Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние изученности влияния нефти и нефтепродуктов на свободноживущих инфузорий .9
1.1. Пути поступления нефти и ее производных в тропосферу и гидросферу . 10
1.2. Изменение форм нефтяных загрязняющих веществ в водной среде 15
1.3. Токсикологическое воздействие нефти и нефтепродуктов на одноклеточные и многоклеточные организмы .18
1.4. Нормирование содержания нефти и ее производных в водоемах 25
1.5. Методы обнаружения и очистки почвы и водной экосистемы от нефтяного загрязнения 29
Глава П. Материал и методы исследования 32
2.1. Материал исследования (культивирование инфузорий) 32
2.2. Методы исследования 36
Глава III. Пресноводные инфузории как тест-объекты в экологических исследованиях и их морфофизиологическая адаптация 42
3.1. Цилиаты - биоиндикаторы степени загрязнения окружающей среды 42
3.2. Формирование адаптивного комплекса при длительных модификациях Paramecium caudatum Ehrenberg 46
Глава IV. Влияние нефти и нефтепродуктов на жизненные циклы пресноводных инфузорий 57
4.1. Популяционная динамика Paramecium caudatum Ehrenberg при различных видах нефтяного загрязнения 57
4.2. Влияние различных концентраций нефти и дизельного топлива на динамику популяций инфузорий Stentor polymorphus Miiller 64
4.3. Динамика развития популяции инфузорий Spirostomum minus Ehrenberg при нефтяном загрязнении 72
4.4. Популяционная динамика развития Coleps hirtus Nitzsch в условиях нефтяного загрязнения 78
Глава V. Влияние нефтепродуктов на динамику развития и морфологию Paramecium caudatum Ehrenberg при совместном культивировании с бактериями 85
5.1. Изменение динамики развития и морфометрических показателей Paramecium caudatum Ehrenberg 86
5.2. Качественный состав углеводородов в клетках Paramecium caudatum Ehrenberg и бактерий 97
Заключение 111
Выводы 113
Библиографический список 115
Приложения 144
- Пути поступления нефти и ее производных в тропосферу и гидросферу
- Материал исследования (культивирование инфузорий)
- Формирование адаптивного комплекса при длительных модификациях Paramecium caudatum Ehrenberg
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
На Дальнем Востоке Хабаровский край занимает второе место по сбросу токсикантов в водные экосистемы. Со сточными водами в р. Амур поступает значительное количество загрязняющих веществ. Характерными поллютантами являются нефтепродукты (0,05-0,15 тыс. т/год), фенолы (1,17-1,79 т/год), нитраты (1950,4-3270,3 т/год). Порой загрязнение поверхностных вод главной реки г. Хабаровска нефтепродуктами достигает экстремально высоких значений (до 68 ПДК). С речным стоком токсиканты выносятся в моря - по Амуру в Охотское море вынесено около 2,1 тыс. тонн нефтепродуктов. Большие массы нефти и нефтепродуктов поступают в водоемы при сбросе неочищенных сточных вод промышленными предприятиями, предприятиями железнодорожного транспорта, с дождевыми стоками, с хозяйственно-бытовыми стоками города, стоками автотранспортных предприятий. Современная ситуация с экологической точки зрения стала еще более острой, что связано с расширенными объемами добычи нефти на Сахалинском шельфе, строительством нефтепровода «Ангарск - Находка (Перевозная)». В Хабаровском крае трасса нефтепровода пересекает биологический заказник краевого значения «Бирский», особо охраняемые природные территории местного значения («Горный массив Синюха», «Река Каменушка», «Река Первая Седьмая», «Река Вторая Седьмая», «Река Третья Седьмая», «Река Подхоренок», «Водно-Болотные угодья»), государственный природный заповедник «Большехехцирский», природный заказник федерального значения «Хехцир». Аварийные ситуации на нефтепроводе, несомненно, окажут негативное воздействие не только на их уникальную систему, но и в результате смыва токсикантов с рельефа местности приведут к загрязнению водных экосистем (Экологическая ситуация в Хабаровском крае в 2000 г. Аналитическая записка, 2001; Блиновская, 2003; Ткаченко, 2003).
По токсикологическому воздействию на организмы нефть и нефтепродукты значительно отличаются друг от друга. Это объясняется различным процентным содержанием в них химических соединений (углеводородов, асфальтенов, металлов и др.), а также зависит от уровня организации животного, продолжительности воздействия токсиканта, гидрометеорологических и природно-климатических условий. Токсикологический эффект данных поллютантов проявляется на клеточном (нарушение дыхания, фагоцитоза, обменных процессов, скорости пульсации сократительных вакуолей и образования пищеварительных вакуолей), на организменном (измельчение клеток водорослей, нарушение процесса размножения, увеличение смертности эмбрионов) и на популяционном (падение численности особей, преобладание в популяции самок, снижение видового биоразнообразия) уровнях (Воропаева и др., 1990; Гусев и др., 1981; Духин, 2002; Михеева, 2002; Расулова, 1999).
В основном взаимодействие нефти и нефтепродуктов исследуется на позвоночных (земноводные, рыбы, птицы) и беспозвоночных животных (круглые и кольчатые черви, моллюски, ракообразные, иглокожие, насекомые) (Мазманиди, Котов, 1981; Пястолова, Данилова, 1986; Артемьева, 1999; Расулова, 1999; Духин, 2002; Кибардин, 2002 и др.). Очень мало данных по изучению влияния нефтяного загрязнения на уровне модельных сообществ с использованием простейших и экспериментальных исследований на клеточном уровне организации (Гроздов, 1988; Краюшкина, 2001; Rogerson, Berger, 1980,1981).
В литературе отсутствуют работы, направленные на изучение морфофизиологических реакций, динамики развития в условиях нефтяного загрязнения таких видов инфузорий, как Coleps hirtus Nitzsch, Stentor polymorphus Miiller, Spirostomum minus Ehrenberg. Недостаточно исследований по изучению способности токсиканта (нефти, дизельного топлива) передаваться по трофическим цепям от бактериальных клеток инфузориям.
5 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью нашей работы явилось выявление закономерностей формирования адаптивных комплексов у некоторых видов инфузорий (Stentor polymorphus Miiller, Paramecium caudatum Ehrenberg, Spirostomum minus Ehrenberg, Coleps hirtus Nitzsch) к воздействию ряда экологических факторов; возможности передачи нефтяных углеводородов по пищевым цепям от бактерий цилиатам и способности накопления токсиканта в клетках простейших.
Для реализации цели были поставлены следующие задачи:
Выявить особенности влияния фитонцидов на динамику численности, морфометрические и физиологические показатели инфузорий Paramecium caudatum.
Изучить динамику численности популяций пресноводных инфузорий Paramecium caudatum, Stentor polymorphus, Spirostomum minus и Coleps hirtus под воздействием нефти и нефтепродуктов (дизельного топлива).
Исследовать адаптивные реакции популяций цилиат под влиянием биоактивных веществ (фитонцидов) и в условиях нефтяного загрязнения.
Изучить возможность использования цилиатами углеводородокисляющих бактерий как пищевого ресурса и определить качественный состав нефтяных углеводородов, аккумулированных в бактериальных клетках и цитоплазме инфузорий.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые получены результаты по влиянию разных концентраций тюменской нефти и дизельного топлива на динамику популяции Paramecium caudatum, Stentor polymorphus.
Установлена высокая токсичность дизельного топлива по сравнению с нефтью на культивируемые виды инфузорий. В присутствии нефтепродукта прослеживается явление инверсии токсичности по отношению к пресноводным инфузориям. Тюменская нефть оказывает разный по характеру токсикологический эффект на простейших.
Получены новые теоретические и практические данные в области протозоологии по адаптации отдельных видов инфузорий к таким экологическим факторам как нефть и биоактивные вещества.
Экспериментально доказано, что низкие концентрации веществ стимулируют развитие популяций инфузорий, а высокие - ингибируют. В процессе адаптации оказываются затронутыми практически все стороны жизнедеятельности клеток.
Впервые разработан, апробирован метод совместного
культивирования инфузорий Paramecium caudatum и
углеводородокисляющих бактерий, выращенных на средах, содержащих нефтепродукты (дизельное топливо). Исследован качественный состав углеводородов в бактериальных клетках и клетках цилиат. Получены данные по морфофизиологическим показателям инфузорий и динамики развития их популяций.
Выявлено изменение показателей при воздействии токсиканта, выражающееся в колебании диаметра пищеварительных вакуолей, общем измельчании клеток парамеций. На основании исследований возможности передачи токсиканта по трофическим цепям, отмечено, что происходит накопление, поступивших в среду углеводородов, как в клетках бактерий, так и в клетках инфузорий. Однако состав нефтяных углеводородов отличается по содержанию отдельных компонентов. Это связано с микробиологической трансформацией углеводородов.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Нами получены новые теоретические и практические данные в области протозоологии по адаптации некоторых видов инфузорий, обитающих в пресных водоемах Дальнего Востока, к биоактивным веществам, нефти, дизельному топливу.
Представляет особую практическую значимость материал о накоплении и передачи токсиканта по трофическим цепям от бактериальных клеток клеткам цилиат.
В связи с высокой чувствительностью к антропогенным загрязняющим веществам, пресноводные инфузории представляют перспективные тест-организмы. Проведенные нами исследования показали, что инфузорий Paramecium caudatum, Stentor polymorphus, Spirostomum minus и Coleps hirtus действительно возможно использовать в качестве биоиндикаторов для определения степени загрязнения водных экосистем поллютантами.
ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Инфузории Paramecium caudatum способны формировать адаптивные комплексы при влиянии биологически активных веществ.
Токсический эффект поллютантов (тюменская нефть, дизельное топливо) проявляется не только на клеточном уровне, но и на популяционном.
Адаптивные комплексы при влиянии нефти и нефтепродуктов у исследуемых видов инфузорий не формируются.
При непосредственном контакте бактерий с дизельным топливом и в дальнейшем с инфузориями в клетки последних мигрируют и накапливаются н-алканы.
8 АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ
Результаты исследований представлены на: VII Всероссийской студенческой конференции Красноярского государственного университета (Красноярск, 2000), III научной конференции «Успехи современного естествознания» (Сочи, 2003).
Материалы диссертационной работы были доложены на конкурсах молодых ученых и аспирантов Хабаровского края (Хабаровск, 2000, 2003, 2004); третьей международной научной конференции творческой молодежи «Научно-техническое и экономическое сотрудничество стран АТР в XXI веке» (Хабаровск, 2003); 49-ой научной конференции ХГПУ (Хабаровск, 2003); на всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию Хабаровского края «Природные ресурсы Хабаровского края: проблемы науки и образования» (Хабаровск, 2003).
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Автор выражает глубокую признательность своему руководителю д.б.н., профессору Л.И. Никитиной. Автор благодарит к.б.н., с.н.с. лаборатории микробиологии НВЭП ДВО РАН (г. Хабаровск) Е.А. Каретникову, инженера Хабаровского аналитического центра А.Г. Жукова за помощь в проведении исследований.
Работа выполнена при частичной поддержке конкурса ДВО РАН 04-З-Г-06-016 «Экспериментальное моделирование миграции углеводородов нефти в системах "углеводороды-бактерии-простейшие" и "углеводороды-простейшие"».
Пути поступления нефти и ее производных в тропосферу и гидросферу
У экологов вызывает тревогу продолжающееся загрязнение Мирового Океана нефтью и нефтепродуктами, достигшее уже 1/5 его общей поверхности. Нефтяное загрязнение таких размеров может вызвать существенные нарушения газо- и водообмена между гидросферой и атмосферой. В настоящее время добывается 4 млрд. тонн сырой нефти. Территорию России и ее водные бассейны пересекают почти 50 тыс. км магистральных нефтепроводов и около 20 тыс. км нефтепродуктопроводов, недостаточная глубина прокладки, превышенные проектные сроки эксплуатации которых являются острой проблемой с точки зрения безопасности окружающей среды. При добыче, переработке, транспортировке теряется 50 млн. тонн нефти и нефтепродуктов. Наибольшее количество (до 2 млн./год) нефтяных загрязняющих веществ поступает в водную среду в результате судоходства и, главным образом, при эксплуатации танкерного флота, когда с промывочными и балластными водами сбрасывают нефть в основном в виде водонефтяных эмульсий прямого, обратного и множественного вида, часто с содержанием нефтяных комочков (Лозановская и др., 1998).
Иную форму имеет загрязнение нефтью в портах и припортовых акваториях. Сюда входят потери нефти и нефтепродуктов при погрузки-выгрузки (например, разлив нефтепродуктов в 2002 году в речном порту Амурска при закачке мазута в танкер), случайные утечки топлива из переполненных танкеров, разрывы шлангов и другие аварийные ситуации. В 1997 году при подаче нефти на танкер «Сискаут» произошел разлив узла нефтепровода на нефтеперевалочной базе «Шесхарис». От этого источника наиболее вероятно образование слика пленок на водной поверхности, наличие эмульгированной пространственной формы в первый период выброса весьма ограничено (Проблемы химического загрязнения вод Мирового океана / под ред. Миронова, 1985; Проблемы химического загрязнения вод Мирового океана / под ред. Нестеровой, 1989).
К числу наиболее распространенных причин загрязнения водной среды нефтью и ее производными следует отнести аварии крупнотоннажных танкеров. Именно первая авария танкера «Торри Каньян» в 1967 году привлекла внимание общественности к проблеме нефтяного загрязнения океана. С тех пор разливы нефти при авариях судов и морских буровых установок происходят довольно часто. В 1977 году у берегов Западной Франции потерпел аварию танкер «Акомо Кадиз», который вез 230 тыс. тонн нефти. Нефтью покрылись пляжи, берега. В результате аварии танкера «Эксон Вальдес» в 1989 году произошел разлив 40 тыс. тонн нефти. Недалеко от порта Шахтерск (Татарский пролив) в октябре 1979 года потерпело крушение судно «Такэо мару». В мае следующего года утечка топлива возобновилась. В течение недели на поверхности воды наблюдалась пленка протяженностью до 2 км и шириной 10-50 м. В 1999 году произошел залповый выброс топлива. Мазут начал просачиваться из старых трещин. На берегу погибшего судна продолжает находиться около 290 тонн мазута и 50
тонн дизельного топлива. Даже незначительные подвижки «Такэо мару» могут привести к возобновлению выхода нефтепродуктов (Загрязнение и охрана природы Мирового океана, 1995; «Тихоокеанская звезда», вт, 19 июня, 2001).
Не менее серьезную опасность представляют аварии на нефтепромыслах. Аварии на скважинах могут сопровождаться открытым фонтанированием газа и выбросами газоконденсата. В случае длительного (в течение недель, месяцев) фонтанирования аварийной скважины возможен разнос попавших в воду углеводородов на десятки и сотни километров. Так, в 1977 году на платформе «Браво» месторождения «Экофиск» в Северном море начала фонтанировать нефтяная скважина. Выброс нефти достигал 4 тыс. м в сутки. При катастрофах судов и буровых установок в морскую среду попадает в среднем 420 тыс. тонн нефти. Эти локальные разливы особенно опасны, так как наносят большой экономический и экологический ущерб. В процессе эксплуатации месторождения вероятны постоянные утечки и аварийные сбросы больших количеств буровых сточных вод (Реакции гидробионтов на загрязнение среды.../Кошелева и др., 1997).
При аварийных разливах с судов и буровых установок образуются сплошные поля загрязненных веществ, слики, пленки, эмульсии, чаще всего обратные («вода в масле») или множественные. Наибольшее количество разливов (до 90% ) происходит в портах или при подходе к ним и 80% из них составляют разливы сырой нефти (Проблемы химического загрязнения вод Мирового океана / под ред. Миронова, 1985).
Огромным источником загрязнения является слив промывочных и балластных вод из танкеров и отстойников морских судов. Нередки выбросы и прорывы нефти при разведке новых и эксплуатации действующих морских и прибрежных нефте- и газопромыслов. Причиной нефтяного загрязнения являются повреждения нефтехранилищ в море. Проникновение нефти в гидро- и тропосферу происходит в результате повреждений трубопроводов. Ежегодно в России выливается из трубопроводов на землю и в реки до 6 млн. тонн нефти, а основной причиной этого являются прогнившие, разваливающиеся трубопроводы.
Повышенное содержание нефтяных углеводородов в портовых акваториях обусловлено еще и сбросом промышленных и бытовых отходов и ливневыми стоками. Нефтяные загрязняющие вещества поступают от этих источников в основном в виде эмульсий. Количество взвешенной, пленочной и растворенной форм незначительно.
Потенциальным источником загрязнения водных ресурсов являются накопители сточных вод (поля фильтрации, пруды-испарители и др.), которые хранят жидкие отходы, сильно загрязненные нефтепродуктами (до 200 ПДК), фенолами (20-80 ПДК), хлориды, сульфаты, тяжелые металлы.
Большие массы нефти поступают в океан с суши по рекам, с промышленными, бытовыми и дождевыми стоками. Объем загрязнения от этого второго по величине источника превышает 2 млн. тонн в год. Со стоками промышленных предприятий в море ежегодно попадает 0,5 млн.тонн нефти в виде прямых, обратных и множественных эмульсий в растворенном и пленочном состоянии.
Материал исследования (культивирование инфузорий)
Длительное культивирование инфузорий в лабораторных условиях представляет большой интерес. Однако следует учитывать, что не все виды цилиат легко поддаются размножению в искусственных условиях. В процессе культивирования простейших следует уделять достаточное внимание подбору питательного субстрата, факторов среды -температурного, газового режима, рН среды, концентрации, состава пищи и др. У разных видов инфузорий требования к данным условиям весьма варьируют. В качестве культуральных и питательных сред можно использовать настои сена различных трав (тимофеевки луговой Phleum pratense, клевера полевого Trifolium larvense, вики Vicia sativa, овса Avena sativa), листьев деревьев и кустарников (вяза, березы, тополя, дуба), зерна некоторых злаковых культур. Некоторые цилиаты (Tetrahymena, Paramecium caudatum) способны достигать высокой численности при выращивании их в аксеничных условиях, то есть в отсутствии других организмов. В этом случае в качестве питательного субстрата применяют стерильные печеночные, мясные, дрожжевые экстракты. Для успешного культивирования некоторые используют смеси питательных веществ:
1) 0,1% протеозо-пептон и 0,1-0,2% дрожжевой или печеночный экстракт;
2) 0,6-0,8% аминопептид и 0,1-0,2% дрожжевой или печеночный экстракт;
3) 10 г протеозопептона, 5 г NaCl, 2 г декстрозы, 8 г дрожжевого экстракта на литр бидистиллированной воды.
Для выращивания инфузорий широко используется минеральная среда Лозина-Лозинского (NaCl - 100 мг/л, КО - 100 мг/л, MgS04- 10 мг/л, СаС12 - 10 мг/л, NaHCOs - 20 мг/л), среда Прескотта (2 мг/л MgS04, 4 мг/л СаНР04, 6 мг/л КС1, 10 мг/л СаС12, 10 мг/л NaCl). Хищных протист лучше культивировать на среде Чокли (80 мг NaCl; 4 мг ЫаНСОз; 4 мг КС1; 4 мг СаС12; 1,6 мг СаН4(Р04)г 2Н20 на литр бидистиллированной воды) (Losina-Losinsky, 1931; Prescott et al., 1964; Хаусман, 1988). Некоторые виды инфузорий культивируют на стерильной салатной среде (Sonneborn, 1970).
Дополнительно в качестве пищевых компонентов лучше использовать культивируемые в стерильных условиях микроорганизмы: бактерий Bacillus subtilis, Bacillus podigiosus, Aerobacter aerogenes, E. coli, Proteus vulgaris, Klebsiella aerogenes; дрожжей Candida guilliermondii, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces serevisiae (1 мг/мл); смесь бактерий Bacillus subtilis и дрожжей Saccharomyces ellipsoideus (0,05-0,06 г/л : 0,5-0,6 г/л); а также мелких жгутиконосцев, одноклеточных протококковых (Chlorella sp.), диатомовых водорослей (Nitzchia palea), евглен Euglena gracilis, Euglena spirogyra, Euglena viridis (Столяров, 1965; Астахова и др., 1975; Чорик и др., 1983; Виноходов, 1995). Хищным видам инфузорий (Lacrymaria marina, Stentor, Dileptus и др.) предпочтительно несколько раз в неделю добавлять в среду «живой корм» - Tetrahymena pyriformis, Chilomonas Paramecium, Chlamidomonas reinhardi, Colpidium campylum, Colpidium colpoda, Halteria sp. и др. (Noel de Terra, 1966; Hideo Kumazawa, 1974; Скарлато, 1978).
Для постановки экспериментов по токсикологии нами были выделены маточные культуры инфузорий из природных водоемов окрестностей г. Хабаровска. Для этого в чистую колбу отбирали пробу в прибрежной зоне водоема. Воду следует брать в водоемах, расположенных в районах с наименьшим антропогенным прессом. Пробы отбирали с глубины 10-15 см, среди водной растительности, с небольшим количеством донного осадка. Колбу помещали в слабо освещенное место при комнатной температуре, добавляли небольшое количество сенного отвара и зерна риса. Отвар готовили по следующей методике. В 1 л сырой воды добавили 200 г мелко нарезанного сена сорных трав и кипятили в течение 25 минут. Затем отфильтрованный сенной отвар разбавляли кипяченой водой до цвета жидкого чая и разливали в стеклянные сосуды до 0,5 литров. Сосуды накрывали и ставили в теплое место (23С). Через 5 дней после появления пленки на поверхности отвара среду использовали для эксперимента. Присутствие растворенной органики в опытной среде несколько увеличивает устойчивость инфузорий к воздействию индуцирующих факторов, поскольку сенной отвар служит источником питания для инфузорий. Это улучшает их физиологическое состояние и соответственно повышает устойчивость к токсическому действию агента. Перенос инфузорий, культивируемых на сенном отваре, в опытную среду без органики является своего рода «функциональной нагрузкой» (Никитина, 1997). Через несколько дней пробу микроскопировали и выделяли необходимые для эксперимента виды инфузорий, которых отлавливали стерильной пипеткой с тонким оттянутым концом. Каплю пробы помещали на предметное стекло, затем из нее аккуратно пипеткой отлавливали необходимый вид инфузорий, который помещали в стерильную каплю воды. Далее инфузорий снова отбирали из этой капли и переносили в другую чистую каплю воды. Отмывку водой повторяли до тех пор, пока в капле не оставалось посторонних организмов. Выделенных инфузорий помещали в чашки Петри (Spirostomum minus, Coleps hirtus) или колбы емкостью 250 мл (Stentor polymorphus, Paramecium caudatum). При подборе сред для выращивания культуры руководствовались их доступностью, быстротой приготовления, легкостью в использовании и самое главное - выбранная среда должна обеспечивать высокий темп размножения протист. В качестве культуральных и питательных сред испытаны:
1) сенной отвар сорных трав из семейства злаки Роасеае (костер безостый Bromus inermis, ячмень гривастый Hordeum jubatum, тимофеевка луговая Phleum pratense, пырей ползучий Agropyron repens) с добавлением зерен риса;
2) минеральная среда Лозина-Лозинского (NaCl — 100 мг/л, КС1 - 100 мг/л, MgSQ4 - 10 мг/л, СаС12 - 10 мг/л, NaHCQ3 - 20 мг/л). Материалом в токсикологических экспериментах служили популяции инфузорий: Paramecium caudatum Ehrenberg, 1838 (класс Oligohymenophora, отряд Hymenostomatida), Coleps hirtus Nitzsch, 1817 (класс Kinetophragminophora, отряд Prostomatida), Stentor polymorphus Muller, 1773 и Spirostomum minus Ehrenberg, 1833 (класс Polyhymenophora, отряд Heterotrichida) (рис. I—IV).
Маточные культуры инфузорий Coleps hirtus, Stentor polymorphus и Spirostomum minus вели на сенном отваре сорных трав (Bromus inermis, Hordeum jubatum, Phleum pratense, Agropyron repens); Paramecium caudatum — на минеральной среде Лозина-Лозинского и на сенном отваре смеси трав (Hordeum jubatum, Phleum pratense, Bromus inermis, Agropyron repens). Coleps hirtus - гистиофаг, который питается, высасывая мертвых водных животных, а также остатки отмерших водорослей (Мамаева, 1979). Стенторов кормили инфузориями Tetrahymena pyriformis Schewiakoff, 1889 (класс Oligohymenophora, отряд Hymenostomatida) и эвгленами Euglena oxyuris Schmarda (класс Sarcodina, отряд Euglenida) (рис. V—VT). Кормовые организмы предварительно выделяли из пресных водоемов по методике, описанной выше; помещали в колбы с культуральной средой, в качестве которой использовали дистиллированную воду. Один раз в неделю добавляли зерна риса. Колбы с кормовыми организмами ставили в слабо освещенное место. Культивировали при температуре 23±2С и рН=7,0-7,2. Кормом для Spirostomum minus и Paramecium caudatum служили бактерии. Емкости с инфузориями Coleps hirtus содержали при температуре 17-20 С; с инфузориями Paramecium caudatum и Spirostomum minus - 18±ЗиС; с инфузориями Stentor polymorphus - 8-10С, т.к. они входят в группу стенотермных холодолюбивых инфузорий (Суханова, 1998). При разведении инфузорий учитывали рН среды, наиболее благоприятную для развития определенного вида протист. Для Paramecium caudatum рН составил 6,8 (реакция слабокислая); для Coleps hirtus рН=7 (нейтральная); для Stentor polymorphic pH=7,5 (слабощелочная); для Spirostomum minus рН=7,2 (слабощелочная).
Формирование адаптивного комплекса при длительных модификациях Paramecium caudatum Ehrenberg
Одна из особенностей модификационной изменчивости -кратковременность. Но существуют и длительные модификации, распространяющиеся на несколько поколений организмов, размножающихся вегетативно или партеногенетически. Впервые длительные модификации были обнаружены у Paramecium caudatum. Согласно Соннеборну (1966) длительные модификации (danermodifications), описанные Иоллосом, у простейших могут рассматриваться как одно из явлений, которое оказало «очень незначительное влияние на генетику».
Работы Иоллоса (1913, 1920, 1924, 1934) привели к выводам, которые были весьма передовыми для своего времени, но иногда не очень убедительными. Революционной оказалась мысль о том, что некоторые условия окружающей среды во многих случаях и у многих живых существ, в особенности у простейших, могут определять особые типы модификации, которые всегда являются длительно сохраняющимися, но, в конце концов, обратимыми после возвращения организма в первоначальные «нормальные» условия среды. Как это было обнаружено, реверсия этих модификаций к исходному состоянию происходит после очень большого числа агамных поколений или после полового процесса, или после внезапных изменений в самой окружающей среде. Необычно длительно сохраняющиеся, часто даже после половых процессов, модификации Иоллоса не могли быть разновидностью обычно встречающихся временных изменений, а некоторые их характеристики не позволяли отнести их и к категории истинных мутаций. Иоллос считал, что одни длительные модификации, например, индуцированные температурой, связаны с макронуклеусом, но и затрагивают цитоплазму, а другие такие, как длительные модификации, индуцированные некоторыми химическими веществами, связаны только с цитоплазмой. Гены всегда исключались из рассмотрения, несмотря на то, что истинные мутации появлялись в тех же условиях, в которых возникали и длительно сохраняющиеся модификации.
Данные современной генетики по ресничным инфузориям позволяют подвергнуть критике многие из выводов Иоллоса. Методы, применяемые в настоящее время для выращивания культур; сложность жизненного цикла инфузорий и невозможность вести культуры в течение длительного времени без больших изменений в них; хорошо известные теперь детали некоторых половых процессов; модели некоторых наследственных систем, связанных с макронуклеусом и цитоплазмой; наблюдения по автономности кортекса дают совсем иную основу для анализа длительных модификаций.
Шухкманн и Пикарский, используя методы Иоллоса, провели серию опытов на безмикронуклеусном клоне Colpoda stlini, используя в качестве индуцирующего агента оксид мышьяка. Полученные ими результаты еще раз подтвердили необходимость опытов, исключающих отбор, и привлечение гибридологических методов для более глубокого анализа этого явления.
Русская школа протозоологов внесла новый вклад в изучение изменений, индуцированных окружающей средой, введя метод ежедневной повторной изоляции. Некоторые русские биологи (Орлова, Полянский, Суханова, Григорян) распространяли свои исследования отчасти на физиологию, отчасти на генетику этого явления у некоторых видов ресничных инфузорий. Были изучены физиологические зависимости между отдельными факторами внешней среды и некоторыми модификациями, индуцированными в организмах, и высказаны соображения о значении изменений метаболизма у животных, выращенных в различных условиях. Генетически метод ежедневной повторной изоляции, исключающий отбор, прояснил очень важный факт: модификации, обладающие основными характеристиками изменений, описанных Иоллосом, можно получить воздействием тех же агентов и без отбора животных, подвергая их постепенно вырастающему по интенсивности воздействию этих агентов.
Если обратиться к работам Криппа-Франчески (1961, 1967, 1969), то можно кратко описать основные их результаты. Исследования проводились на различных видах ресничных инфузорий с использованием разных индуцирующих факторов. Начальным материалом исследования стала Paramecium aurelia, которая хорошо изучена в отношении жизненного цикла и наследственных систем. Культура ежедневно подвергалась воздействию высоких температур. Во многих случаях отчетливые изменения в устойчивости к температуре сохранялись на протяжении -60 вегетативных делений, но затем эта модификация, в конце концов, исчезала. Также был проведен гибридологический анализ этой модификации (скрещивание устойчивых особей с контрольными). В результате было выяснено, что изучаемая модификация связана с цитоплазмой, а в скрещиваниях резистентных особей с контрольными происходит истинная конъюгация.
Женермонт (1961, 1963, 1966), работая с Paramecium aurelia, обнаружил интересные модификации, индуцированные хлоридом кальция и выражающиеся в виде изменений в сторону как более высокой, так и более низкой устойчивости. Исследования велись в течение многих месяцев и даже лет, на протяжении большого числа делений. Женермонт пришел к выводу о наличии генетической гетерогенности, которая появляется в линиях на уровне образования новых карионид.
Осипов (1966) изучал теплоустойчивость у Paramecium caudatum, определяя среднее время выживания организмов при 40 С, совместно культивировал гомозиготные клоны, различающиеся по теплоустойчивости и через несколько месяцев изучал гибридов первого поколения. Автор пришел к заключению, что расщепление по признаку «теплоустойчивость» совпадает со временем распределения «зачатков» макронуклеусов. И действительно, между сестринскими субкарионидами не наблюдали никаких различий.
Таким образом, исследования действия различных физико-химических факторов на гидробионтов невозможно без изучения адаптивных признаков.
В связи с недостаточными данными по изучению влияния природных биологически активных соединений на простейших, мы решили выяснить, какое влияние оказывают эти вещества на морфологию клетки, численность популяций инфузорий и определить их способность к адаптации при различных концентрациях биоактивных веществ.
При адаптации к смене условий у инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg, 1838 (класс Oligohymenophora, отряд Hymenostomatida) наблюдается явление фазности (Полянский, 1959; Серавин, 1959; Ир лина, 1963). Установлено, что на протяжении всего времени опыта удерживается высокая устойчивость Paramecium caudatum к 1% раствору водной вытяжки чеснока, что значительно превышает численность клеток в контрольных культурах (рис. 1). Отсюда можно сделать вывод, что инфузории, находящиеся в среде с данной концентрацией вытяжки чеснока, приобретают стойкую адаптивную модификацию, выраженную в форме повышенной устойчивости к этому агенту (Жиркова, 2000 б).
