначен только 40% пациентов) [267].

В другое рандомизированное исследование, опубликованное в 2005 году итальянскими авторами, было включено 360 больных. Выживаемость без прогрессирования и продолжительности жизни не различались между схемами FOLFIRI и FOLFOX4 (р=0,28). В группе с FOLFOX4 чаще развивались тромбоцитопения и периферическая полинейропатия, а при применении FOLFIRI — диарея, аллопеция, тошнота и рвота [268].

Таким образом, проведенные исследования дали основание говорить, что инфузионные режимы 5-FU в сочетании с иринотеканом и оксалиплатином обладают равной эффективностью и могут назначаться как в первой, так и во второй линии химиотерапии. Использование струйного назначения 5-FU в сочетании с иринотеканом приводит к ухудшению результатов лечения. Анализ этих исследований позволил говорить, что лучшие показатели продолжительности жизни достигались у тех больных, кто при проведении первой-второй линий химиотерапии получали все три наиболее активных препаратов при этом заболевании, т.е. оксалиплатин и иринотекан в сочетании с инфузионным введением 5-FU. В 2004 году Grothey с соавторами представил результаты мета-анализа 11 рандомизированных исследований, в котором была показана корреляция между продолжительностью жизни и использованием всех трех препаратов, активных при раке толстой кишки (фторпиримидины, оксалиплатин, иринотекан) (коэффициент корреляции 0,85, р=0,0008). Другими словами, пациенты, которые получили все три активных препарата, живут дольше. В своей работе Grothey также обнаружил, что пациенты, которым проводилась терапия дуплетами в первой линии, имеют больше шансов получить все три активных препарата за весь курс лечения [269]. Однако в этом же метаанализе было выявлено, что только половине больных проводилась терапия всеми тремя активными препаратами. Невозможность проведения второй линии химиотерапии почти у половины больных с прогрессированием после первой линии химиотерапии с включением современных дуплетов привело исследователей к мысли о назначении трехкомпонентных схем химиотерапии, которые включали все активные компоненты, в первой линии лечения больных раком толстой кишки.

В 2009 году итальянские авторы опубликовали результаты сравнения двух схем химиотерапии — FOLFIRI и FOLFOXIRI. Как и ожидалось, лечение трехкомпонентной комбинацией сопровождалось увеличением частоты серьезной токсичности, в частности нейтропении 3-4 степени (50% против 28%), периферической полинейропатии 2-3 степени (19% против 0%) и диареи 3-4 степени (20% против 12%), однако продолжительность лечения в обеих группах была приблизительно одинакова (10 и 11 месяцев соответственно). Одновременно применение режима FOLFOXIRI сопровождалось высоким уровнем объективного ответа, по сравнению с режимом FOLFIRI (60 против 34% соответственно; р 0.0001) [270]. Это позволило увеличить число радикальных резекций печеночных метастазов и, как следствие, к пролонгации выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости.

Таким образом, высокая частота объективного эффекта при применении трехкомпонентных режимов, является важной целью для терапии больных с потенциально операбельными метастазами рака толстой кишки. Высокая непосредственная эффективность сопровождается серьезным увеличением токсичности терапии, что требует тщательного отбора больных. Одновременно необходимо дальнейшее проведение исследований для сравнения трехкомпонентного режима и комбинаций FOLFOX и FOLFIRI в стандартных дозах. Данные этого исследования еще раз подтвердили, что для достижения медианы продолжительности жизни 18-20 месяцев больные метастатическим колоректальным раком должны получить три препарата: иринотекан, оксалиплатин, фторпиримидины.