Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы... 21
1.1. Загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами 21
1.2. Микробная деградация нефтяных углеводородов 25
1.2.1. Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов и их физиологические особенности 25
1.2.2. Бактерии рода Rhodococcus, их экологическое значение и генетическая организация 32
1.2.3. Пути микробной деструкции нефтяных углеводородов 40
1.3. Технологии ремедиации нефтезагрязнённых почв 49
1.3.1. Микробная очистка почв от углеводородного загрязнения 53
1.3.2. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязнённую почву: проблемы и перспективы 59
1.3.3. Методы контроля биоремедиации 77
1.4. Влияние нефтяного загрязнения на ферментативную активность почв. Использование показателей активности почвенных ферментов для мониторинга технологий биоремедиации 82
ГЛАВА 2. Материалы и методы 97
2.1. Микроорганизмы 97
2.2. Среды 99
2.3. Методы изучения биологических и деструктивных свойств штаммов 100
2.4. Методы генетических исследований 106
2.5. Условия проведения лабораторных и микрополевого экспериментов по биоремедиации нефтезагрязнённых почв и методы исследований, применяемые в этих экспериментах 110
2.6. Методы оценки токсичности почвы 118
2.6.1. Определение токсичности почвы по дегидрогеназной активности бактерий 118
2.6.2. Метод определения фитотоксичности почвы 119
2.7. Методы мониторинга и количественной оценки бактерий
D. maris АМЗ, интродуцированных в нефтезагрязнённую почву 120
ГЛАВА 3. Изучение ряда биологических и функциональных особенностей кислотоустойчивых углеводородокисляющих штаммов 123
3.1. Морфологические и физиолого-биохимические характеристики исследованных штаммов 123
3.1.1. Морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма D. maris АМЗ 125
3.1.2. Оценка чувствительности штамма!), maris АМЗ к различным антибиотикам 128
3.2. Рост исследованных штаммов в жидкой питательной среде в интервале рН 130
3.3. Субстратный'спектр штаммов-деструкторов нефтяных
углеводородов 133
ГЛАВА 4. Исследование генетических особенностейкис лотоустойчивых углеводородокисляющих штаммов 142
4.1. Плазмидный скрининг углеводородокисляющих штаммов 142
4.2. Генетическая природа свойства биодеградации углеводородов нефти у штамма D. maris АМЗ 144
4.2.1. Стабильность свойства биодеградации нефтяных углеводородов у штамма D. maris АМЗ в условиях культивирования на неселективных питательных средах и при действии элиминирующих агентов 144
4.2.2. Генетический перенос признака деструкции нефтяных углеводородов у штамма D. maris АМЗ 155
4.3. Генетические особенности ацидотолерантности и деструктивной активности у исследованных штаммов 161
ГЛАВА 5. Исследование возможности использования углеводородокисляющих кислотоустойчивых штаммов для ремедиации нефтезагрязнённой почвы ... 165
5.1. Изучение процессов ремедиации нефтезагрязнённой почвы на основе интродукции штамма Bacillus sp. УН2/5 165
5.2. Микробиологические аспекты интродукции штамма!), maris АМЗ в нефтезагрязнённую почву 170
5.2.1. Определение конкурентной способности штамма!), maris АМЗ по отношению к аборигенным УОМ 171
5.2.2. Динамика развития нефтеокисляющего штамма!), maris АМЗ в почве в процессе биоаугментации 173
5.2.2.1. Разработка метода слежения за интродуцированными бактериями в почве 173
5.2.2.2. Оценка возможности применения иммуноферментного анализа для количественного определения содержания штамма!), maris АМЗ, внесённого в почву 177
5.2.2.3. Изучение динамики численности интродуцированного штамма в почве в процессе биоаугментации методом твердофазного иммуноферментного анализа и микробиологическим методом 179
5.3. Изучение реизолятов штамма D. maris АМЗ после его
культивирования на углеводородных субстратах 192
5.3.1. Оценка показателя гидрофобности клеток и эмульгирующей активности у реизолятов штамма D. maris АМЗ 193
5.3.2. Деструкция нефтяных углеводородов реизолятами штамма D. maris АМЗ 196
5.3.3. Исследование ряда биологических свойств у реизолятов штамма D. maris АМЗ 197
ГЛАВА 6. Сравнение эффективности самоочищения нефтезагрязнённой почвы и технологий биоремедиации на основе интродукции штамма d. maris амз и стимуляции естественных микробных сообществ 203
6.1. Динамика развития микробных сообществ в нефтезагрязнённой почве в процессе самоочищения, стимуляции и аугментации 203
6.1.1. Изменение общей численности гетеротрофных микроорганизмов в процессах очистки нефтезагрязнённой почвы 203
6.1.2. Изменение численности углеводородокисляющих микроорганизмов в процессах очистки нефтезагрязнённой почвы 209
6.1.3. Динамика численности микроорганизмов азотного цикла в процессах очистки нефтезагрязнённой почвы 215
6.2. Изменение показателей биологической активности почвы в процессе ремедиации. Оценка возможности использования этих показателей для мониторинга процессов очистки 221
6.2.1. Динамика почвенного дыхания 223
6.2.2. Динамика активности ферментов в нефтезагрязнённой почве при самоочищении и при использовании биоремедиационных приёмов 225
6.3. Оценка токсичности почвы после ремедиации 244
6.4. Изменение содержания нефтепродуктов в ходе ремедиации 255
6.5. Изменение ряда агрохимических показателей в процессе
ремедиации загрязнённого грунта . 262
ГЛАВА 7. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путём стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры 273
7.1. Условия проведения экспериментов 274
7.2. Получение жидкой и твёрдой обогащенной культуры 276
7.3. Апробация эффективности полученных «биопрепаратов» для ускорения очистки загрязнённых объектов 281
Заключение ".: 286
Выводы 298
Список использованной литературы
- Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов и их физиологические особенности
- Условия проведения лабораторных и микрополевого экспериментов по биоремедиации нефтезагрязнённых почв и методы исследований, применяемые в этих экспериментах
- Морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма D. maris АМЗ
- Генетическая природа свойства биодеградации углеводородов нефти у штамма D. maris АМЗ
Введение к работе
Актуальность исследований. В настоящее время в результате антропогенной деятельности происходит широкомасштабное загрязнение окружающей среды токсичными веществами. Нефть и нефтепродукты признаны основными загрязнителями окружающей среды (Eurosoil 2008). Потери нефти и нефтепродуктов в России при добыче, транспортировке, переработке и хранении по официальным данным оцениваются в 8-9 млн т в год. Особую нагрузку при этом испытывает почва, что проявляется в ухудшении её морфологических и физико-химических свойств, угнетении самоочищающей способности и негативных изменениях развития и функциональной активности организмов почвенного биоценоза (Пиковский и др., 2003; Stroud et al., 2007). Аварийные и хронические разливы нефти приводят к быстрой потере продуктивности земель или полной деградации ландшафтов. Ограниченность земельных ресурсов ставит неотложную задачу возврата в хозяйственное использование всех нарушенных и деградированных почв (Бурмистрова, 2003).
Поскольку на современном уровне развития нефтяной промышленности не представляется возможным полностью исключить её негативное воздействие на окружающую среду, возникает необходимость разработки методов и технологий восстановления почв, загрязнённых нефтяными углеводородами (Сулейманов и др., 2005). Экологически перспективными являются микробиологические способы очистки от нефтезагрязнений, основанные на стимулировании роста и активности природных микроорганизмов (био стимуляция) или внесении в почву селекционированных микроорганизмов-деструкторов (биоаугментация) (Нечаева и др., 2009; Киреева и др., 2009; Mishra et al., 2001; Wilkinson et al., 2002; Ouyang et al., 2005).
В связи с тем, что деструкция нефти в окружающей среде - сложный многофакторный процесс, на который оказывают влияние физико-химический состав, концентрация и срок действия загрязнителя, почвенно-климатические и биологические особенности экосистемы и другие факторы, сведения по этой проблеме нередко противоречивы.
При разработке приёмов микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв, выборе оптимального способа очистки необходим комплексный подход. Анализ изменений, происходящих в микробных сообществах нефтезагрязнённых почв, путём определения численности микроорганизмов различных физиологических групп, выделения и идентификации микроорганизмов-деструкторов углеводородов, изучения почвенной биодинамики на основании оценки активности ферментов в почве и определения интенсивности почвенного «дыхания», исследования динамики агрохимических показателей почвы с параллельным химическим анализом остаточного содержания в ней нефтяного загрязнителя и оценкой степени её токсичности, позволит разработать параметры микробиологических процессов в нефтезагрязнённых почвах, при которых нарушенные почвы возвращаются в устойчивое состояние.
Несмотря на многочисленные исследования микроорганизмов-деструкторов нефтяных углеводородов в окружающей среде, механизмы их функционирования в экстремальных условиях, например, в кислых почвах, обусловленных естественными или антропогенными факторами, которых немало на территории России и других стран (Широких, 2004; Орлов и др., 2005; Rothschild, Mancinelli, 2001), изучены
недостаточно. Многие экологические аспекты проблемы биоаугментации, касающиеся жизнеспособности и активности интродуцированных микроорганизмов в почве, их взаимоотношений с аборигенным микробоценозом, требуют всестороннего изучения. В связи с этим, разработка высокоспецифичных и чувствительных мониторинговых методов для идентификации внесённых в почву бактерий особенно актуальна.
Кроме того, для реализации принципов и практических мер, направленных на охрану почв, необходимо разработать оптимальные методы биотестирования, позволяющие построить наиболее полную картину деградации почв, получить интегральную токсикологическую характеристику загрязнённой среды до и после очистки, и, следовательно, оценить эффективность приёмов биоремедиации.
Цель и задачи исследований. Цель работы - выявление особенностей функционирования естественных микробных сообществ нефтезагрязнённых почв и интродуцированных в почву специализированных микроорганизмов при использовании приёмов биоремедиации.
Для достижения поставленной цели были определены задачи:
-
Исследовать биологические и эколого-функциональные свойства микробного сообщества нефтешлама с низким значением рН. Изучить генетические особенности кислотоустойчивых углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтешлама.
-
Провести сравнительную оценку жизнеспособности и динамики развития микроорганизмов Dietzia maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 при их интродукции в загрязнённые нефтью кислые и нейтральные почвы. Изучить стабильность свойств реизолятов штамма D. maris АМЗ.
-
Исследовать влияние интродукции нефтеокисляющих микроорганизмов на характер микробиологических и биохимических процессов в загрязнённой почве и деструкцию нефтяных углеводородов.
-
Разработать и апробировать иммунохимические методы анализа для мониторинга штамма D. maris АМЗ в нефтезагрязнённой почве в процессе биоремедиации.
-
Провести сравнительное исследование функционирования микробных сообществ почвы с разным сроком нефтяного загрязнения при самоочищении и использовании приёмов биостимуляции и биоаугментации.
-
Выявить оптимальные показатели для мониторинга процессов микробной ремедиации почв и разработать метод биотестирования для оценки уровня токсичности почвы после очистки.
-
Разработать и апробировать оригинальный способ активизации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки нефтезагрязнённой почвы и воды.
Научная новизна. Впервые из микробного сообщества, существующего в экстремальных условиях нефтешлама (рН 1,15), выделены и изучены 13 штаммов бактерий, идентифицированные как Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp., способные к деструкции углеводородов в широком диапазоне рН. Получены доказательства плазмидной локализации генов, детерминирующих свойства биодеградации нефтяных углеводородов и апидотолерантности у данных штаммов, что может обеспечить преимущества микроорганизмов сообщества при существовании в экстремальных условиях. Впервые подробно изучен и охарактеризован штамм D. maris АМЗ как эффективный и стабильный деструктор
алкановых и ароматических углеводородов в широком диапазоне рН (4-9) и температуры (10-40С), обладающий эмульгирующей активностью по отношению к нефтепродуктам и содержащий трансмиссивную плазмидную ДНК. Установлено, что после культивирования штамма на углеводородных субстратах увеличивается гидрофобность его клеток и нефтеокисляющая активность.
Разработаны иммунохимические методы анализа для выявления и количественной оценки штамма D. maris АМЗ в нефтезагрязнённой почве в процессе биоремедиации. Установлены особенности развития интродуцированных микроорганизмов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 в нефтезагрязнённых кислых и нейтральных почвах, подтверждена их высокая конкурентная способность по отношению к микроорганизмам естественных почвенных сообществ, жизнеспособность и нефтеокисляющая активность. С помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что максимальное развитие штамма D. maris АМЗ в почве происходит через 7-14 сут. интродукции и зависит от свойств почвы и загрязнителя.
На основании выявленных особенностей функционирования естественных микробных сообществ загрязнённых почв и интродуцированных нефтеокисляющих микроорганизмов разработаны научные основы применения и совершенствования технологий микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв. Научно аргументирована и экспериментально доказана перспективность использования штаммов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 для очистки почв со свежим нефтяным загрязнением, которые не только ускоряют очистку в два раза в течение первого месяца ремедиации по сравнению с приёмом стимуляции, но также повышают биологическую активность почвы и способствуют снижению её токсичности. Установлено, что эффективность ремедиации при стимуляции естественного микробного сообщества почвы со свежим нефтяным загрязнением выше, чем при самоочищении, что выражается в увеличении степени деструкции нефтяных углеводородов и биологической активности почвы и снижении её токсичности. В случае многолетнего загрязнения показана одинаковая убыль нефтяных углеводородов при стимуляции аборигенной микрофлоры и интродукции штамма D. maris АМЗ, который на определённых этапах ремедиации повышает биологическую активность и снижает токсичность почвы.
Выявлены диагностические показатели по ферментативной активности для оценки эффективности апробируемых биоремедиапионных приёмов. Разработан метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий. Предложена новая комбинация добавок, стимулирующих развитие аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы, для получения биопрепаратов в виде почвенной суспензии.
Практическая значимость. Выделенные и охарактеризованные
ацидотолерантные нефтеокисляющие бактерии Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp. могут быть использованы для ремедиации нефтезагрязнённых почв с повышенной кислотностью. Бактериальные культуры D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 могут быть рекомендованы для ускорения и улучшения очистки почвы от свежего нефтяного загрязнения. Высокая жизнеспособность, конкурентоспособность и углеводородокисляющая активность позволяет применять эти штаммы в условиях, когда естественное микробное сообщество почвы малочисленно или не способно полноценно функционировать. Для очистки почв с многолетним загрязнением
разработан способ стимуляции аборигенной микрофлоры путём внесения минерального удобрения, структуратора, ПАВ и использования агротехнических приёмов. Результаты по способам очистки почвы от нефтяных загрязнений защищены двумя патентами РФ.
Метод твердофазного ИФА может быть рекомендован для практического применения при проведении биоремедиационных работ в качестве способа учёта численности интродуцированных микроорганизмов. Анализ показателей активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз может быть использован для оценки эффективности приёмов биоремедиации. Предложен метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий. Разработан способ получения и использования биопрепаратов в виде почвенной суспензии, основанный на активизации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы.
Результаты исследования применяются при проведении лекционных и практических занятий по курсу «Экологическая токсикология», «Механизмы обезвреживания токсичных соединений», подготовке курсовых и дипломных работ в ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» и ИБФРМ РАН. Материалы диссертации использованы при подготовке учебно-методических пособий: «Руководство к практическим занятиям по экологической токсикологии» (Саратов, 2006); «Общая биология: Материалы к гос. аттестации выпускников по спец. 011600 - «Биология»» (Саратов, 2006); «Экология. Материалы к государственной аттестации выпускников по специальности - «Экология»» (Саратов, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В состав микробного сообщества нефтешлама с экстремальной кислотностью (рН 1,15) входят микроорганизмы Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp., осуществляющие деструкцию нефтяных углеводородов в кислой и нейтральной среде. Свойства ацидотолерантности у бактерий Corynebacterium spp. и деградации нефтяных углеводородов у D. maris АМЗ, детерминируемые плазмидными генами, способствуют устойчивому функционированию микробного сообщества нефтешлама.
-
Штамм D. maris АМЗ обладает рядом функциональных и экологических преимуществ, связанных со способностью к существованию в широком диапазоне рН и температуры, наличием биоэмульгирующей и деструктивной активности по отношению к алкановым и ароматическим углеводородам нефти и присутствием трансмиссивной катаболической плазмиды, характеризующейся высокой стабильностью. Адаптационным механизмом при культивировании D. maris АМЗ на углеводородах является увеличение гидрофобности его клеток.
-
Интродуцированные микроорганизмы D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 характеризуются высокой жизнеспособностью в нефтезагрязнённых кислых и нейтральных почвах, они ускоряют очистку почв от свежего нефтяного загрязнения, повышая численность гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов в естественном сообществе, интенсифицируя биологическую активность почвы и снижая её токсичность.
-
Для выявления D. maris АМЗ в почве в процессе биоремедиации и количественной оценки динамики его численности применимы иммунохимические методы анализа. С помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа установлено, что при интродукции штамма D. maris АМЗ в почву, его максимальное
развитие происходит через 7-14 суток (на 1-3 порядка в зависимости от свойств почвы и загрязнителя).
-
Способ стимуляции естественного микробного сообщества в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением имеет существенные преимущества по сравнению с самоочищением. В случае многолетнего загрязнения показана одинаковая убыль нефтяных углеводородов при стимуляции аборигенной микрофлоры и интродукции штамма D. maris АМЗ.
-
Показатели активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз отражают направленность процессов биодеградации нефтяных углеводородов, обусловленных развитием и активизацией аборигенных и интродуцированных микроорганизмов в почве, и могут быть использованы для оценки эффективности приёмов биоремедиации. Показатель дегидрогеназной активности бактерий может использоваться для тестирования токсичности очищенной почвы.
-
Активизация аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы с помощью стимулирующих добавок обеспечивает получение эффективных биопрепаратов в виде почвенной суспензии для использования в процессе биоремедиации.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в виде стендовых и устных сообщений на Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия, экология, проблемы» (Пермь, 1996); II International Symposium on Biosorption and Bioremediation (Prague, Czech Republic, 1998); 9th European Congress on Biotechnology (Brussels, Belgium, 1999); 7th и 8th International FZK/TNO Conference on Contaminated Soil (Leipzig, Germany, 2000; Gent, Belgium, 2003); II и V съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2009); 91 International Symposium on Microbial Ecology (Amsterdam, The Netherlands, 2001); конференции «Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды» (Пущино, 2001); Xі International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Paris, France, 2002); 3rd International Conference OIL POLLUTION: Prevention, Characterization, Clean Technology (Gdansk, Poland, 2002); I-IV межрегиональных конференциях молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2002, 2004, 2006, 2008); Всероссийских научно-практических конференциях, посвященных 115-летию и 117-летию со дня рождения академика Н.И.Вавилова (Саратов, 2002, 2004); I-III Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005); International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants (Saratov, Russia, 2003); II Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004); Международной научной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань, 2005); Всероссийской Молодёжной школе-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Москва, 2005); Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, 2006); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); EGU General Assembly (Vienna, Austria, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологии» (Москва, 2008); IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009); IV
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); Первых Международных научно-практических Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010); XXII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); II Всероссийской научной интернет-конференции «Научное творчество XXI века» с международным участием (2010); совместном заседании лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики СГУ (2005-2010 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, из них 10 публикаций в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, включая два патента РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 443 источника. Диссертация изложена на 358 страницах машинописного текста, включая приложение, содержит 85 рисунков и 29 таблиц.
Работа выполнена в лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Исследование взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (№ гос. регистрации 01.9.90 003293, научный руководитель зав. лаб. профессор, д.б.н. Турковская О.В.) и кафедре биохимии и биофизики СГУ по заданию Минобразования и науки РФ по теме «Исследование влияния биотических и абиотических факторов на структуру и функционирование экосистем и популяций» (научный руководитель зав. каф. ботаники и экологии СГУ профессор, д.б.н. Болдырев В.А.). Работа поддержана Грантом Президента РФ № МК-1968.2003.04.
Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность научному консультанту
профессору, д.б.н. Турковской О.В., сотрудникам лаборатории экологической
биотехнологии ИБФРМ РАН и особенно: к.б.н. Дубровской Е.В. за проведение
совместных микрополевых исследований, к.б.н. Поздняковой Н.Н. за совместную
разработку оригинального способа активизации аборигенных
углеводородокисляющих микроорганизмов, к.б.н. Голубеву С.Н. за помощь в проведении генетических исследований, а также д.б.н. Матора Л.Ю., к.б.н. Бурыгину Г.Л., к.х.н. Макарову О.Е. и коллегам с кафедры биохимии и биофизики СГУ.
Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов и их физиологические особенности
Исследования показали, что разветвлённые структуры- менее пригодны для роста микроорганизмов, чем неразветвлённые (Schaebber et al., 1979; Vinas et al., 2002). При выращивании микроорганизмов на изоалканах обнаружено, что использование ими определённого углеводорода в качестве единственного источника углерода и энергии зависит от числа ответвлений и степени ветвления. Увеличение длины ответвлений или смещение ветви к середине цепи так же как и увеличение числа ответвлений в цепи алкана или у определённого углеродного атома, снижало его пригодность для роста микробов.
Алканы с чётным, числом метильных групп разлагаются хуже, чем с нечётным. Имеет значение и расположение ответвлённой цепи. Если между ответвлениями и конечной метильной группой расстояние менее четырёх углеродных атомов, то такие соединения окисляются- плохо. Равно и замещение водорода- более длинной группой, чем метильная, также повышает устойчивость соединениям микробиологическому воздействию (Карасевич, 1982).
Некоторые микроорганизмы, окисляя длинноцепочечные «-алканы до частично окисленных продуктов, осуществляют далее их синтез с другими веществами — промежуточными продуктами окисления, тех же н-алканов, углеводами (Ягафарова, 2001).
Выделяют три возможных пути окисления w-алканов (Abbott, Casida, 1968; Yemashova et al., 2007): 1) монотерминальное окисление метильной группы с образованием спирта, альдегида и монокарбоновой кислоты; 2) монотерминальное окисление с образованием через вторичный спирт метилкетона; 3) дитерминальное окисление, при котором терминальные группы н-алканов окисляются одновременно или последовательно с образованием жирных дикарбоновых кислот (Галимов и др., 2007; Broadway et al., 1993). На рис. 1.2 представлены периферические пути деградации я-алканов по данным W. Fritsche и М. Horitcher (1999). С -ССНУп-СНг-С л-Alkane
Данные о путях микробного окисления нафтенов весьма ограничены и противоречивы. Сначала считали, что нафтеновые углеводороды очень легко окисляются бактериями и плесневыми грибами, а какой-либо алифатический заместитель в кольце ещё более способствует лабильности молекулы. Более поздние исследования показали, что нафтеновые углеводороды являются более жёсткими субстратами, чем алканы, и для их окисления микроорганизмам-деструкторам (Gordonia, Xanthobacter), требуются более сложные ферментные системы (Войно, 2006).
Долгое время попытки выделить монокультуры, способные к росту на циклических углеводородах как единственном источнике углерода и энергии, оставались безуспешными. Позднее появились сведения о том, что циклические углеводороды способны активно разрушаться в процессе микробного метаболизма и кометаболизма (Magor et al., 1986). Так показано, что у многих микроорганизмов циклогексан и циклопентан не индуцируют образования ферментов, необходимых для их усвоения, чем объясняется их устойчивость к микробному воздействию. Однако присутствие в среде культивирования подвергающегося окислению н-алкана способствовало гидроксилированию кольца циклического углеводорода. Описано окисление декалина культурами бактерий, принадлежащими к родам Pseudomonas, Mycobacterium (Vitale, Viale, 1994),- была выделена чистая культура Pseudomonas aeruginosa, окисляющая циклогексан (de Klerk, van der Linden, 2004). В процессе окисления алициклических углеводородов происходит образование из циклопентана циклопентанола , из циклогексана циклогексанола, а из циклогептана циклогептанола (Yemashova et al., 2007). Путь деградации, циклоалканов в настоящее время хорошо изучен и представлен на рис 1.3.
Арены гораздо устойчивее к микробиологическому окислению, чем парафины и нафтены- вследствии термодинамической стабильности бензольного кольца (Хоменков и др., 2008). Тем не менее, уже в начале прошлого века были обнаружены бактерии, разрушающие толуол и ксилол. В настоящее время штаммы микроорганизмов, окисляющих моноароматические углеводороды, относят к родам: Pseiidomonas, Microccocus, Xantomonas, Candida, Torulopsis, Mycobacterium и Nocardia (Smith, 1990; Haddock, 2010). Устойчивость аренов к микробиологическому окислению так же, как и других углеводородов, главным образом определяется структурой молекулы. Описан ряд закономерностей, которым подчиняется- процесс биоразлагаемости ароматических углеводородов и их алкилзамещённых: 1 — наличие боковых цепей у ароматических углеводородов делает их более подверженными микробному окислению, причём, чем длиннее цепь, тем она, легче окисляется; 2 -структуры с разветвлёнными цепями более устойчивы, чем алкилбензолы с прямыми цепями; 3 - наличие в структуре молекулы четвертичного углеродного атома может придавать соединению устойчивость; 4 — симметричность молекулы также придает ей устойчивость к микробному окислению; 5-е увеличением числа колец растёт склонность молекулы к разрушению.
Наиболее подробно изучена утилизация алкилзамещённых ароматических соединений. Для этой группы углеводородов известны два пути метаболизма (Карасевич, 1982). В первом случае метальные группы, последовательно окисляются в карбоксильные. В результате окисления боковой алкильной цепи фенилалканов с чётным числом атомов углерода образуется фенилуксусная кислота. При окислении алкильной цепи с нечётным числом углеродных атомов происходит образование бензойной кислоты. Путь метаболизма толуола, ди- и триалкилбензолов также начинается с окисления метальной группы до карбоксильной и включает образование замещённых катехолов перед расщеплением ароматического кольца (рис. 1.4). Установлено, что при аэробном процессе биодеградации перифирические метаболические пути педставляют собой реакции оксигенирования, осуществляемые монооксигеназами
Условия проведения лабораторных и микрополевого экспериментов по биоремедиации нефтезагрязнённых почв и методы исследований, применяемые в этих экспериментах
При периодическом культивировании штамма на минеральной среде с гексадеканом (1,0%) определяли оптическую плотность бактериальной суспензии путем измерения на фотоколориметре КФК-2 при А. 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см через 1, 3 и 7 сут. культивирования. Концентрацию бактериальной биомассы определяли весовым методом. Для этого культуральную жидкость пропускали через мембранный фильтр «Владипор» (размер пор 142 мм), дважды промывая физиологическим раствором в ходе фильтрации. Собранную биомассу высушивали до постоянной массы и взвешивали. По полученным результатам рассчитывали прирост биомассы в г/л (Стабникова и др., 1995).
О деструкции толуола судили- на основании данных, полученных с помощью УФ-спектрофотометрии (Осипов, Белова, 1968). Через 7 сут. культивирования изучаемых бактерий в жидкой среде с толуолом в качестве единственного источника углерода и энергии проводили его экстракцию хлороформом. В колбу добавляли 3 мл экстрагента и встряхивали в течение 5 мин на встряхивателе. Экстракцию повторяли трижды, собирая экстракты в мерные пробирки. Затем экстракты осушали безводным Na2S04, доводили общий объём до 10 мл растворителем. Подготовленные образцы анализировали» на спектрофотометре СФ-26 или Evolution 60, измеряя УФ-спектры при; длине волны, Х=263 нм в. кварцевых кюветах с длиной; оптического пути Г см. О деструкции- углеводорода судили? по остаточной концентрации субстрата в среде.
Эмульгирующую активность штаммов и-; их вариантов определяли методом Купера (Cooper, Goldenberg, 1987). Выращивали культуры в течение 5 сут. в жидкой солевой среде М9 с добавлением углеводородного субстрата в качестве единственного источника углерода и энергии (20 г/л — глицерина или дизельного топлива). После, культивирования клетки из культуральной среды отделяли центрифугированием: в течение Юминшри 8 тыс. об/мин и-дополнительной фильтрациейs с помощью: бумажных фильтров: Супернатант исследовали на: наличие: экзогенной; эмульгирующей активности по отношению к сырой: нефти-. Для этого1 по 3 мл супернатанта- вносили .в? .биологические пробирки, добавляли-по 2 мл нефти,:и встряхивали в течение 205мин$для;получения}эмульсии; При.измеренйжэндогенношэмульгирующеш активности культуральнуюсреду не:центрифугировали:.
После этого пробирки; оставляли в? вертикальном; положении при комнатной температуре, измеряя-эмульгирующую активность через 24! (Е24) и, через ;48(Е48) часов. Эмульгирующую1 активность рассчитывали в процентах, как отношение объёма эмульсии-Щэ, мл) к общему объёму жидкости (V, мл); умноженному на 100 процентов; используя формулу: Е24;48- э/\ х100 ще = 5мл .
Для изучения гидрофобностш клеток у штамма D; maris АМЗ и его реизолятов і применяли метод Е.В;. Серебряковой с соавт. (2002), который основан на адсорбции бактериальных клеток на поверхности капель хлороформа.
Выращивали изучаемые культуры на МПА в течение 5 сут. Затем готовили водные бактериальные суспензии, оптическая плотность которых составляла 0,1 -0,2 ед. при длине волны А,=670;нм. Измерения: производили на
КФК-2 в кювете с длиной оптического пути 1 см. Отбирали в пробирки с притёртыми пробками по 4 мл суспензии, добавляли 1 мл хлороформа, и встряхивали содержимое в течение 15 мин на встряхивателе. При-этом, чем большей гидрофобностью обладают клетки, тем более полно они уходят в углеводородную фазу (хлороформ). После этого выдерживали пробирки в вертикальном положении в течение Г ч для разделения фаз. Затем на КФК-2 измеряли оптическую плотность бактериальной суспензии после встряхивания. Показатель гидрофобности (ПГ) рассчитывали по формуле:
Эксперименты по изучению спонтанной элиминации свойств деструкции нефтяных углеводородов И ацидотолерантности у штаммов осуществляли следующим образом. Проведя пять-шесть пассажей на полноценных средах, изучаемую культуру подвергали популяционному анализу, суть которого сводилась к проверке 500 клонов на деструктивную активность по отношению к углеводородам нефти или на способность к росту при пониженных значениях рН питательной среды.
Для этого проводили-высев на МПА стократных- разведений культуры в физиологическом растворе. Через 3-4 сут. выросшие колонии переносили с помощью стерильных спичек на чашки с селективной средой, содержащей сырую нефть в качестве единственного источника- углерода и энергии. На каждой чашке размещалось по 50 колоний. Через несколько суток проводили выявление зон деструкции на селективной среде. Клоны, выросшие на селективной среде, затем проверяли на способность к росту в L-бульоне при рНЗ,0.
Морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма D. maris АМЗ
Через 14 сут. культивирования количество клеток D. maris АМЗ по данным ИФА соответствовало 2,24x10 КОЕ/г почвы, т.е. численность штамма увеличивалась в ходе ремедйации в 5,8 раз. Через 7 и 30 сут. данного модельного эксперимента количество антигена в почве соответствовало концентрации бактериальных клеток 1,12x108 КОЕ/г почвы. Таким образом, через 7 сут. эксперимента количество выявляемого антигена и, соответственно, бактериальных клеток D. maris АМЗ, возрастало, достигая через 14 сут. максимальных величин и снижаясь через 30 сут. до значений, характерных для 7-х сут. (рис. 5.14).
Итак, при разработке современного надёжного и эффективного способа для мониторинга бактерий D. maris АМЗ, интродуцированных в загрязнённую почву с целью её ремедиации; впервые в эксперименте Э1.2. была продемонстрирована высокая эффективность твердофазного ИФА.
Результаты обнаружения исследуемого штамма D. maris АМЗ с помощью ИФА непосредственно в почвенных суспензиях, минуя стадию» высева бактерий на питательную среду, осуществляемого через определённые интервалы в течение 30 сут. культивирования, свидетельствовали о том, что с помощью данного подхода можно не только детектировать конкретный штамм, но и количественно оценивать динамику его развития в почве.
Недостатком данного эксперимента Э1.2. явилось отсутствие данных по содержанию изучаемого штамма-интродуцента в почве, определяемому с помощью микробиологического анализа. Этот недостаток был устранён в последующих экспериментах: микрополевом Э2. и лабораторном Э1.3., что позволило сопоставить результаты изучения динамики развития штамма D. maris АМЗ в почве, полученные разными методами оценки, а также сравнить динамику развития интродуцента в разных почвах.
На рис. 5.15 представлена1 динамика выявления специфического антигена штамма D. maris АМЗ в процессе ремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением эксперимента Э1.3. Данная.почва отличалась от чернозёма южного, используемого в эксперименте Э1.1., пониженным содержанием органических и минеральных элементов, т.к. эта почва ранее использовалась в опытах с растениями Сравнивая данные двух лабораторных экспериментов (Э1.2. и Э1.3.), можно отметить сходные тенденции» Несмотря на различные подтипы почв (табл. 2.2), в эксперименте Э1.3. максимальное количество специфического антигена обнаруживалось также через 14 сут. аугментации. Через 30 сут. количество антигена уменьшалось, приближаясь к таковому в момент внесения бактерий в почву (0 сут.). Отличие эксперимента Э1.3. от Э1.2. — количество специфического антигена через 7 и 14 сут. практически совпадало, что свидетельствовало о более быстром развитии штамма
Как видно из рисунка 5.16, максимальное развитие штамма-деструктора в почве происходило через 7-14 сут. после внесения. В этот период наблюдались некоторые различия по содержанию клеток D. maris АМЗ в почве, оцененному с помощью двух различных методов. В соответствии с результатами микробиологического анализа максимум развития штамма приходился на 7-е сут., при этом его численность увеличилась в 26 раз по сравнению с исходным содержанием, а по данным ИФА количество выявляемого специфического антигена в почве через 14 сут. было чуть выше, чем через 7 сут. Рассчитанная по данным ИФА концентрация клеток штамма D. maris АМЗ в 1 г почвы через 14 сут. аугментации была выше, чем в момент интродукции штамма в 9 раз. Значения численности штамма в 0 и 30 сут. эксперимента были очень близки.
В целом, этот эксперимент (Э1.3.) показал несомненное сходство результатов количественной оценки численности штамма D. maris АМЗ в почве в процессе биоаугментации, произведённой двумя различными методами.
В условиях микрополевого эксперимента Э2. максимальное количество тестируемого антигена выявлялось в суспензиях смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами на 14-е сут. эксперимента, так же, как в тёмно-серой лесной почве и чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением (рис. 5.17), что соответствовало увеличению количества клеток D. maris АМЗ в 2,3 раза.
Корреляция между значениями численности штамма D. maris АМЗ в смешанном грунте с многолетним нефтяным загрязнением, полученными методом ИФА и с помощью микробиологического анализа (эксперимент Э2.)
По данным микробиологического анализа, как и в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением, максимальное увеличение численности D. maris АМЗ в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами происходило через 7 сут. — в 10 раз по сравнению с уровнем внесения. Вероятно, наблюдаемые различия связаны с периодом накопления антигена в почве, т.к. -микробиологический анализ позволяет непосредственно регистрировать численность бактериальных клеток, а метод ИФА учитывает концентрацию специфического антигена, который накапливается в почве.
В целом, развитие интродуцента в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами происходило менее отчётливо, чем в почвах при свежем загрязнении, которое, как известно (Логинов и др., 2004), легче подвергается деструкции интродуцированными микроорганизмами. Кроме того, развитие штамма в данном грунте могло подавлять большое количество аборигенных микробных сообществ, адаптированных к загрязнителю в течение ряда лет... Ио данным исследователей (Андронов- и др:, 2009) численность штамма Sinorhizobium meliloti АСН-5, интродуцированного в . почву, заметно снижалась в течение первых двух недель эксперимента,.что авторы объяснили высокой устойчивостью и комплексностью микробного сообщества почвы, в котором все экологические ниши уже заняты, а; само сообщество находится в состоянии устойчивого равновесия.
Динамика численности штамма в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами, согласно; данным ИФА, в течение первого месяца ремедиации- имела, сходство с результатами, полученными, в ходе: микробиологического анализа; Дальнейшая тенденция развития штамма по результатам- ИФА отличалась от динамики интродуцента, определённой классическим-микробиологическим методом: Иосле максимального развития» в грунте- на 7-е сут.. численность штаммашостепенно уменьшаласьв\течениё всего! эксперимента до исходного! уровня- внесения - так; происходило развитие штамма; согласно результатам? микробиологического анализам Аналогичную тенденцию в.развитии)штамма выходе ремедиации»наблюдали;в.-почвах. со свежим? нефтяным - загрязнением. Данные ИФА свидетельствовали о том; что количество обнаруживаемого антигена;в грунте после максимума: на 14 сут., сначала уменьшалось, достигнув исходных значений через 45 сут. ремедиацищ а затем в момент определения через 60 и 75 сут.-.оно/вновь было слегка повышенным; В проведённых ранее лабораторных, экспериментах не учитывали численность штамма АМЗ классическим методом:на1 МПА через. 60 и 75 сут. аугментации, и, возможно, различия, обнаруженные в микрополевом эксперименте, имели бы место и в почве со свежим нефтяным загрязнением, т.к. антиген изучаемого штамма в реальных природных условиях претерпевает модификации, что влияет на его обнаружение в ИФА.
Генетическая природа свойства биодеградации углеводородов нефти у штамма D. maris АМЗ
Активность уреазы - фермента, катализирующего гидролиз мочевины, как известно, увеличивается под влиянием нефтяного загрязнения (Гафарова, Зарипова, 2005). Стимулирующее действие на уреазную активность оказывают «-парафиновые и циклические углеводороды, входящие в состав нефти (Verstaeten, 1978). Изменения активности этого фермента находятся в соответствии с ростом численности гетеротрофных микроорганизмов, повышением содержания аммиачных форм азота и общего азота в загрязнённой почве.
В исходном чистом чернозёме южном (эксперимент Э1.4.) уреазная активность не обнаруживалась. Загрязнение почвы нефтью способствовало появлению уреазной активности, которая составила 0,018 мг N-NH3 /г почвы за час (рис. 6.23). По данным авторов (Киреева, 1994; Габбасова и др., 1997; Margesin et al., 2000) активность уреазы связана прямой коррелятивной связью с содержанием органического углерода в почве и увеличением окислительно-восстановительного потенциала в сторону преобладания восстановительных процессов, что и наблюдается в нефтезагрязнённой почве, ч, _
Через 14 сут. эксперимента во всех исследуемых вариантах уреазная активность вновь приблизилась к нулевым значениям.
Возможно, это связано с действием фракции ароматических углеводородов, содержащейся в нефти, которая является токсичной для уреазы и ингибирует активность этого фермента, что, очевидно, связано с наличием в этой фракции соединений фенольной и хиноидной природы. Ингибирующее действие оказывают и сами ароматические углеводороды. Т&к, например, имеются данные (Douglas, Bremner, 1971) об ингибирующем действии фенолов и хинонов на активность почвенной уреазы. Через 30 сут. наибольшее значение отмечалось в варианте со стимуляцией естественной микрофлоры, активность уреаз в этом варианте была равна 0,038 мг N-NH3 /г почвы за час, что было на 20% больше, чем в варианте с самоочищением и на 40% больше, чем в контрольном варианте. Через 60 сут. эксперимента такое превышение сохранялось, но значение активности фермента возросло до 0,114 мг N-NH3 /г почвы за час, что примерно в 3 раза превышало значение в варианте с самоочищением и в 4 раза в контрольном образце.
Повышенный уровень активности уреаз при использовании технологии стимуляции может свидетельствовать о более высокой интенсивности гидролитических процессов в очищаемой почве и, следовательно, о биодеградационных процессах, что совпадает со степенью деструкции нефтяных углеводородов» в этом варианте. В то же время высокие уровни активности уреазы не всегда благоприятны, т.к. приводят к значительным потерям азота мочевины (Девятова, 2005), что отрицательно сказывается на азотном балансе почвы.
Была обнаружена прямая корреляционная взаимосвязь между активностью уреаз и численностью нитрифицирующих микроорганизмов, которая наиболее отчётливо проявлялась в варианте с самоочищением почвы (коэффициент корреляции R2=0,85). Вероятно, аммиак, накопившийся в почве в результате ферментативных реакции гидролиза при участии уреаз, окисляется с помощью нитрифицирующих бактерий, которые получают, таким образом, питательный субстрат для своего роста и развития.
В чистом чернозёме южном (эксперимент Э1.1.), так же как в эксперименте Э1.4., уреазная активность не выявлялась (рис. 6.24). Внесение нефти стимулировало активность уреаз, которая составила 0,006 и 0,016 мг N-NH3 /г почвы за час в разных вариантах. Через 14 сут. при стимуляции активность уреаз слегка снизилась по сравнению с исходными значениями, при аугментации, напротив, возросла в 5 раз.
В дальнейшем уреазная активность постепенно повышалась при обоих способах обработки до окончания очистки. При этом в варианте со штаммом-интродуцентом активность уреаз была выше, чем при стимуляции примерно в 1,4 раза.
В целом, сравнивая показатели ферментативных активностей в различных нефтезагрязнённых почвах, очищаемых с помощью приёмов микробной ремедиации и самоочищения, можно сделать следующие заключения. Способы очистки, основанные на стимуляции природных микроорганизмов почвенного ценоза и интродукции активного нефтеокисляющего штамма D. maris АМЗ, приводили к увеличению активности» дегидрогеназ в почве и грунте, особенно выраженному в первый месяц ремедиации, что было связано с интенсивным развитием почвенных микроорганизмов, в том числе и УОМ, и высокой, скоростью биодеградации нефтяных углеводородов в- этот период. Повышение активности каталаз в почве и грунте при использовании биоремедиационных приёмов связано, на наш взгляд, с активизацией аэробных процессов при очистке почвы от нефти, что подтверждалось установленной обратной корреляционной зависимостью между .активностью каталаз и остаточным содержанием нефтяных углеводородов. Активность липаз в нефтезагрязнённой почве и грунте увеличивалась с ходом ремедиации, достигая максимальных значений на последних этапах ремедиации, что" объяснялось индукцией активности почвенных липаз продуктами распада нефтяных углеводородов, увеличением метаболической активности и биомассы микроорганизмов, утилизирующих липиды, и возможным накоплением в почве с ходом очистки липидоподобных веществ биологического и химического происхождения, являющихся субстратами для липаз.
