Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Карстовые пещеры как компонент биосферы 9
1.1. Происхождение и распространенность карстовых пещер 12
1.2. Особенности карстовых пещер как среды обитания живых организмов 15
1.3. Основные направления исследований пещерных микромицетов за рубежом 21
1.4. Изучение микромицетов в пещерах на территории бывшего СССР 28
Глава 2. Объекты и методы исследования 30
2.1. Характеристика изучаемых пещер 30
2.2. Методы исследования 33
Глава 3. Численный состав и распространенность микромицетов в пещерах Средней Сибири 37
Глава 4. Биологическое разнообразие микромицетов пещер Средней Сибири 57
Глава 5. Экологические особенности микромицетов карстовых пещер Средней Сибири 71
5.1. Отношение выделенных изолятов к температуре 71
5.2. Влияние экстремально высоких температур на рост и развитие пещерных микромицетов 82
5.3. Ферментативная активность пещерных микромицетов 90
5.4. Возможное участие микромицетов в трофических связях в экосистемах сибирских пещер 94
5.5. Роль микромицетов в биологическом самоочищении пещер 96
Глава 6. Подходы к оценке экологического состояния сибирских пещер на основе численности и качественного состава населяющих их микромицетов. 100
Глава 7. Перспективы практического использования микромицетов 107
Выводы 113
Литература 115
Приложение 135
- Происхождение и распространенность карстовых пещер
- Характеристика изучаемых пещер
- Численный состав и распространенность микромицетов в пещерах Средней Сибири
Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время большой интерес в мире вызывают организмы экстремальных местообитаний. К таким местообитаниям относятся в том числе пещеры - подземные полости естественного происхождения, характеризующиеся отсутствием света, постоянной пониженной температурой, высокой степенью изолированности.
Пещеры обнаружены практически во всех регионах мира, за исключением Антарктиды, пустынь и высокогорья. Всемирная база данных по пещерам содержит сведения о 1628 пещерах с суммарной протяженностью ходов около 17,4 тыс. км (World Cave Database, 2006). При этом в базе приводятся сведения только о крупнейших известных карстовых полостях мира по состоянию на 2004 г. Реальное же число пещер на нашей планете, по оценкам специалистов, может достигать 105 (Дублянский, 1998). Масштабы распространения и размеры карстовых пещер таковы, что позволяют выделять их в особую оболочку Земли - карстосферу (Маруашвили, 1970).
Исторически первые исследования в пещерах были посвящены их картографическому описанию, затем - различным аспектам геологии, минералогии и геохимии. В первой половине XX века в пещерах были начаты активные биологические исследования, которые привели к формированию нового научного направления - биоспелеологии. В настоящее время установлено, что в пещерах существуют уникальные экосистемы, в состав которых входят представители практически всех крупных таксонов живых организмов. В последние годы большой интерес к пещерным экосистемам проявляет NASA, рассматривая подземные полости в качестве модельных объектов для отработки технологии поиска жизни на других планетах (Boston, 2001).
В конце 60-х годов XX века в пещерах были начаты целенаправленные микробиологические исследования, которые в начале 90-х привели к убеждению об исключительно важной роли бактерий и грибов как в
5 функционировании подземных экосистем, так и в протекающих в пещерах
геохимических процессах. Несмотря на научные достижения в данном
направлении, вопрос о составе, биологических особенностях и экологической
роли микробных сообществ подземных карстовых полостей в настоящее время
далек от своего разрешения. Подавляющее большинство исследований
микробиоты подземных карстовых полостей выполнено за рубежом, в пещерах,
резко отличающихся по своим климатическим и геохимическим особенностям
от расположенных на территории нашей страны. Аналогичные исследования на
территории бывшего СССР крайне немногочисленны и носят случайный и
фрагментарный характер.
Настоящая работа посвящена изучению сообществ микромицетов в карстовых пещерах Средней Сибири. Полученные в ходе исследований результаты можно экстраполировать на все известняковые пещеры умеренной климатической зоны за исключением полостей, имеющих промывной водный режим.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение численности, биологического разнообразия, экологических особенностей и закономерностей распределения микромицетов в карстовых пещерах Средней Сибири.
В задачи исследования входило:
1. Изучение численности, биологического разнообразия и
пространственного распределения микромицетов в карстовых полостях,
различающихся по морфологии, геологическому строению и уровню
антропогенной нагрузки.
2. Выявление факторов, влияющих на распространенность и
биоразнообразие микромицетов в пещерах и отдельных спелеосистемах.
3. Изучение экологических особенностей микромицетов сибирских
пещер.
4. Изучение роли микромицетов в биологическом самоочищении пещер, а
также их участия в трофических связях в экосистемах сибирских пещер.
5. Разработка критериев оценки экологического состояния сибирских
пещер по численности и качественному составу населяющих их микромицетов.
6. Оценка перспектив практического использования микромицетов пещер
Средней Сибири.
Научная новизна. Впервые изучена численность и биологическое разнообразие микромицетов карстовых пещер Сибири, рассмотрены факторы, влияющие на состав сообществ микромицетов в пещерах.
Впервые показано, что в "холодных" пещерах умеренной климатической зоны одновременно присутствуют микромицеты, находящиеся на разных стадиях эволюционной адаптации к низким температурам, - от типично мезофильных до облигатно психрофильных форм. Установлено, что микробные сообщества сибирских пещер в настоящее время находятся на этапе формирования.
Разработаны критерии оценки экологического состояния пещер по численности и биологическому разнообразию обитающих в них микромицетов. Оценена роль микромицетов в биологическом самоочищении сибирских пещер, изучена скорость микробной деструкции различных субстратов антропогенного происхождения.
Установлено, что в пещерах Сибири микромицеты образуют первый трофический уровень в цепи питания. Основными потребителями грибов в сибирских пещерах являются членистоногие, в первую очередь - клещи.
Показано, что психрофильные и психротолерантные микромицеты пещер умеренной климатической зоны, не способные к росту при температуре человеческого тела, могут использоваться в создании безопасных для человека и других теплокровных биопрепаратов для борьбы с болезнями растений.
Защищаемые положения: 1. Специфические комплексы микромицетов пещер Средней Сибири, представленные грибами, находятся на разных стадиях эволюционной адаптации к низкотемпературным условиям подземной среды.
2. Численный состав и биоразнообразие микромицетов пещер определяются
интенсивностью привноса экзогенной органики и могут служить индикатором уровня антропогенного воздействия на карстовую полость.
3. Психрофильные и психротолерантные микромицеты карстовых пещер
могут быть использованы в создании безопасных для человека и других
теплокровных биопрепаратов для борьбы с болезнями растений.
Работа выполнена при частичной поддержке Красноярского краевого фонда науки и научно-образовательного центра «Енисей» (грант М0041 от 2000г.).
Практическое значение работы. Разработаны рекомендации по нормализации экологического состояния карстовых полостей Красноярского края и Хакасии, используемых в рекреационных целях. Результаты исследований использованы в работе первого подземного музея Средней Сибири - памятника природы краевого значения пещеры Караульная-2 (Акт внедрения №56 от 15.05.2005 г.), в организации просветительской работы в спелеоклубах и детских спелеолагерях (Акт внедрения №34 от 02.02.2007 г.). Психрофильные и психротолерантные штаммы антагонистов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых переданы на кафедру экологической генетики и биотехнологии.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 - в ведущем рецензируемом научном журнале и 3 - в сборниках международных конференций, 2 работы находятся в печати. Материалы исследований были представлены на X международном симпозиуме "Сохранение гомеостаза: теория, эксперименты и практика" (Новосибирск, 2001); на Общероссийской научно-практической конференции "Проблемы экологии и охраны пещер: теоретические и прикладные аспекты" (Красноярск, 2002); на юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2004); на Общероссийской научной конференции "Современные тенденции развития АПК" (Красноярск, 2005); на V Международной научно-практической конференции молодых
8 ученых Сибирского Федерального округа "Современные тенденции развития
АПК в России" (Красноярск, 2007); на международной конференции
"Ломоносов - 2007" (Москва, 2007).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134
страницах текста, содержит 47 рисунков и 9 таблиц. Работа состоит из
введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования,
результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего
ссылки на 222 источника, из которых 115 - на иностранных языках.
Происхождение и распространенность карстовых пещер
Среди пещер различного типа наибольшее распространение на нашей планете имеют карстовые пещеры, образующиеся в результате растворения и механического разрушения проницаемых растворимых (карстующихся) горных пород. Одновременно с разрушением может происходить процесс переотложения вещества, часто в виде новых минералов (например - сингенетическое карсту рудообразование). К карстующимся породам относятся карбонатные, сульфатные и соляные. Суммарная площадь, занятая обнаженными и погребенными под другими геологическими образованиями карстующимися породами оценивается в более чем 50 млн. км , что составляет около 30 % поверхности суши (Дублянский, 2000). Главное место среди карстующихся пород занимают карбонатные, на долю которых приходится до 40 млн. км2. К ним относят известняки (СаСОз), мел (СаСОз), мрамор (СаСОз или CaMg(C03)2)s а также доломиты (CaMg(C03)2). На долю сульфатных пород, представленных гипсами (CaS04 х 2НгО) и ангидритами (CaSO. ) приходится около 7 млн. км2, на долю соляных (представленных преимущественно галитом NaCl) - до 4 млн. км . Наиболее существенное отличие карбонатного карста от других литологических типов заключается в особом ходе растворения карбонатных пород (Гвоздецкий, 1972). Карбонатные породы практически растворимы только в воде, содержащей свободную углекислоту или же другие минеральные или органические кислоты. Помимо этого растворимость карбонатных пород может повышаться, если в воде содержатся некоторые соли, например NaCl. Процесс растворения известняка в воде, содержащей свободную углекислоту, представляет собой совокупность различных химических превращений, тесно связанных между собой. В основе растворения известняка лежат три процесса: диссоциация карбоната кальция на Са и СОз ; взаимодействие карбонат-иона с ионом водорода с образованием гидрокарбоната НСОз"; вынос ионов кальция и гидрокарбоната из зоны реакции подземными водами.
Необходимым условие развития пещеры, наряду с наличием карстующихся пород, является их трещиноватость. Согласно данным Д.С. Соколова (1962), по убыванию роли для карстовых процессов основные генетические категории трещин можно расположить в следующей последовательности: литогенетические, тектонические, разгрузки, выветривания. Наибольшее значение имеют литогенетические и тектонические трещины, обеспечивающие отвод воды с поверхности вглубь горных массивов, а также глубинную циркуляцию карстовых вод. Большинство авторов выделяют зону вертикальной нисходящей циркуляции и зону горизонтальной циркуляции подземных вод. Кроме этого, различают фреатические и вадозные воды. Фреатические воды - это напорные воды зоны полного насыщения, находящиеся ниже уровня грунтовых вод. Для них характерны высокое давление и сравнительно низкие скорости течения (менее 100 м/сут). Подземные полости формируются под воздействием напорной коррозии и коррозии смешивания в основном по горизонтальным трещинам напластования.
Вадозные воды расположены в зоне свободной (безнапорной) циркуляции выше постоянного уровня карстовых вод (зона аэрации). Они движутся преимущественно по раскрытым тектоническим трещинам, а также по водонепроницаемым горизонтам под действием силы тяжести со скоростями более 100 м/сут. и приводят к формированию узких ущельеобразных проходов. На пересечении вертикальных и горизонтальных трещин могут формироваться характерные гроты и ходы треугольного сечения (Максимович, 1979).
В зоне горизонтальной циркуляции карстовых вод формируются подземные полости горизонтального типа, в том числе - разветвленные пещеры-лабиринты с суммарной протяженностью ходов в десятки и сотни км. Крупнейшей подземной системой такого типа на сегодняшний момент является пещера Флинт-Мамонтова (США) с протяженностью ходов около 579 км. В зоне вертикальной циркуляции формируются вертикальные и наклонные полости. Глубочайшей карстовой полостью такого типа в настоящее время является пещера Воронья глубиной 2080 м (World Cave Database, 2006). В случае тектонического понятия или врезания дренирующих поверхностных водотоков, приводящего к снижению уровня грунтовых вод, могут формироваться многоярусные подземные системы.
После осушения подземной полости карстовые процессы в ней замедляются, однако не прекращаются. На этой стадии происходит моделирование полости за счет конденсационной коррозии, действия инфильтрационной влаги, обвалов и переотложения растворенных минералов. С момента соединения карстовой полости с поверхностью она получает название пещера.
Возраст пещеры различными авторами определяется по-разному. По Н.Г. Максимовичу, возраст пещеры соответствует возрасту ее наиболее значительных ходов (Максимович, 1979). Согласно Л.И. Маруашвили, возраст пещеры следует отсчитывать с момента потери карстовой полостью основной части водотока и начала накопления рыхлых отложений (Маруашвили, 1970). Р.А. Цыкин (Цыкин, 1985) считает целесообразным отсчитывать возраст пещеры с момента образования ее древнейшей элементарной полости. Возраст конкретных пещер, как правило, составляет от нескольких тысяч лет до нескольких десятков или даже сотен миллионов лет.
Характеристика изучаемых пещер
Для исследования численности и качественного состава микроорганизмов во всех исследуемых пещерах отбирали образцы грунта. Точки отбора проб выбирали таким образом, чтобы охватить как активно посещаемые, так и труднодоступные участки пещеры (рис.2.). Образцы помещали в алюминиевые контейнеры (бюксы), посев производили стандартными методами почвенной микробиологии не позднее трех дней со дня взятия образцов.
Учет микроскопических грибов проводили на среде Чапека с NH4NO3 в
качестве источника азота, рН среды 5.5 - 6.0, а также на сусло-агаре (Методы экспериментальной микологии, 1982; Практикум по микробиологии, 2005).
Культивирование осуществляли в холодильнике при температуре +4С. Все микроорганизмы, сформировавшие колонии при данной температуре, считали способными к росту в условиях пещеры и учитывали в качестве представителей естественной микрофлоры пещер.
Численность микромицетов учитывали с помощью метода разведений путем подсчета колоний, выросших на агаризованнои среде, и их пересчета на число колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г грунта.
Идентификация проводилась на основании морфолого-физиологических особенностей. Для этого микромицеты выделялись в чистую культуру стандартными лабораторными методами. В качестве определителей использовали (Егорова, 1986; Watanabe, 1994; Мельник, 2000; Саттон, 2001;Dr. Fungus-Fungi Descriptions; Mycology Online; Soil Fungi, 2006; Zygomycetes).
Отношение к температуре определяли, сравнивая рост грибов на тонком слое среды Чапека на предметных стеклах при +4...+15...+27С.
Амилолитические свойства микромицетов определяли посевом на питательную среду следующего состава (на 0,5 л дистиллированной воды): NaN03 - 1 г, КС1 - 0.25 г, MgS04 - 0.25 г, КН2Р04- 0.5 г, крахмал -10 г, FeS04 -следы, агар -10 г, рН среды - 6. Культивирование проводили в чашках Петри в течение 7 - 10 суток при температуре +10 - +16 С. По окончании данного срока чашки обрабатывали раствором Люголя. При этом зоны гидролиза крахмала проявлялись как светлые участки на фоне окрашивающейся в сине-фиолетовый цвет среды. По их величине, относительно размеров колонии, характеризовали амилолитическую активность изолята.
Для выявления протеолитической активности выделенные изоляты высевали на МПЖ с содержанием желатины 10 - 15 %. МПЖ разливали в пробирки по 10 мл. Посев проводили уколом. Продолжительность культивирования 15 суток при +10С. Протеолитическую активность регистрировали по разжижению желатины (Методы..., 1982; Руководство ..., 1995).
Содержание органического углерода определяли мокрым сжиганием по Тюрину (Аринушкина, 1970).
Оценку антибиотической активности изучаемых грибов проводили по степени подавления прорастания конидий Bipolaris sorokiniana культуральным фильтратом выбранных изолятов. Выбранные изоляты культивировали на жидкой среде Чапека при температуре +25С в течение 5 дней. Конидии В. sorokiniana помещали в каплю культурального фильтрата и после инкубирования в течение 2,5 часов при температуре +25С подсчитывали количество проросших конидий под микроскопом. В качестве контроля использовали стерильную среду Чапека.
Математическую обработку полученных результатов проводили стандартными статистическими методами (Ахназарова, Кафаров, 1978; Поллард, 1982; Любищев, 1986), а также с использованием с использованием методов многомерной статистики (Иберла, 1980; Жамбю, 1988; Айвазян, 1989). В качестве программного обеспечения использовали пакет анализа, входящий в состав MS Excel 2003 и математический пакет StatSoft Statistica 6.0.
Для характеристики структуры комплексов микромицетов рассчитывали индексы таксономического сходства Жаккара, Дейка, Роджерса и Танимото (Wilhm and Dorris, 1968; Sladechek System, 1973).
Численный состав и распространенность микромицетов в пещерах Средней Сибири
Таким образом, можно утверждать, что основным фактором, определяющим численность микромицетов в грунте сибирских пещер, в настоящее время является уровень антропогенной нагрузки. При этом спелеотуристы и другие посетители пещер не только обеспечивают приток необходимой для развития микромицетов органики, но и, очевидно, участвуют в распространении спор и конидий по пещере. Об этом, в частности, свидетельствует повышенная численность микромицетов в образцах фунта, собранных на подземных тропах (см. рис.8).
Известно, что численность микроскопических грибов в лесных почвах Урала и Сибири составляет 0,1-8,7x104 КОЕ (Богородская, 2006; Сентябова, 2006; Сорокина, 2006), а в почвах агроценозов 2,1-5,1x104 КОЕ (Полонская, 2000; Сорокина, 2006). Таким образом, максимальная зафиксированная нами численность микромицетов (3,6x106 КОЕ на 1 г. грунта) в сибирских пещерах более чем в 40 раз превышает аналогичный показатель для лесных почв региона. В целом же для пещер Сибири (за исключением труднодоступных и малопосещаемых спелеосистем) характерна численность микромицетов, не уступающая их численности в лесных почвах и почвах агроценозов, либо превосходящая этот показатель на 1-2 порядка.
Это можно объяснить относительно низкой конкуренцией за субстрат в подземных экосистемах. В отличие от почвенных биогеоценозов, характеризующихся высоким показателем разнообразия видов и к жесткой межвидовой конкуренцией за доступные источники питания, практически единственными потребителями экзогенного органического вещества в пещерах являются микроорганизмы. При этом, вероятно, происходит разделение экологических ниш между грибами и бактериями по используемым субстратам.
По нашим наблюдениям, основными субстратами для микромицетов в пещерах являются свечной парафин, обрывки бумаги, древесина, фекалии, волосы, шерсть и другие высокомолекулярные субстраты на которых грибы, как правило, выигрывают конкуренцию у бактерий (Мюллер Э., Леффлер В., 1995). Кроме этого, грибы в пределах пещеры осваивают такие субстраты, на которые в почвенном биогеоценозе претендовать бы не смогли. К таким субстратам, например, можно отнести трупы животных (рис.10), которые в наземном биогеоценозе утилизируются преимущественно некрофагами.