Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Сравнительный анализ технологий, направленных на восстановление объектов, загрязненных углеводородами 11
1.1.1 Технологии биостимуляции и биоаугментации 16
1.1.2 Условия среды, лимитирующие процессы биоремедиации in situ 22
1.1.3 Биоремедиация грунтов, загрязненных углеводородами 29
1.2 Потенциал психрофильных микроорганизмов в процессах биоремедиации 32
1.3 Микробная биодеградация углеводородов 36
Глава 2. Объекты и методы исследования 45
2.1 Природно-географическая характеристика района исследования 45
2.2 Объекты исследования 47
2.3 Методы микробиологического анализа 56
2.4 Экспериментальные работы 58
2.4.1 Лабораторные эксперименты с почвенными микрокосмами 58
2.4.2 Натурные эксперименты 61
2.5 Методика проведения биостимуляции в грунтах, загрязненных нефтепродуктами 64
2.6 Статистическая обработка данных 69
Глава 3. Изменение численности автохтонных микроорганизмов в загрязненной нефтью почве при коррекции условий среды 71
3.1. Характеристика изолятов психрофильных бактерий верхнего горизонта почвы 72
3.2 Сравнительный анализ численности психрофильных и мезофильных микроорганизмов в почве 81
3.3 Динамика численности микроорганизмов в почвенных микрокосмах при внесении карбамидоформальдегидного полимера 84
3.4 Стимуляция автохтонной микрофлоры в нефтезагрязненной почве in situ 90
Глава 4. Стимуляция автохтонных микроорганизмов in situ в грунтах, загрязненных нефтепродуктами 102
4.1 Факторы, определяющие распределение микроорганизмов в грунтах 102
4.2 Стимуляция автохтонных микроорганизмов в грунтах зоны аэрации 107
4.3 Стимуляция автохтонных микроорганизмов в грунтовых водах 117
4.4 Динамика гидрохимических показателей грунтовых вод при проведении биостимуляции 124
Заключение 142
Выводы 147
Список литературы 149
Приложения 170
- Технологии биостимуляции и биоаугментации
- Методика проведения биостимуляции в грунтах, загрязненных нефтепродуктами
- Динамика численности микроорганизмов в почвенных микрокосмах при внесении карбамидоформальдегидного полимера
- Динамика гидрохимических показателей грунтовых вод при проведении биостимуляции
Введение к работе
Актуальность. Углеводороды нефти относятся к широко распространенным поллютантам поверхностных и подземных экосистем (Vogt and Richnow, 2014). При добыче, транспортировке, переработке и хранении в результате аварийных разливов ежегодно теряется 2% от извлекаемой из недр нефти, это составляет 60–70 млн. тонн в год (Филонов, 2016). Помимо загрязнения сырой нефтью, регистрируется загрязнение продуктами ее переработки. По оценкам специалистов при однократном загрязнении, углеводороды в грунтах могут оставаться в неизменном виде сотни и даже тысячи лет (Другов и Родин, 2007). Для ликвидации последствий углеводородного загрязнения используют два метода биоремедиации – биостимуляцию (активизация роста автохтонной микрофлоры) и биоаугментацию (интродукция композиций из смешанных культур углеводородокисляющих микроорганизмов) (Atlas, 1995; Климентова и др., 2007; Филонов, 2016).
Биостимуляция включает в себя модификацию среды для активизации автохтонных бактерий, способных к биоремедиации, и осуществляется путем коррекции таких условий, как аэрируемость, содержание биогенных элементов питания, pH и температура (Margesin et al., 2000). Основным преимуществом биостимуляции является то, что автохтонные микроорганизмы адаптированы к условиям среды и занимают все пространство загрязненной зоны. На практике, биостимуляцию чаще всего осуществляют путем внесения минеральных биогенных элементов питания в загрязненную зону.
В сравнении с биостимуляцией, методы биоаугментации часто представляются как необходимый и эффективный подход. В связи с этим отметим, что при мероприятиях биоаугментации вместе с культурами микроорганизмов в обрабатываемую систему обязательно вносят биогенные элементы. Ряд авторов считают, что вклад интродуцированных микроорганизмов в деградацию поллютанта существенно меньше, чем вклад биогенных элементов (Atlas, 1995; Psycrophiles: from Biodiversity…, 2008). Следует также отметить, что биостимуляция относительно просто реализуемая технология и возможности ее изучены недостаточно полно. В настоящем, мало работ, посвященных исследованию биостимуляции нефтезагряз-ненных объектов в условиях in situ (Sorvari et al., Simpanen et al., 2016). Особенно это касается грунтов, загрязненных углеводородами, где применение ряда биоремедиационных мероприятий, эффективных в поверхностных экосистемах, сильно ограничено. Подавляющее большинство исследований по биоремедиации подземных экосистем выполнено за рубежом (Williams et al., 1997; Werner et al., 1997; Thurmann et al., 1999; Ivshina et al., 2015). При этом предлагаемые технологии биоремедиации грунтов, такие как bioventing и air-sparging, весьма трудоемки и затратны (Werner et al., 1997; In-situ Air Sparging, 2013).
Для эффективной стимуляции автохтонной микрофлоры экосистемы, нарушенной в результате углеводородного загрязнения, необходимо учитывать и другие факторы, лимитирующие развитие микроорганизмов. В частности, один из важных факторов, ограничивающий биодеградационный потенциал нефтезагрязненных почв и грунтов – низкая температура среды. В связи с чем, наряду с изучением мезофиль-ных автохтонных микроорганизмов, большое значение имеет исследование психро-
фильных, которые способны деградировать загрязнение в условиях низких температур.
Цель настоящего исследования – оценка эффекта стимуляции автохтонных психрофильных и мезофильных микроорганизмов при биоремедиации грунтов зоны аэрации и грунтовых вод, загрязненных нефтепродуктами.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи.
-
Определить характеристики роста изолятов психрофильных углеводородокис-ляющих микроорганизмов нефтезагрязненной почвы Средней Сибири, при культивировании на среде с углеводородами.
-
Провести сравнительный анализ численности психрофильных и мезофильных микроорганизмов в верхнем горизонте почвы и грунтах, загрязненных углеводородами.
-
Изучить влияние условий среды на численность автохтонных психрофильных и мезофильных микроорганизмов в нефтезагрязненной почве в лабораторных и натурных экспериментах.
-
Оценить эффект стимуляции автохтонных психрофильных и мезофильных микроорганизмов при внесении биогенных элементов питания для биоремедиации грунтов, загрязненных нефтепродуктами.
Научная новизна работы. Впервые проведен сравнительный анализ численности психрофильных и мезофильных микроорганизмов, участвующих в биореме-диации верхнего горизонта почвы и грунтов, загрязненных углеводородами в условиях Средней Сибири. Показано, что в поверхностном горизонте почвы численность психрофильных микроорганизмов ниже, чем мезофильных соответствующих эколо-го-трофических групп. В грунтах на глубинах 1-5 м численность психрофильных микроорганизмов сопоставима с численностью мезофильных, на глубинах 15 м, численность психрофильных на порядок выше. Показано, что внесение карбамидо-формальдегидного полимера, обладающего свойствами структурообразователя почвы и пролонгированного азотного удобрения, увеличивает численность автохтонных микроорганизмов на 2-4 порядка. Апробирован способ стимуляции автохтонных микроорганизмов геологической среды (грунты зон аэрации, насыщения и грунтовые воды), загрязненной нефтепродуктами, посредством внесения биогенных элементов питания через верхний горизонт грунта и систему наблюдательных скважин. Показано, что биостимуляция микроорганизмов сопровождается увеличением в грунтовых водах содержания аммонийного и нитратного азота, углекислого газа и перманганатной окисляемости, являющихся индикаторами протекающих процессов восстановления.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы позволили расширить знания о распространении психрофильных микроорганизмов в почвах и грунтах в условиях Средней Сибири. Механизм стимуляции развития автохтонной микрофлоры посредством внесения карбамидоформальдегидного полимера в качестве удобрения пролонгированного действия и структурообразователя в нефтезагрязненную почву может применяться для биоремедиации углеводородзаг-рязненных почв.
Разработана схема мероприятий по биостимуляции грунтов и грунтовых вод, загрязненных нефтепродуктами путем внесения минеральных биогенных элементов
питания через верхний горизонт грунта и систему наблюдательных скважин. Подбор биогенных элементов проводился с учетом особенностей ключевых групп микроорганизмов, включая анаэробные, а также изменения гидрохимических показателей в грунтовых водах. Схема мероприятий по биостимуляции грунтов прошла апробацию и используется для восстановления геологической среды, загрязненной нефтепродуктами на Абаканской ТЭЦ. Защищаемые положения:
-
На территории Средней Сибири в грунтах, загрязненных нефтепродуктами, присутствует автохтонное психрофильное сообщество аэробных и анаэробных микроорганизмов, стимуляция которого может играть одну из доминирующих ролей в восстановлении грунтов и грунтовых вод.
-
Стимуляция автохтонного сообщества микроорганизмов минеральными биогенными элементами питания, учитывающая особенности ключевых эколого-трофических групп микроорганизмов и динамику гидрохимических показателей загрязненных нефтепродуктами грунтовых вод, обеспечивает ускорение их восстановления, которое может сопровождаться временным увеличением концентраций аммония и перманганатной окисляемости.
Личный вклад автора. Лабораторные и натурные эксперименты с нефтезаг-рязненной почвой, планирование и проведение работ по биостимуляции в грунтах, обработка и интерпретация полученных результатов выполнены автором. Сбор данных по численности микроорганизмов разных эколого-трофических групп в грунтах проводился совместно с к.ф.-м.н В. П. Ладыгиной. Интерпретация гидродинамических показателей пород грунта с нефтехранилища на территории г. Красноярска проведена совместно с к.г-м.н. А.Ю. Озерским (Геоэкологическая партия ОАО «Красноярскгеология»). Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Материалы исследований были представлены на конференциях: VI Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2002); VII Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2003); Научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Тюмень, 2003); Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2003); Всероссийской научно-технической конференции «Социальные проблемы инженерной экологии, природопользования и ресурсосбережения» (Красноярск, 2003); X Всероссийской научной конференции студентов-физиков (Екатеринбург – Москва, 2004); IV Съезде Докучаевского общества почвоведов (Новосибирск, 2004); The 2-nd International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering (Shanghai, 2008); Международной научно-практической конференции «Advanced Science» (Пенза, 2017).
Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 13 работ, из них 2 работы отражены в международной базе данных SCOPUS, 4 работы опубликовано в журналах ВАК РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах текста, содержит 52 рисунка, 18 таблиц и 7 приложений. Работа состоит из введе-
ния, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 189 источников, из которых 60 – на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность д.ф.-м.н. Ю. Л. Гуревичу за методическое руководство, к.ф.-м.н. В. П. Ладыгиной за помощь в получении данных, д.б.н. С. В. Хижняку за помощь в обработке данных, к.г-м.н. А. Ю. Озерскому, к.т.н. Ю. П. Ланкину за помощь в проведении нейросетевого анализа, д.б.н. Е. Я. Мучкиной, М. И. Теремовой за практическую помощь и ценные советы.
Работа частично выполнена при поддержке: Красноярского краевого фонда науки (грант М0041 от 2000 г.).
Технологии биостимуляции и биоаугментации
Процесс восстановления загрязненных систем с помощью биологических агентов называют биоремедиацией или биорекультивацией. По большей части биологическими агентами выступают микроорганизмы, которые способны напрямую осуществлять биодеградацию загрязнителя. В мировой практике существуют три основных подхода в использовании микробиологических процессов очистки от углеводородных загрязнений (Гриценко и др., 1997).
Первый заключается в интенсификации природного микробного сообщества путем добавки в загрязненную среду биогенов, как правило, минеральных солей азота и фосфора – биостимуляция. В ходе реализации второго из загрязненной среды выделяются автохтонные микроорганизмы деструкторы компонента-загрязнителя, изучаются особенности его метаболизма, на основе полученных данных в специальных ферментерах наращивается значительная масса бактерий-аборигенов и интродуцируется вместе с биогенами в загрязненную среду. Третий подход заключается, в обработке загрязненного участка биопрепаратом, содержащим высокоактивные по отношению к компоненту-загрязнителю микроорганизмы – биоаугментация (Margesin et al., 2000; Xu and Obbard 2003; Zhang et al., 2009).
Биостимуляция. Основополагающий принцип биостимуляции – создание оптимальных условий для развития автохтонной углеводородокисляющей микрофлоры. В большинстве случаев, биостимуляция, осуществляется путем коррекции таких показателей, как аэрируемость, содержание биогенных элементов, pH и температура (Margesin et al., 2000; Шамаева, 2007; Бочкарева, 2014). Эффективность биостимуляции во многом зависит от возможности воздействовать на названные параметры. Один из часто используемых приемов при биоремедиации нефтезагрязненных почв – внесение NPK-элементов, в виде удобрений. При этом иногда наблюдается нежелательный эффект – закисление почвы, что так же ингибирует развитие нефтеокисляющих микроорганизмов. Во избежание закисления почвы, на рекультивируемую поверхность вносят раскислители, которые поддерживает оптимальную pH, например, мел (Зубайдулин, 1998).
Основная роль в биодеградации углеводородов принадлежит аэробным микроорганизмам, потому важное условие эффективной биодеградации – аэрируемость очищаемых почв. Для чего на практике используют вспашку, или вносят разнообразные наполнители, способствующие интенсификации аэрации, такие как древесная кора, опилки, солома (Пономарева и др., 1998). Еще один предлагаемый прием для улучшения аэрации нефтезагрязненных почв – применение химических окислителей, в частности пероксида кальция. В экспериментальных исследованиях внесение в очищаемую почву пероксида кальция повышало степень очистки почвы на 10 – 15%. При этом очистке подвергались не только верхний горизонт (0 – 10 см), но и более глубокие почвенные слои (10 – 45 см) (Пономарева и др., 1998).
В агрохимической практике для улучшния агрофизических свойств почв применяют структурообразователи (Кульман, 1982). В первую очередь они меняют структуру почвы – оструктуривают, в результате, повышается водопроницаемость почв, воздухопроницаемость, противоэрозионная устойчивость и др. Это создает оптимальные условия для развития автохтонной микрофлоры. Структурообразователи, в силу определенных физических и/или химических свойств, придают системе структурообразователь – почва новое качество, которое данная почва без этой добавки приобрести не может. Эти продукты образуют с почвой гетерогенную смесь, которую можно снова разделить на отдельные компоненты физико-химическими способами. Они сохраняют характерные свойства даже в смеси, благодаря чему и проявляется их почвоулучшающее действие. В агрохимической практике используют структурообразователи разных типов, которые благоприятно воздействуют на микрофлору почвы, изменяя ее различные свойства (Кульман, 1982; Агрохимия, 1989). В качестве структурообразователей используют мел, пенопласты, торф и др.
Искусственные пенистые вещества (пенопласты) представляют собой стабильные дисперсии газов в твердом веществе, отличающиеся ячеистой структурой и низкой плотностью (Кульман, 1982). К этому классу структурообразователей относят карбамидоформальдегидные пенопласты, которые представляют собой продукты конденсации мочевины и формальдегида. Пенопласты влияют на разные свойства почвы. Пенопласты могут придавать почве любую степень разрыхления, и действуют как теплоизоляцинный материал. С одной стороны это обусловливает более медленное прогревание, с другой замедленное остывание почвы.
Теплоизолирующая способность пенопласта влияет не только на капиллярную конденсацию влаги в почве, но и на другие ее свойства. Более сильное отражение света белым слоем полимера по сравнению с немульчированной поверхностью почвы обуславливает 60 – 80%-ное повышение температуры воздуха на высоте 8 – 10 см над пенопластом. Окрашивание мульчи в черный цвет сопровождается усиленным поглощением тепла и повышением температуры почвы. Современные пенопласты также улучшают водопоглощающую способность обработанного слоя почвы, однако не создают существенного запаса влаги. Улучшаются аэрация, инфильтрация и водопроницаемость почвы.
Также карбамидо-формальдегидные полимеры могут выступать в качестве азотного удобрения пролонгированного действия (Агрохимия, 1989). Продолжительность действия полимера – 5-10 лет (максимально – до 20). Интенсивность его разложения в почве зависит от свойств пены и почвенно климатических условий (Кульман, 1982). В настоящем карбамидоформальдегидные полимеры используются для механического сбора нефти и нефтепродуктов (Баронин и др., 2002). Внесение карбамидоформальдегидных полимеров почву, загрязненную углеводородами нефти, в качестве структурообразователя и удобрения является перспективным малоисследованным направлением.
Также для интенсификации биодеградации углеводородов применяют методы, основанные на явлении кометаболизма. Некоторые соединения расщепляются микроорганизмами только совместно с хорошо утилизируемыми субстратами. Такое превращение какого-либо вещества в присутствии так называемого косубстрата, т. е. вещества, используемого клетками для роста, получило название кометаболизма или соокисления (Шлегель, 1987). Явление кометаболизма может быть полезно, например, при очистке промышленных сточных вод, содержащих плохо поддающиеся разложению синтетические продукты, в том числе это явление применяется при очистке от нефтяных загрязнений. Например, добавление белкового гидролизата в почвы загрязненные дизельным топливом увеличило скорость разрушения углеводородов нефти на 21% (Harrison, 2000). Напротив, некоторые авторы отмечают, что добавление альтернативных легкоокисляемых источников углерода (глюкозы, аминокислот) ингибирует деградацию загрязнителя (Swindoll et al., 1988; Adams et al., 2015).
Таким образом, метод биостимуляции, в основе которого лежит активизация автохтонных углеводородокисляющих микроорганизмов, достаточно просто реализуем на практике и выгоден с экономической точки зрения. Основным преимуществом биостимуляции является то, что биоремедиация осуществляется автохтонными микроорганизмами, которые адаптированы к условиям среды и заполняют все пространство загрязненной зоны. Однако на практике, при разливах и утечках углеводородов, проведению биостимуляции на нефтезагрязненных объектах, уделяется меньше внимания, и предпочтение отдается методам биоаугментации – внесению микробных препаратов. Несмотря на то, что с экономической точки зрения эти методы менее выгодные.
Биоаугментация. Существуют ситуации, когда введение бактериальных нефтеокисляющих препаратов не только оправданно, но и совершенно необходимо. Например, в северных районах, где теплый период года непродолжителен, процессы биодеградации не успевают развернуться в полной мере. Повышение численности углеводородокисляющих микроорганизмов в этом случае путем интродукции активных форм, безусловно, полезно. Это особенно актуально для нашей страны, расположенной в основном в зоне холодного и умеренного климата. Другая ситуация – внезапный разлив нефти в открытом море, где нефтеокисляющие бактерии практически отсутствуют. Ряд сообщений свидетельствует, что в открытом море даже при высокой температуре процессы биодеградации нефти идут крайне медленно (Коронелли, 1996).
Методика проведения биостимуляции в грунтах, загрязненных нефтепродуктами
С 2004 года авторами совместно с сотрудниками Минусинской гидрогеологической партии на территории мазутного хозяйства Абаканской ТЭЦ проводятся работы по стимуляции автохтонной аэробной и анаэробной микрофлоры с целью восстановления геологической среды, загрязненной нефтепродуктами. Биоремедиационные мероприятия проводятся на наиболее загрязненном участке территории мазутного хозяйства (рис. 2.3 и 2.4). В качестве биоремедиационого мероприятия выбран метод биостимуляции -стимуляция развития автохтонных бактерий, в грунте посредством внесения биогенных минеральных элементов питания. Выбор технологической схемы обработки сделан на основании экспериментальных данных о распределении микроорганизмов в грунтах и грунтовых водах. Также во внимание брали и другие характеристики объекта: концентрацию поллютанта, химический состав среды, направление потока воды, поглотительную способность грунта и др.
На начальном этапе в грунтах и грунтовых водах определили содержание биогенных элементов. Анализ химического состава грунтовых вод показал, что в воде достаточно калия, магния и серы для питания микроорганизмов, однако концентрация азота (аммонийного и нитратного) низкая и практически отсутствует фосфор. Содержание доступного растворенного фосфора в верхнем горизонте грунтов было менее предела обнаружения. В то же время концентрация фосфора в грунтовых водах имела выраженную тенденцию снижения в направлении потока воды и составляла менее 0,1 мг/дм3. Это лимитирующая концентрация для роста микроорганизмов по отношению к наблюдаемым концентрациям азота на этом участке.
В связи с чем, в качестве метода стимулирующего автохтонную микрофлору грунта выбрано внесение в загрязненную систему биогенных химических элементов в виде удобрений, а именно аммофоса, нитроаммофоса, сульфата аммония, магния сернокислого. Удобрение, содержащее нитратную форму азота, также вносили для стимуляции развития анаэробных бактерий (денитрификаторов).
Расчет дозы внесения удобрений. При расчете дозы внесения минеральных химических элементов руководствовались следующим – концентрация углеводородов нефти в наиболее загрязненной части грунтовых вод принята равной 1 г/дм3 или обеспечивающей синтез 0,3 г биомассы при окислении микроорганизмами. С учетом притока вещества будет окислено в 3 раза больше – 30,3 г/дм3 углеводородов. Содержание фосфора в биомассе бактерий – 2,5%, азота – 11%. При полном удовлетворении потребности в фосфоре это соответствует 0,069 – 0,086 г нитроаммофоса/дм3 (в зависимости от содержания фосфора). Если за базовый элемент принять азот, то потребуется 0,144 г/дм3.
Выбор наблюдательных скважин. С целью определения возможности использования наблюдательных скважин для внесения минеральных элементов путем налива водных растворов, были проведены измерения поглотительной способности исследуемых скважин. В таблице 2.5 представлены результаты определения поглощения воды при экспресс-наливе в скважины на опытном участке. В результате наиболее удовлетворяющими задаче приняты скважины 159 и 238, скорость поглощения воды в которых составляла 5,5 л/мин и 5,6 л/мин соответственно. Другие скважины могли «принимать» раствор минеральных элементов только в малых количествах или располагались на периферии загрязненного участка. Чтобы максимально охватить всю площадь загрязненного участка, растворы удобрений в меньших количествах вносили в скважины 238 и 239. Проницаемость грунта в районе скважины 239, расположенной вниз по потоку воды, очень низка, что минимизировало вынос азота и фосфора с грунтовыми водами за пределы загрязненной геологической среды.
Описание биостимулирующих мероприятий. Биоремедиационные мероприятия проводили в два этапа: летом 2005 г. и 2006 г. Минеральные элементы вносили на поверхность загрязненной области и внутрь через систему наблюдательных скважин. Схема обработки опытного участка на территории мазутного хозяйства ТЭЦ представлена в таблице 2.6. Для проведения обработки на поверхности загрязненного участка в емкость (20 м3) набирали грунтовую воду с загрязненного участка, вносили минеральные элементы. После пребывания в емкости в течение 7 – 10 суток суспензия разливалась вокруг скважины 159 в радиусе 5-6 м. Общая площадь обработанной территории около 200 м2. При проведении мероприятий на первом этапе, акцент делали на стимуляцию аэробных гетеротрофных бактерий, поэтому азот вносили в аммонийной форме. В дальнейшем азот также вносился в нитратной форме, чтобы также стимулировать развитие денитрификаторов, и акцент делали на фосфор.
Минеральные элементы вносили в наблюдательные скважины с периодичностью 2-3 раза в месяц. Наибольшее количество удобрений было внесено через скважину 159, которая находилась в зоне максимального загрязнения. Скважина 237 находилась выше по течению грунтовых вод. В скважины 238, 239 и на прилегающую к ним территорию, удобрения внесены однократно (18.07.2005 г.) в небольшом количестве, которое могло создать концентрацию фосфора и азота в грунте и подземной воде одного порядка с фоновой. После внесения минеральных удобрений фиксировали изменение химического состава грунтовых вод, с целью исключить дополнительное загрязнение, все исследуемые показатели химического сотава воды не отличались от проб воды из скважин, в которые удобрения не вносили.
В 2006 период количество вносимых в грунтовые воды удобрений было ниже, чем в 2005 году, также основная доля минеральных удобрений в загрязненную грунтовую систему была внесена через скважину 159. В дальнейшем обработку временно не проводили, чтобы оценить продолжительность действия внесенных химических элементов на численность аборигенных бактерий. После наблюдаемого положительного эффекта работа на загрязненном участке продолжилась.
Критерии эффективности. Для оценки эффективности предложенной методики биостимуляции в геологической среде использовали следующие критерии:
1) изменение численности психрофильных и мезофильных бактерий ключевых эколого-трофических групп: углеводородокисляющие, аммонифицирующие, денитрифицирующие, железоредуцирующие, сульфатредуцирующие;
2) изменение гидрохимических показателей: содержание нитратных форм азота (аммоний, нитрит, нитрат), содержание углекислого газа и иона гидрокарбоната, перманганатная окисляемость;
3) содержание нефтепродуктов в грунтовой воде.
Динамика численности микроорганизмов в почвенных микрокосмах при внесении карбамидоформальдегидного полимера
Один из основных факторов, ограничивающих биологическое окисление поллютанта в почве – дефицит кислорода. Это особо актуально при биоремедеации нефтезагрязненных почв, поскольку углеводороды – восстановленные соединения и для их окисления требуется кислород. Выше говорилось о часто используемых приемах, позволяющих увеличить аэрируемость почв, в числе которых называют и рыхление (Зубайдуллин, 1998). К недостаткам рыхления относят то, что оно требует применения специальной техники, которая нарушает плодородный слой почвы, при этом, эффект действия кратковременный, т.е. процедуру рыхления нужно неоднократно повторять. В связи с чем, необходим поиск альтернативных решений, позволяющих улучшить аэрируемость нефтезагрязненной почвы, для стимуляции развития аэробной нефтеокисляющей микрофлоры.
Структурообразователи по механизму действия представляют собой вещества, которые влияют на процессы, протекающие на поверхности раздела двух фаз, и тем самым изменяют физические, химические и физико-химические свойства почвы (Кульман, 1982). В лабораторном эксперименте анализировали влияние однократного внесения карбамидо-формальдегидного полимера в качестве удобрения и структурообразователя, как альтернативного рыхлению варианта на численность мезофильных и психрофильных бактерий (эксперимент 1 в разделе 2.4.1).
Численность мезофильных и психрофильных микроорганизмов в почве с полимером и аэрируемой почве выше, чем в контроле (рис. 3.9 и 3.10).
По критерию Вилкоксона достоверность отличий между контролем и микрокосмом, в котором почва аэрировалась, составляет 0,99. Численность микроорганизмов в почве с полимером, в начале эксперимента была близка к аэрируемой почве, а в конце эксперимента она снижалась и приближалась к контролю. В течение всего эксперимента численность микроорганизмов в микрокосме с еженедельным рыхлением была самой большой, однако, в некоторых случаях внесение полимера приводило к более высоким численностям. Однократное внесение полимера в лабораторном эксперименте позволяло заменить 4-5 рыхлений.
Далее оценивали влияние карбамидоформальдегидного полимера как соединения изменяющего теплофизические свойства почвы. Данный полимер имеет низкий коэффициент теплопроводности 0,023 – 0,03 ккал/мчасградус (Баронин и др., 2002; Кульман, 1982), его внесение в почву изменяет также ее теплофизические свойства. В лабораторном эксперименте по определению динамики температуры почвы с исследуемым полимером и без него при изменении внешней температуры воздуха на 4оС скорость изменения температуры почвы составляли 1,0C и 2,2C в час, соответственно. Таким образом, внесение карбамидоформальдегидного полимера в почву меняет ее теплофизические свойства. То есть в условиях переменных температур, почва будет медленнее остывать или нагреваться.
Для оценки влияния полимера на численность мезофильных и психрофильных бактерий в условиях переменных температур (имитация сезонных колебаний температуры) проводили эксперимент с почвенными микрокосмами (эксперимент 2 в разделе 2.4.1). Анализ данных показал, что в микрокосме с полимером численность мезофильных и психрофильных аммонифицирующих микроорганизмов была выше на протяжении всего периода наблюдений с доверительной вероятностью 0,89 (критерий Вилкоксона) (рис. 3.11 и 3.12).
Можно отметить, что при уменьшении температуры с +20 до +5С, численность аммонифицирующих микроорганизмов снижалась контроле снижалась, в то время как присутствие полимера позволило увеличить численность психрофильных и мезофильных микроорганизмов. В точке замораживания численность и мезофилов, и психрофилов в обоих вариантах снижалась до минимума, при оттаивании, снова численность микроорганизмов в микрокосме с полимером становилась выше.
Также, в течение всего периода наблюдений, численность углеводородокисляющих микроорганизмов в микрокосмах с полимером была выше (доверительная вероятность 0,98) (рис. 3.13 и 3.14).
Динамика гидрохимических показателей грунтовых вод при проведении биостимуляции
Для оценки процессов биодеградации нефтепродуктов анализировали изменение химического состава грунтовых вод. В ряде случаев численность микроорганизмов находится вблизи порога обнаружения, особенно это касается анаэробных микроорганизмов. В этой ситуации методы измерения не позволяют зафиксировать достоверные изменения численности микроорганизмов при воздействии на систему. Более информативным является оценка изменения химического состава грунтовых вод, которое происходит в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Как известно, показатели химического состава грунтовых вод (концентрация аммония, сульфата, щелочность и др.) могут служить индикаторами биодеградации нефтепродуктов (Eriksson et. al., 2006; Паничева и др., 2012).
Деградация нефтепродуктов протекает в аэробных и анаэробных микрозонах загрязненной области. По аэробному пути биодеградация, в большинстве случаев, протекает до углекислого газа и воды, поэтому этот процесс называют минерализацией. При этом углекислый газ выделяется так же и при анаэробных процессах деградации углеводородов. Таким образом, появление углекислого газа (СО2) и иона гидрокарбоната (НСО3-) свидетельствует о биологических процессах окисления органического загрязнения. Соотношение содержания СО2 и НСО3- зависит от рН и температуры воды. При рН 7-8 выше концентрация гидрокарбоната, при рН 8,5 их концентрации уравновешиваются. В щелочной области выше концентрация углекислого газа (Крайнов и др., 2004).
Вклад аэробных и анаэробных процессов в биодеградацию может меняться в зависимости от условий среды (Паничева и др., 2012). При этом нельзя не учитывать вклад микроорганизмов с низкой численностью в процессы биодеградации загрязнения. По данным исследователей вклад анаэробных процессов в северных и умеренных широтах в биохимическую трансформацию нефтепродуктов составляет до 80% (Паничева и др., 2012).
Динамика содержания углекислого газа и иона гидрокарбоната. В ответ на внесение минеральных элементов отмечалось увеличение концентрации углекислого газа в грунтовых водах, которое свидетельствует об интенсификации процессов биодеградации. Так, на начальном этапе исследования концентрация углекислого газа колебалась в пределах 6,6 – 13.2 мг/дм3 (табл. 4.4). После внесения минеральных элементов концентрация СО2 в пятне загрязнения увеличилась в 10 раз до 66 – 136,4 мг/дм3. Через полгода данный показатель вернулся к исходным величинам. Повторное внесение химических элементов в скважину 159 снова привело к увеличению углекислого газа в воде (табл. 4.3).
Можно отметить, что изменение концентрации иона гидрокарбоната не было синхронным с изменением концентрации углекислого газа. Сначала в грунтовой воде фиксировалось увеличение концентрации углекислого газа, затем, увеличение концентрации гидрокарбонат-иона (табл. 4.3 и 4.4). То есть постепенно углекислый газ, образовывающийся в процессе биодеградации, переходил в гидрокарбонат.
Корреляционный анализ показал, что после внесения минеральных элементов (в 2005 г.) отмечалась сильная положительная связь между концентрацией аммония и углекислого газа (коэффициент корреляции r менялся от 0,9 до 0,95) в грунтовой воде скважин (Приложение 6). Это может свидетельствовать о том, что в процессе окисления азотсодержащих углеводородов происходит высвобождение аммония и углекислого газа. В более поздний период после обработки (апрель 2007) отмечалась положительная связь между концентрациями аммония и гидрокарбоната (коэффициент корреляции r=0,93) (Приложение 6). Эти данные согласуются с динамикой концентрации углекислого газа и гидрокарбоната в грунтовой воде.
Также, увеличилась перманганатная окисляемость грунтовой воды.
Пермаганатная окисляемость характеризует содержание в воде легкоокисляемых органических веществ (в основном гуминовые кислоты и фульфокислоты), которые могут быть окислены кислородом. Этот показатель очень часто используют на практике для оценки органического загрязнения воды. Для фоновых грунтовых вод он составляет 2 – 4 мг О2/дм3. В данном случае, нефтепродукты не относятся к легкоокисляемой органике, а вот продукты их распада могут.
На начало исследования перманганатная окисляемость в очаге загрязнения колебалась в пределах 0,11 – 6 мг О2/дм3, после внесения минеральных элементов 1,6 – 11,68 мг О2/дм3 (табл. 4.5). При этом прирост перманганатной окисляемости отмечался, в период, когда уже минеральные элементы не вносили (август 2007), т.е. биодегрдация продолжалась. Перманганатная окисляемость коррелировала с концентрацией углекислого газа (коэффициент корреляции r=0,91) и концентрацией гидрокарбоната (коэффициент корреляции r=0,93), а также с концентрацией аммония (коэффициент корреляции r=0,86) (Приложение 6).
Таким образом, увеличение численности исследуемых эколого трофических групп микроорганизмов сопровождалось увеличением концентрации органического вещества, концентрации углекислого газа и иона гидрокарбоната в грунтовой воде. Изменение данных показателей свидетельствует об интенсификации процессов микробной биодеградации нефтепродуктов.
Динамика содержания химических форм азота. При внесении биогенных элементов в грунты контролировали содержание гидрохимических показателей в воде. Все исследуемые показатели оставались в пределах нормы, за исключением концентрации нитрата в скважине 159 (табл. 4.6). Концентрация нитрата 81,1 мг/дм3 превышает ПДК (45,0 мг/дм3). Однако в скважине 239, которая находится ниже по направлению потока вод на расстоянии 25 м, его концентрация была намного меньше (0,69 мг/дм3). При последующем анализе воды (через 6 месяцев) этот показатель тоже пришел в норму.
Анализ содержания химических форм азота в грунтовых водах в период до проведения обработки (2004 г.), показал, что на периферии пятна концентрация аммония составляла 0,07 мг/дм3, либо он не обнаруживался (скв. 237 в табл. 4.6). В то же время, в пятне загрязнения (скв. 159, 239) содержание аммония было выше – 1,7 – 5,1 мг/дм3 (табл. 4.6). Периодически во всех скважинах наблюдалось полное исчерпание аммония. С одной стороны это может свидетельствовать о процессе нитрификации, а с другой об отсутствии разложения нефтепродуктов, содержащих азот. Напротив, нитрат в больших концентрациях наблюдался в скважинах с низким уровнем загрязнения. На периферии загрязненного участка нитрат колебался в пределах 0,5 – 3,7 мг/дм3, в пятне загрязнения – в пределах 0 – 2,5 мг/дм3. При этом анализ концентрации нитрата в грунтовых водах в период до внесения минеральных элементов питания показал, что периодически фиксировалось увеличение концентрации нитрата в воде на 2-3 порядка. Так, в скважине 238 (10.09.04) концентрация нитрата в скважине составляла 116,15 мг/дм3, в скважине 161 – 57,28 мг/дм3 (29.04.04).