Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 15
1.1. Микроклимат животноводческих помещений как совокупность экологический фактор окружающей среды .15
1.2. Влияние стресса на организм животных 18
1.3. Свободно-радикальное окисление липидов и антиоксидантная защита организма 21
1.4. Получение ветеринарного препарата траметин 32
1.4.1 Химический состав траметина 34
1.5. Влияние селена и цинка на организм животных 35
1.6. Общая характеристика базидиальных грибов-ксилотрофов 40
1.6.1. Характеристика гриба-ксилотрофа Trametes pubesces (Shumach.: Fr.) Pilat 44
1.6.1.2 Препараты на основе грибов-ксилотрофов рода Trametes 45
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований
2.1 Моделирование оксидативного стресса 52
2.2 Моделирование темнового стресса 52
2.3 Моделирование кормового стресса .53
2.4 Метод введения зонда в желудок птицы .53
2.5 Метод взятия крови у животных 54
2.6 Методы определения параметров микроклимата 54
2.7 Методы исследования компонентов системы перекисного окисления липидов-антиоксидантной системы 56
2.8 Методы статистической обработки 60
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований 61
3.1 Результаты изучения параметров микроклимата помещений свинарника для поросят-отъемышей п. Оек ООО «Академия» 61
3.1.2 Результаты изучения параметров микроклимата помещений для молодняка крупного рогатого скота ООО «Возрождение» 62
3.2 Результаты биохимических показателей крови 63
3.2.1 Результаты исследования компонентов системы ПОЛ-АОЗ у цыплят кросса Dekalb при коррекции окислительного стресса, вызванного введением ацетальдегида 64
3.2.1.2 Снижение ущерба от оксидативного стресса при использовании препарата траметин у цыплят 69
3.2.2 Результаты исследования компонентов системы ПОЛ-АОЗ у поросят породы ландрас при коррекции окислительного стресса, вызванного низким уровнем освещенности .71
3.2.3 Показатели системы ПОЛ-АОЗ у молочных телят при скармливании иммунофлора и траметина 75
3.2.4 Изменение живой массы тела у сельскохозяйственных животных при нарушении режима выращивания и применения различных препаратов 81
ГЛАВА 4 Обсуждение собственных исследований 83
Выводы 90
Практические предложения 92 Список литература 94
- Влияние стресса на организм животных
- Моделирование темнового стресса
- Результаты изучения параметров микроклимата помещений для молодняка крупного рогатого скота ООО «Возрождение»
- Результаты исследования компонентов системы ПОЛ-АОЗ у поросят породы ландрас при коррекции окислительного стресса, вызванного низким уровнем освещенности
Введение к работе
Актуальность исследования. Известно, что большая часть регионов России находится в природно-климатических условиях с выраженной сменой сезонов года, и сельскохозяйственные животные большую часть времени проводят в животноводческих помещениях. Однако искусственная среда обитания не всегда отвечает физиологическим потребностям организма животных, испытывающего большие функциональные нагрузки с изменением характера адаптивных реакций на внешние раздражители, комплекс которых при отдельных технологических приемах становится необычным и даже стрессовым, вызывая дисбаланс в системе перекисного окисления липидов – антиоксидантной защиты (ПОЛ – АОЗ) организма (Юрков, В. М., 1991).
С возникновением на планете Земля живых организмов и кислорода, который они используют в своей жизнедеятельности, появилась оксидантно-антиоксидантная система гомеостаза. Поступающий в организм кислород окисляет углеводы, жиры и белки с образованием энергии и различных углеродов, азотсодержащих соединений. Эти метаболиты выполняют энергетическую и регуляторную функции, с выделением углекислого газа и воды, причем до 1-5 % электронов в цитохромной системе не восстанавливают кислород, а образует активные формы кислорода (АФК) (Титов, В.Н., 2010; Болдырев, А. А., 2003; Владимиров, Ю. А., 1998; Герасимов, А. М., 1998; Дубинина, Е. Е., 2001; Ефимцева, Э. А., 2012.; Журавлева, О. А., 2011;Обухов, Л. М., 1968; Меньщикова, Е.Б., 2006; Петрович, Ю.А., Гуткин, Д. В., 1986.; Сазонтова, Т. Г., 2007; Чистяков, В. А., 2008.; Шабров, А. В., 2003.; Boldyrev, A. A., 2012; Circi, M. L., 2010; Lehninger, A., 2008; Reiter, R.J., 1991).
Ухудшение экологической обстановки, а именно: загрязнение воздушной среды пылью, бактериями, выхлопными газами, аммиаком, сероводородом, радиацией, нарушение температурного и светового режимов и т.д. – приводит к резкому образованию большого количества свободных радикалов, антиоксиданты же способны оптимизировать уровень эндогенного образования активных форм кислорода в организме человека, животных и птиц (Камышников, В.С., 2004).
Антиоксиданты представляют собой вещества, нейтрализующие агрессивные
кислородсодержащие радикалы, провоцирующие разрушение или повреждение клеточных мембран, нуклеиновых кислот и других жизненно важных структур, что приводит к гибели или перерождению клетки. В результате возникают различные болезни, такие как кардионедостаточность, атеросклероз, рак и т.д. (Подколзин, А.А., 2001.; Величковский, Б. Т., 2001; Колесниченко, Л.С., 2009; Ланкин, В. З., 2000; Луцкий, М. А., 2006.; Марков, Х. М., 2005; Васильева, Е.М., 2005; Петрович, Ю. А., 2005; Сафонова, О. А., 2011; Соодаева, С. К., 2006; Boldyrev, A.A., 2012; Boldyrev, A., 2000; Brown, D. I., 2009; Dumont, M., 2011; Fuchs-Tarlovsky, V., 2013; Roginsky, V., 2005).
Существуют натуральные антиоксиданты (токоферол, аскорбиновая кислота, эфиры галловой кислоты, гваяковая кислота и т. д.) и синтетические антиоксиданты (бутилоксианизол, бутилокситолуол, додецилгаллет, сантохин, дилудин, дибуг, финозан-кислота и т.д.) (Ляхович, В.В.,2006; Арушанян, Э. Б., 2012; Василец, И. М., 2004; Денисов, Л. Н., 1998;Кулинский, В. И., 2010; Максименко, А. В., 2010; Оковитый, С. В., 2003; Притыкина, Н. А., 2013; Меньщикова, Е. Б., 2013; Moataz, M.G., 2010; Kalyanarainan, B., 2003).
Синтезируют антиоксидантные вещества и дереворазрушающие грибы. Установлено, что
гриб-ксилотроф рода Trametes pubescens (Shumach.:Fr.) Pilat. синтезирует природные
антиоксидантные вещества (тритерпеновые кислоты, экзополисахариды и т.д.). Показано, что и препарат Леван-2, получаемый с использованием методов биотехнологии на основе этого гриба, обладает антиоксидантными свойствами (Чхенкели, В. А., 2012).
На наш взгляд, сегодня особый интерес представляет новый ветеринарный препарат траметин, прототипом которого является Леван-2. Траметин разработали сибирские ученые вИркутском филиале ФГБНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока», получаемый жидкофазной ферментацией гриба T. pubescens, с добавлением в питательную среду цинка сернокислого и натрия селенистокислого с последующим отделением биомассы гриба от культуральной жидкости и ее лиофилизацией. Не исключено, что указанный препарат, проявляет более высокую антиоксидантную активность, однако этот вопрос до сих пор остался не решенным.
Исходя из выше изложенного, целью исследования стало определить антиоксидантную активность препарата траметин и возможности его использования в ветеринарной практике для профилактики воздействия совокупности экологических факторов на организм животных и птиц, которые являются одновременно и стрессорами.
В соответствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:
-
Исследование параметров микроклимата в свинарнике для поросят-отъемышей п. Оек ООО «Академия» и в телятнике для молодняка крупного рогатого скота ООО «Возрождение».
-
Оценка антиоксидантной активности нового ветеринарного препарата траметин.
-
Определение концентрации факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), двойных связей (Дв.св.), кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ), продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) на модели оксидативного стресса при использовании ацетальдегида (на цыплятах кросса Dekalb); на модели темнового стресса (на поросятах помеси пород ландраса с крупной белой); на модели кормового стресса (на телятах чёрно-пёстрой породы).
-
Исследование факторов антиоксидантной защиты: общей антиокислительной активности (АОА); супероксиддисмутазы (СОД), восстановленной и окисленной форм глутатиона (GSH и GSSG), -токоферола, ретинола на модели оксидативного стресса при использовании ацетальдегида (на цыплятах кросса Dekalb); на модели темнового стресса (на поросятах помеси пород ландраса с крупной белой); на модели кормового стресса (на телятах чёрно-пёстрой породы).
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время разработаны иммуностимулирующие, противоопухолевые,
антиметастатические, антимикробные, туберкулостатические препараты (Крестин, Леван-1, Леван-2), технологический ингредиент (Леван-1), биологически активная добавка (Трамелан) на основе разных штаммов гриба рода Trametes. Установлено, что препарат Леван-2 на основе гриба-ксилотрофа T. pubescens обладает антиоксидантным действием (Подколзин А.А., 2001). Перспективным является новый ветеринарный препарат траметин, также обладающий мощным антиоксидантным действием, который защищает организм сельскохозяйственных животных и птицы, особенно молодняка, от негативного воздействия стрессов, широко распространенных в животноводстве и птицеводстве.
Научная новизна
Впервые изучено влияние препарата нового ветеринарного препарата траметин на антиоксидантный статус цыплят кросса Dekalb при оксидативном стрессе, поросят помеси пород ландраса с крупной белой при темновом стрессе и телят чёрно-пёстрой породы при кормовом стрессе.
- некоторые параметры микроклимата в свинарнике для поросят-отъемышей п. Оек ООО
«Академия», которые одновременно являются химическими, физическими и биологическими
экологическими факторами в экосистеме, превышают нормативные показатели: влажность воздуха
на 18 %, загазованность воздуха аммиаком на 16 %, скорость движения воздуха на 75 % и микробная
обсемененность воздуха на 50 %; искусственная освещенность помещения была ниже нормативных
показателей на 89 %, т.е. оказывают негативное влияние на здоровье животных.
Установлено, что влажность воздуха в ООО «Возрождение» превышает норму на 31,8 %; скорость движения воздуха ниже нормальных показателей, что отрицательно сказывается на здоровье телят.
В исследовании показано, что препарат нового поколения траметин обладает значительными антиоксидантными свойствами при использовании на экспериментальной модели оксидативного стресса на цыплятах, на экспериментальной модели световой депривации на поросятах, на экспериментальной модели кормового стресса на телятах. Проанализировав результаты опытов, было установлено:
ветеринарный препарат нового поколения траметин обладает мощными антиоксидантными свойствами, что было убедительно показано при экспериментальном моделировании оксидативного стресса на цыплята кросса Dekalb, а в последующем показано в научно-хозяйственных работах на поросятах помеси пород ландраса с крупной белой и телятах чёрно-пёстрой породы.
концентрация факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК, мкмоль/л) 1,48, двойных связей (Дв.св., ус. ед. ) 2,23, кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ, ус.ед.) 0,58, продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП, мкмоль/л) 1,50 на модели оксидативного стресса при использовании ацетальдегида (на цыплятах кросса Dekalb); концентрация факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК) 1,2, двойных связей (Дв.св., ус. ед.) 1,84, кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ, ус.ед.) 0,28, продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП, мкмоль/л ) 2,1 на модели темнового стресса (на поросятах помеси пород ландраса с крупной белой); концентрация факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК, мкмоль/л) 1,1, двойных связей (Дв.св., ус. ед.)
1,9, кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ, ус.ед.) 0,6, продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП, мкмоль/л) 1,4 на модели кормового стресса (на телятах чёрно-пёстрой породы).
- факторы антиоксидантной защиты: общей антиокислительной активности (АОА, ус.ед) 14,00;
супероксиддисмутазы (СОД, ус.ед.) 2,07, восстановленной и окисленной форм глутатиона (GSH и
GSSG, ммоль/л) 3,07 и 1,99, -токоферола (ммоль/л) 8,81, ретинола (ммоль/л) 1,22 на модели
оксидативного стресса при использовании ацетальдегида (на цыплятах кросса Dekalb); факторы
антиоксидантной защиты: общей антиокислительной активности (АОА, ус.ед) 14,9;
супероксиддисмутазы (СОД, ус.ед) 1,58, восстановленной и окисленной форм глутатиона (GSH и GSSG, ммоль/л) 3,1 и 1,9, -токоферола (ммоль/л) 12,5, ретинола (ммоль/л) 1,4 на модели темнового стресса (на поросятах помеси пород ландраса с крупной белой); факторы антиоксидантной защиты: общей антиокислительной активности (АОА, ус.ед) 13,4; супероксиддисмутазы (СОД, ус.ед) 1,9, восстановленной и окисленной форм глутатиона (GSH и GSSG, ммоль/л) 3,0 и 2,9, -токоферола (ммоль/л) 8,0, ретинола (ммоль/л) 2,7 на модели кормового стресса (на телятах чёрно-пёстрой породы).
Полученные данные свидетельствуют о мощном антиоксидантном, а в нашем случае и профилактическом действии препарата при воздействии некоторых неблагоприятных экологических факторов (загазованность воздушной среды аммиаком, сероводоводом, загрязнение воздуха пылью, грибами, изменение температурного режима и освещенности помещения) при содержании животных и птицы в современных животноводческих комплексах и на птицефабриках. В данном случае действие стрессовые факторы являются и экологическими факторами, действующими на организм животных и птицы.
Теоретическая и практическая значимость
Препарат траметин является мощным средством профилактики оксидативного и технологического стрессов, вызывающих сдвиг в системе ПОЛ-АОЗ, что было показано на моделях оксидативного стресса на цыплятах, световой депривации на поросятах и на модели кормового стресса у телят. Это характеризует его как универсальный препарат для молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, который может быть использован в системе профилактики болезней, как инфекционного характера, так и обмена веществ, и, в конечном итоге, для создания ветеринарного благополучия в животноводческих и птицеводческих хозяйствах.
Реализация и внедрение результатов исследования
Теоретические положения, результаты и рекомендации использованы при выполнении НИР и
ОКР по теме № 01.2.00 900998 «Оптимизация диагностических, профилактических и
терапевтических мероприятий по борьбе с инфекционными и инвазионными заболеваниями
животных в современных экологических условиях Восточной Сибири» (2008 – 2012 гг.),
выполнявшейся на кафедре микробиологии, патологической анатомии, ветеринарно-санитарной
экспертизы и организации ветеринарного дела ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная
сельскохозяйственная академия», научный руководитель – д.б.н. В.А. Чхенкели; НИР и ОКР по теме
№ 0201355870 от 26.03.2013 г. «Усовершенствование методов диагностики, профилактики и лечения
в системе борьбы с желудочно-кишечными и респираторными болезнями в современных условиях
АПК Иркутской области» (2013 – 2017 гг.), выполняющейся на кафедре анатомии, физиологии и
микробиологии ФБГОУ ВПО ИрГСХА, научный руководитель – д.б.н. Чхенкели В.А.; в учебном
процессе при подготовке студентов по специальности 111801.65- Ветеринария на кафедре
микробиологии и эпизоотологии ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный
университет» (приложение 1); в учебном процессе и научных исследованиях на кафедре
ветеринарно–санитарной экспертизы, микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Бурятская ГСХА
им. В.Р. Филиппова» (приложение 2); в учебном процессе и научных исследованиях кафедры
патологии, морфологии и физиологии ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный
университет». Материалы используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических
занятий по дисциплинам «Экология», «Биология» (приложение 3); в учебном процессе при изучении
дисциплин «Микробиология», «Биотехнология», «Ветеринарная микробиология и микология» на
кафедре микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы
ФГБОУ ВПО «Алтайский ГАУ» (приложение 4); в процессе выполнения НИР в лаборатории
болезней молодняка сельскохозяйственных животных ФГБНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» (приложение 5); в учебном процессе и научной работе кафедры анатомии, физиологии и микробиологии ФГБОУ ВО «Иркутский государственный
аграрный университет им. А.А. Ежевского» при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по дисциплине «Микробиология», «Ветеринарная экология», «Патологическая физиология» (приложение 6).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Препарат нового поколения траметин обладает антиоксидантным действием, как при экспериментальном оксидативном стрессе с применением уксусного альдегида на цыплятах, так и на молодняке сельскохозяйственных животных при темновом и кормовом стрессах, которые широко распространены на животноводческих предприятиях.
-
Изучаемый препарат траметин обладает регуляторным действием на систему ПОЛ-АОЗ при нарушении технологических режимов содержания сельскохозяйственных животных при ухудшении экологических факторов.
3. Ветеринарный препарат траметин проявляет анаболический эффект на уровень живой массы тела
птиц и животных при нарушении технологических процессов их выращивания.
Личное участие автора в получении научных результатов состоит в обзоре и анализе влияния экологических факторов на систему перекисного окисления липидов - антиоксидантной защиты организма сельскохозяйственных животных и птиц; обосновании направлений и методов решения поставленных задач; проведении лабораторных исследований и научно-хозяйственных экспериментов; обработке и анализе полученных результатов; формулировании основных научных положений и выводов.
Степень достоверности и апробация результатов
Исследования проводились на достаточном по численности материале, согласно утвержденному плану исследований. Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке при помощи программы STATISTICA 6.1.
Основные результаты исследования доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные исследования и разработки к внедрению в АПК» 19-20 апреля 2012 г., г. Иркутск; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные исследования и разработки к внедрению в АПК» 17-18 апреля 2013 г., г. Иркутск; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы и перспективы развития АПК» 25-27 февраля 2014 г., г. Иркутск; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты в медицине и биологии» 24 октября 2014 г., Иркутск; Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования Иркутской сельскохозяйственной академии и 10-летию первого выпуска ветеринарных врачей «Современные проблемы и перспективы развития АПК» 10- 11 декабря 2014 г., г. Иркутск; Всероссийской научно – практической конференции «Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность пищевых продуктов», Иркутск, 21-23 ноября 2012 г.; Региональной научно-практической конференции, посвященной Дню российской науки и Дню аспиранта Иркутского ГАУ им. А.А. Ежевского «Внедрение инновационных технологий создания конкурентоспособной продукции импортозамещения в сельское хозяйство региона» 12 февраля 2015 г., г. Иркутск.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 18 научных работ, в том числе 2 статьи - в
журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований, 2
статьи - в материалах зарубежных конференций, методические рекомендации «Комплексная
диагностика и специфическая профилактика желудочно–кишечных и респираторных болезней в
современных социально – экономических условиях Иркутской области» (рекомендовано к
публикации НТС Службы ветеринарии Иркутской области протокол заседания № 2 от 19 марта 2014 г.), патент RU № 2545986, кл. А61К36/07, A61P1/00 от 22.08.2013 г., «Препарат траметин для лечения желудочно-кишечных болезней телят и способ эго применения».
Структура и объем диссертации
Влияние стресса на организм животных
Впервые понятие стресс ввел в 1936 г. Ганс Селье и сформулировал его следующим образом: стресс – это состояние, которое проявляется специфическим синдромом, включающим все неспецифически вызванные изменения в биологической системе [126 - 128]. Разнообразие чрезвычайных факторов среды, вызывающих стереотипные ответные реакции (стрессоры), определяют неспецифичность формирования стресса.
Г. Селье считал, что различные стрессоры вызывают в организме сходные изменения, а именно: увеличение коркового слоя надпочечников; атрофию тимуса, селезенки, лимфатических узлов и тканей с одновременным снижением количества лимфоцитов и эозинофилов в крови; возникновение язв в желудочно-кишечном тракте.
Позднее стресс изучали М. Ковальчикова и К. Ковальчик и понимали под ним состояние, в котором находится живая система при мобилизации защитных или восстановительных механизмов, прибегающая к ним в ответ на действие неспецифических стимулов из окружающей среды [73]. С точки зрения С.И. Плященко и В.Т. Сидорова [113], стресс как совокупность общих стереотипных ответных реакций организма на действие различных по своей природе сильных (чрезвычайных, экстремальных) раздражителей. В.М. Freeman[189] характеризует стресс как «непрерывный ряд раздражений, нарушающий гомеостаз организма». Ф.И. Фурдуй [149] определяет стресс как совокупность специфических реакций организма в ответ на действия чрезвычайных раздражителей различной природы и характера, вызывающих «напряжение» функций организма и систем, обеспечивающих мобилизацию организма в целях его адаптации и поддержания гомеостаза. Благодаря способности адаптироваться к изменившимся условиям окружающей среды организмы эволюционируют, приобретая устойчивый уровень активности функциональных систем, органов и тканей, а также механизмов управления, что обеспечивает длительную жизнеспособность организма и способность к воспроизведению здорового потомства [41; 45; 46; 91].
Адаптация и стресс тесно взаимосвязаны, т.к. многие компоненты стрессовой реакции являются адаптацией организма к изменяющимся условиям окружающей среды [137; 138]. Стрессоры принято делить на две группы: 1) физиологические; 2) вредные [109]. Физиологические стрессоры относятся к факторам внешней среды, которые не наносят вреда организму и являются для него обычными, постоянно действующими, выступая в качестве тренирующего фактора, способствующего повышению устойчивости организма, укреплению здоровья, т.к. незначительно и непродолжительно воздействуют, вследствие чего организмы адаптируются.
Вредными стрессорами называют те факторы, которые по степени влияния значительно превосходят нормальные физиологические стимулы, приводящие к нарушению в работе органов и систем организма, ставя под угрозу стабильность и взаимную согласованность всей системы, приводя к нарушению всех видов обмена, снижению резистентности животных и их продуктивности [75; 88; 148].
Стрессоры также условно подразделяют на неизбежные (связаны с технологическим процессом) и нежелательные (возникают при нарушениях технологии, а также при воздействии бактериальных и вирусных агентов) [133].
Селье различал три последовательных стадии в развитии стрессовых реакций: 1) мобилизация; 2) резистентность и 3) истощение. Первая стадия – стадия мобилизации (или реакция тревоги) – является начальной стадией действия стресс-фактора на организм и длится 6-48 ч. Наблюдается нарушение гормонального статуса, связанное с выделением избытка гормонов в кровь и истощением их запасов, влечет за собой усиление процессов катаболизма, что приводит к потере массы тела животных и птиц, при этом снижается продуктивность, возникают кровоизлияния в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишке, т.к. повышается проницаемость стенок кровеносных сосудов. На этой стадии также отмечают инволюцию тимико-лимфатического аппарата, лимфопению, эозинопению и лейкоцитоз.
Возможна гибель животного на этой стадии при действии очень сильного стрессора. Стадия резистентности (или адаптация) наступает, если стрессор продолжает свое действие, и может длиться от нескольких часов до нескольких недель. Адаптация характеризуется значительным увеличением надпочечников и усилением их функций, при этом нормализуется лейкоцитарная формула крови, обмен веществ приобретает анаболический характер, что способствует восстановлению массы тела и увеличению продуктивности. Если стресс-фактор прекратил свое действие, и организм сумел нормализовать свои функции и восстановить привычную жизнедеятельность, то развитие стресса заканчивается на стадии резистентности. Стадия истощения возникает при продолжающемся действии стрессора на организм, приводя к необратимым изменениям обмена веществ, а достигнутая адаптация утрачивается. Функции надпочечников, несмотря на их гипертрофию, угнетены, отмечается лимфоцитоз, эозинофилия, увеличение проницаемости кровеносных капилляров с последующим образованием язв в желудочно-кишечном тракте, усиливаются процессы катаболизма, уменьшается масса тела, снижается продуктивность [115]. Все это приводит в конечном счете к дисфункции органов [85], заболеваниям или даже гибели животного [80]. Заболевания такого генеза Селье назвал болезнями адаптации или болезнями недостаточности [214]. В ходе развития стресс-реакции наблюдается активация процессов свободно-радикального окисления на фоне истощения собственной системы антиоксидантной защиты организма, нарушая прооксидантно антиоксидантное равновесие.
Моделирование темнового стресса
Исследования проводились на следующих животных: 1) цыплята кросса Dekalb; 2) поросята помеси ландраса с крупной белой; 3) телята черно-пестрой породы.
Эксперимент на цыплятах проводили на базе научного отдела экспериментальной хирургии с виварием ФГБНУ «Иркутский научный центр хирургии и травматологии» (виварий I категории, ветеринарное удостоверение 238 № 000360 от 30 апреля 2013 г., служба ветеринарии Иркутской области, заведующая – д.б.н. С.Н. Лепехова) (приложение 2 и 3). Однонедельные подопытные цыплята были сформированы в 4 группы по 10 особей в каждой: 1) интактные птицы; 2) цыплята, получавшие ацетальдегид (АЦ); 3) цыплята одновременно вместе с АЦ, получавшие per os комплексный препарат ЕSе (0,1 мл на 100 г массы в разведении 1:100); 4) цыплята, которым перорально давали траметин (0,2 мл на 100 г массы) в течение 7 дней и АЦ. После взвешивания 4-недельных цыплят забивали декапитацией, с помощью остро заточенных портновских ножниц, кровь собирали в пробирку и получали сыворотку, в которой определяли компоненты системы перекисного окисления липидов-антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ).
Для исследований использовали 30 поросят в возрасте 2-х месяцев. Поросята были разделены на 3 группы по 10 поросят в каждой: 1) интактные животные; 2) животные в качестве сравнения, получавшие перорально иммунофлор; 3) животные, получавшие весь подопытный период траметин. Препараты задавали групповым методом с заваренным комбикормом в следующих дозах: иммунофлор в дозе 10 г в сутки в течении 10 дней; траметин в дозе 18 г в сутки в течении 10 дней. Данный научно-хозяйственный эксперимент проводили на базе свинофермы п. Оек ООО «Академия» (приложение 4).
В исследовании использовали также 1-месячных телят черно-пестрой породы, для которых переход от молочного периода к кормлению грубыми кормами также сопровождается стрессом, а, следовательно, и нарушением соотношения компонентов ПОЛ-АОЗ. Телята были разделены на 3 группы по принципу аналогов по 10 особей в каждой: 1) интактные животные; 2) животные, в качестве сравнения, получавшие перорально иммунофлор; 3) животные, получавшие весь подопытный период траметин. В этих опытах телятам давали траметин на группу 60 г в течение 7 дней, а иммунофлор скармливали с комбикормом (50 г препарата на 50 кг комбикорма).Научно-хозяйственный опыт проводили на молочно-товарной ферме ООО «Возрождение» (приложение 5).
После взвешивания проводили забор крови утром до кормления: у поросят из ушной вены, у телят из яремной вены. Кровь собирали в пробирку и получали сыворотку, в которой также определяли компоненты системы перекисного окисления липидов-антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ).
Все исследования были выполнены в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными, изложенными в следующих нормативно-правовых документах: «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР №775 от 12.08.1977 г.); Хельсинская декларация всемирной медицинской ассоциации, 2000 г.; «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005) «Правила лабораторной практики» (приложение к приказу МЗ РФ №708н от
В эксперименте модель оксидативного стресса у цыплят достигалась однократным введением уксусного альдегида (С2H4O) в дозе LD50 per os, с помощью зонда, так 20% АЦ соответствует 0,3 мл на 100 г массы, за 4 ч до убоя [77]. Применение ацетальдегида связано с наличием в его составе активной альдегидной группы, которая реагирует с целым рядом органических соединений в клетке животного, сдвигая ее редокс-статус в прооксидантную сторону.
Моделью светового стресса служило нарушение светового режима выращивания поросят, которое заключалось в снижении интенсивности освещения с помощью затемнения оконных проемов черным полиэтиленовым пакетом толщиной 6 мкм до 10 % уровня производственной освещенности на все время эксперимента (рис. 8) [27].Как показали многочисленные исследования, проведенные на факультете биотехнологии и ветеринарной медицины Иркутской ГСХА, нарушения светового режима выращивания животных приводит не только к классическому, но и оксидативному стрессу, что сопровождается снижением уровня их здоровья, продуктивности, а также качества мяса у тушек бройлеров [30; 64; 68; 69].
Результаты изучения параметров микроклимата помещений для молодняка крупного рогатого скота ООО «Возрождение»
Начальный этап липопероксидации при исследовании влияния иммунофлора и траметина на систему ПОЛ-АОЗ характеризуется тем, что оба препарата оказывают сходный эффект на величину ДК. Этот эффект сопровождается снижением величины ДК как при использовании иммунофлора, так и траметина (соответственно на 41,7 и 54,2 %), причем разность последних величин статистически значима (Р 0,05).
Анализ действия иммунофлора и траметина на концентрацию вторичных интермедиатов липопероксидации (КД и СТ) у телят показал, что траметин в отличие от иммунофлора, уменьшает на 46 %, по сравнению с контролем, и на 34 %, по сравнению с иммунофлором.
Исследование показало, что иммунофлор и траметин существенно понижают величину ТБК-АП соответственно на 38,6 и 61,2% (Р 0,05), однако при сравнении этих величин между собой выявлено, что это различие статистически незначимо (Р 0,05). Другими словами, с точки зрения математического подхода оба этих соединения при данной выборке в одинаковой степени снижают концентрацию ТБК-активных продуктов. Рисунок 15. Состояние компонентов системы ПОЛ при добавлении в корм иммунофлора и траметина телятам при физиологическом изменении условий их выращивания.
При сравнительном анализе действия препаратов на ПОЛ (рис. 15) у телят можно отметить, что траметин и иммунофлор статистически значимо снижают уровень первичного продукта ПОЛ (ДК). Траметин по сравнению с контролем статистически значимо снижает КД и СТ. Траметин и иммунофлор в одинаковой степени снижают концентрацию ТБК-АП.
В качестве характерной черты, которая отмечается нами при изучении влияния иммунофлора и траметина на общую антиокислительную активность сыворотки крови молочных телят, необходимо отметить, что эти препараты не оказывают статистически значимого действия на этот показатель у животных; не наблюдаются также существенные изменения между этими различиями у отдельных групп (Р 0,05) (табл. 11).
При анализе концентрации у трех групп животных установлено, что содержание -токоферола статистически значимо увеличивается при добавлении в корм только траметина (на 37,9 % по сравнению с контролем), а относительно с эффектом на этот показатель иммунофлора на 40,4 % (Р 0,05). Сходный эффект при использовании двух исследуемых препаратов при кормлении молочных телят отмечается и при измерении концентрации ретинола. Так, установлено, что содержание ретинола у телят в группе с траметином превышает уровень витамина А над показателем контрольной группы, и составляет 54,5 %, что статистически значимо выше соответствующего показателя у телят, которым скармливался иммунофлор.
Примечания: - АОА (общая антиокислительная активность); СОД (супероксиддисмутаза); GSH и GSSG (соответственно, восстановленная и окисленная формы глутатиона); - Р 0,05 между средними показателями в опытах с иммунофлором и траметином. Аналогичная ситуация, которая отмечена в двух предыдущих сериях исследования, наблюдается и при изучении влияния пробиотического комплекса и препарата из грибов на активность супероксиддисмутазы отмытых эритроцитов. Так, установлено, что активность СОД статистически значимо изменяется лишь при скармливании траметина (на 90,0 % от контроля, Р 0,05). Незначительным повышением активности супероксиддисмутазы в серии с иммуномодулятором (Р 0,05) можно пренебречь, а сравнение среднеарифметических указывает превышение уровня группы с траметином над серией животных с иммунофлором на 72,7 %
Изменение концентрации восстановленной формы глутатиона в условиях прикорма телят иммунофлором и траметином напоминает картину, которую мы отмечали при изучении этого показателя у поросят. Действительно, при использовании иммунофлора эффекта на концентрацию GSH практически не наблюдается, а траметин повышает содержания этой формы трипептида в эритроцитах на 50,0 %, по сравнению с показателем контрольной группы (Р 0,05). При сравнении среднеарифметических содержания восстановленной формы глутатиона в крупах иммунофлора и траметина отмечается их различие на 57,7 % при высоком уровне статистической значимости.
В отличие от иммунофлора траметин в опытах на телятах повышает содержании и окисленной формы глутатиона (на 26,1 %, Р 0,05). Важно отметить, что траметин повышает общий пул глутатиона в эритроцитах (3,0 + 2,9 ммоль/л), по сравнению с соответствующим показателем в группе животных с применением иммунофлора (1,9 + 1,6 ммоль/л).
Рисунок 16 графически отображает полученные результаты в опытных исследованиях компонентов АОЗ при добавлении в корм иммунофлора и траметина телятам при физиологическом изменении условий их выращивания.
Траметин по сравнению с контролем повышает такие показатели как -токоферол, ретинол, супероксиддисмутазу, содержание восстановленной и восстановленной формы глутатиона. Траметин и иммунофлор не оказывают статистически значимого влияния на уровень АОА.
В заключение необходимо отметить, что траметин, наряду с его специфическим действием при лечении сельскохозяйственных животных, оказывает положительный эффект на систему ПОЛ-АОЗ, который усиливает его основное фармакологическое действие и который, возможно, входит как саногенетическое звено при лечении инфекционных заболеваний у животных. Важно подчеркнуть, что траметин (и отчасти иммунофлор) универсальным образом влияют на разные классы животных (птицы, млекопитающие моно-и полигастричные). Иммунофлор оказывает положительные эффекты на некоторые звенья системы ПОЛ-АОЗ, поскольку молочнокислые бактерии (МКБ), которые входят в состав данного препарата, а именно Bacillus Subtilis, Bacillus Licheniformis, Bifidobacterium globosum, Enterococcus faecium, Saccharomyces cerevisiae обладают антиоксидантными свойствами [141].
Результаты исследования компонентов системы ПОЛ-АОЗ у поросят породы ландрас при коррекции окислительного стресса, вызванного низким уровнем освещенности
В отличие от -токоферола, концентрация ретинола увеличивается при введении ацетальдегида; сходным образом в этих экспериментах действует и ЕSе: он также повышает содержание витамина А, в отличие от траметина. В этом единственном случае траметин уступает ЕSе по влиянию на концентрацию ретинола. Однако при интерпретации этого факта необходимо отметить, что ретинол не считается истинным антиоксидантом; скорее для него характерна прогормональная функция, поскольку он окисляется в ретиноевую кислоту, которая является истинным гормоном, обладающим морфогенетическими и другими функциями [210]. Кроме того, значение ретинола и других ретиноидов, как антиоксидантов, нельзя переоценивать, поскольку запасов эфиров ретинола с жирными кислотами (в частности, с пальмитатом) печени хватает на два года без его поступления с кормом [191].
При сравнении эритроцитарных факторов антиоксидантов защиты в условиях применения комплексного препарата селен – витамин Е и траметина можно видеть в явном преимуществе второго над первым. Так, эффект траметина в случае с СОД превосходит комплексный препарат на 65,6 %, а аналогичная величина для восстановленной формы глутатиона составляет 26,9 %. В целом можно сделать заключение о том, что траметин полностью восстанавливает исходный редокс-статус при моделировании оксидативного стресса у цыплят ацетальдегидом, в то время как комплексный препарат селена и витамина Е оказывает лишь частичный эффект. Положительный эффект траметина на системный уровень функционирования организма птиц подтверждается и более заметной прибавкой живой массы животных при скармливании им траметина, в отличие от аналогичных опытов с комплексным препаратом.
При анализе влияния препаратов различной структуры и происхождения на поросят можно видеть, что траметин оказывает положительный эффект на окисленность жирных кислот в липидах сыворотки, о чем свидетельствует более высокий уровень показателя Дв.св. Траметин, по сравнению с иммунофлором, снижает уровень продуктов ПОЛ (ДК и особенно высокотоксичных ТБК-АП). Препарат из грибов повышает также содержание антиоксидантных компонентов (АОА, -токоферол, СОД и GSH), что в целом можно интерпретировать как надежную защиту против световой депривации на молекулярном уровне. Особый интерес при анализе полученных данных может представлять повышение на 58,0 % активности такого ключевого фермента редокс метаболизма как супероксиддисмутаза при использовании траметина и увеличение на 29,2 % содержания восстановленной формы глутатиона. Такой высокий уровень отмеченных факторов может не только обеспечить антиоксидантную защиту, но и многочисленные пути метатаболизма, контролируемые GSH [82; 219]. В единственном случае траметин уступает иммунофлору по влиянию на концентрацию ретинола. Однако при интерпретации этого факта мы уже отмечали, что ретинол не считается истинным антиоксидантом; скорее для него характерна прогормональная функция, поскольку он окисляется в ретиноевую кислоту (третиноин), которая является истинным гормоном, обладающим морфогенетическими и другими функциями [210]. Несмотря на то, что третиноин активирует три члена ядерных рецепторов ретиноидной кислоты (RAR-альфа, RAR-бета и RAR-гамма), которые могут изменять экспрессию генов, последующий синтез белка и эпителиальный рост и дифференцировку клеток, все еще не было точно установлено, опосредованы ли клинические эффекты третиноина активацией рецепторов ретиноевой кислоты и другими механизмами. Кроме того, значение ретинола и других ретиноидов, как антиоксидантов, нельзя переоценивать, поскольку запасов эфиров ретинола с жирными кислотами в печени у крупных животных хватает, по крайней мере,на два года без его поступления с кормом, что было отмечено не только отечественными, но и зарубежными исследователями [195]. Телята, находившиеся в эксперименте, переживали стрессовый период своей жизни в связи с переходом с молочного питания на кормление грубыми кормами. Этот период характеризуется не только классическим (по Г. Селье) стрессу, но и сопровождается оксидативным стрессом, как это было показано в работах фалультета биотехнологии и ветеринарной медицины Иркутской ГСХА [29].
В отличие от иммунофлора, траметин у телят оказывает более выраженный эффект на концентрацию Дв.св., величину ДК и содержание ТБК-активных продуктов. Однако, в отличие от экспериментов на поросятах, траметин у телят не вызывает статистически значимого увеличения общей АОА. Вместе с тем этот дефицит у телят под действие траметина компенсируется повышением концентрации в сыворотке крови витамина А и -токоферола, которые в этом случае могут выступать не только как антиоксиданты, но и как активаторы генов [194]. О такой возможности свидетельствует повышение активности супероксидисмутазы в опытах с траметином под влиянием жирорастворимых витаминов, что мы не наблюдаем в опытах с иммунофлором. Восстановительный статус организма в экспериментах с траметином подтверждается более высоким уровнем концентрации восстановленной формы глутатиона, по сравнению с таковым в опытах с иммунофлором. Важно также подчеркнуть, что при использовании траметина отмечается более значительный общий пул трипептида (3,0 +3,9 против 1,9 + 1,6 ммоль/л), что дает большие оперативные возможности для участия окисленной и воостановленной форм трипептида в редокс-метаболизме.
Подводя краткий итог обсуждению возможности использования траметина в качестве природного антиоксидантного средства при различных экспериментальных и реальных видах стрессового воздействия на животных различных классов, следует отметить, что использование траметина снижает затраты на 119,7 р. при оксидативном стрессе. У цыплят выраженный антиоксидантный эффект препарата ассоциируется с анаболическим действием. В опытах с телятами и поросятами анаболический эффект менее выражен, хотя в экспериментальных группах отхода животных не отмечали. Таким образом, траметин защищает организм на всех уровнях ПОЛ от стрессоров, которые являются и негативными экологическими факторами, что благоприятно влияет на весь организм в целом, что способствует повышению продуктивности и улучшению качества животноводческой продукции, о чем свидетельствуют привесы живой массы во всех трех экспериментах. Данный эффект достигается за счет добавления в жидкофазную питательную среду при культивировании продуцентасолей селена и цинка, которые также оказывают стимулирующее действие на рост и развитие гриба, сокращая процесс ферментации до 4 сут. [100].