Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Микробно-растительные взаимодействия в биоценозах и их практическое использование 11
1.1.1. Микроорганизмы почвы 11
1.1.2. Роль корневых выделений растений во взаимоотношениях с микроорганизмами 13
1.1.3. Механизмы положительного влияния микроорганизмов на растения 16
1.1.3.1. Механизмы прямой стимуляция роста растений микроорганизмами 18
1.1.3.2. Пути опосредованной стимуляции роста растений микроорганизмами 27
1.1.3.3. Молекулярно-генетические взаимодействия микроорганизмов с растениями 31
1.1.4. Факторы, влияющие на колонизацию корневой поверхности растений микроорганизмами 35
1.1.5. Практическое использование микробно-растительных взаимодействий 37
1.1.5.1. Микробные препараты в растениеводстве 39
1.1.5.2. Микробно-растительные взаимодействия в очистке окружающей среды 46
1.2. Воздействие и экологические проблемы россыпной добычи золота на окружающую среду 50
1.2.1. Последствия россыпной золотодобычи 51
1.2.2. Естественное возобновление почвенно-растительного покрова на нарушенных территориях 52
1.2.3. Рекультивация и восстановление почвенно-растительного покрова на нарушенных территориях 56
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 60
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Отбор проб для микробиологического анализа 56
2.2.2. Выделение микроорганизмов
2.2.3. Учет численности основных физиологических групп микроорганизмов 58
2.2.4. Фенотипическая характеристика 71
2.2.5. Молекулярно-генетические методы исследования 71
2.3. Модельные эксперименты 75
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 78
ГЛАВА 3. МИКРООРГАНИЗМЫ ОТВАЛОВ РОССЫПНОГО ЗОЛОТА И ИХ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ 78
3.1. Количественный анализ микроорганизмов 78
3.2. Таксономический анализ микробных комплексов
3.2.1. Таксономический анализ сапротрофного бактериального комплекса
3.2.1.1. Фенотипическая идентификация
3.2.1.2. Идентификация на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена рРНК 90
3.2.1.3. Анализ структуры сапротрофного бактериального комплекса 93
3.2.2. Таксономический анализ фосфатмобилизующего бактериального комплекса 96
3.2.2.1. Экофизиологическая роль фосфатмобилизующих бактерий 97
3.2.2.2. Бактерии литотрофной составляющей трансформации фосфора 98
3.2.2.3. Бактерии гетеротрофной составляющей трансформации фосфора 100
3.2.2.4. Молекулярно-генетическая идентификация фосфатмобилизующих бактерий 101
3.2.2.5. Фенотипическая характеристика фосфатмобилизующих микроорганизмов 106
3.2.3. Сравнительный анализ структуры сапротрофного и фосфатмобилизующего бактериальных комплексов
ГЛАВА 4. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
4.1. Оценка фосфатмобилизующей и окислительной способности изучаемых штаммов бактерий
4.2. Динамика образования изучаемыми бактериями подвижного фосфора в почвогрунте
4.3. Влияния фосфатмобилизующих бактерий на прорастание семян
4.4. Характеристика биотехнологических свойств фосфатмобилизующих бактерий
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Роль корневых выделений растений во взаимоотношениях с микроорганизмами
- Учет численности основных физиологических групп микроорганизмов
- Анализ структуры сапротрофного бактериального комплекса
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время установлены биотические взаимоотношения между микроорганизмами и растениями, которые носят либо антагонистический характер, либо характер ассоциативного (симбиотического) сосуществования. Хорошо известны антагонистические взаимоотношения между растениями и патогенными микроскопическими грибами (Schultze, Kondorosi, 1998; Borowich, 2000), мутуалистические - между ризобиями и бобовыми растениями (Тильба, Голодяев, 1995; Игнатов, 1998; Karpati, Sik, 1992; Matthew, Kent, 2001). Микроорганизмы либо создают оптимальные условия для развития растений, либо являются фитопатогенными (Воронин, 1998; Zak et. al, 1994; Garland, 1996; Glick et. al, 1997). Практически не изучены функциональные взаимоотношения в системе «почва-микроорганизмы-растение» на техногенно-нарушенных землях, когда структурные компоненты системы (растения, микроорганизмы) находятся в экстремальных условиях существования, так как произошло нарушение их естественного местообитания. Изучение данной проблемы весьма актуально для Амурской области, на территории которой более 130 лет ведется отработка месторождений и россыпепроявлений золота, занимающих около 155 тыс. км2 из 361 тыс. км площади всей области (Доклад ..., 2002). Изучение структуры микробного комплекса и функциональных взаимоотношений в системе «почва-микроорганизмы-растение» является фундаментальной основой для понимания процессов восстановления техногенно-нарушенных экосистем и создания новых технологий биорекультивации.
Цель и задачи исследования. Целью исследований явилось изучение структуры микробных комплексов почвогрунтов и прикорневой зоны пионерных растений, выявление функциональных отношений в системе «почва-микроорганизмы-растение» на примере техногенно-нарушенных земель Дамбукинского золотоносного узла.
В задачи исследования входило:
1. Изучить количественный состав эколого-функциональных групп микроорганизмов почвогрунтов и корневой зоны пионерных растений гале-эфельных отвалов россыпной добычи золота на первых этапах почвообразовательного процесса.
2. Провести таксономический анализ сапротрофного микробного комплекса на основе фенотипических признаков и молекулярно-генетических методов исследования.
3. Установить филогенетическое положение бактерий сапротрофного комплекса и количественное распределение филогенетических групп бактерий в почвогрунтах и корневой зоне пионерных растений.
4. Определить экофизиологическую роль фосфатмобилизующих бактерий, свободноживущих и ассоциированных с растениями, провести идентификацию и филогенетический анализ штаммов.
5. Установить биотехнологический потенциал фосфатмобилизующих бактерий.
Научная новизна. Впервые был применен комплексный подход в исследовании функциональных отношений в системе «почва-микроорганизмы-растения» на техногенных отвалах после россыпной добычи золота. Впервые изучено таксономическое разнообразие свободноживущих и ассоциативных бактерий в нарушенных почвогрунтах с применением современных молекулярно-генетических методов исследования. Выявлены представители редко встречающихся видов {Acinetobacter Iwoffii и Planococcus aminovorans), имеющих высокую адаптивную способность к воздействию экологических факторов. Впервые установлена специфичность распространения и высокий биотехнологический потенциал бактерий, участвующих в трансформации минеральных и органических соединений фосфора и выполняющих средообразующую функцию в почвогрунтах, нарушенных в результате золотодобычи.
Практическая значимость работы.
В лабораторных модельных экспериментах изучен биотехнологический потенциал фосфатмобилизующих бактерий. Создана коллекция активных бактериальных штаммов, которые могут быть использованы в рекультивационных технологиях обработки нарушенных почвогрунтов. На основе выделенных штаммов рекомендовано разработать биопрепараты для обработки семян растений перед внесением в рекультивируемые грунты.
Положения, выносимые на защиту.
1. На начальных этапах почвообразования в системе «растения-микроорганизмы» устанавливаются специфические биотические отношения, определяющие селективное участие растений в формировании микробного комплекса прикорневой зоны. В состав микробного комплекса данного экотопа входят виды (Acinetobacter Iwqffii, Planococcus aminovorans), обладающие высокой степенью устойчивости к воздействию неблагоприятных экологических факторов среды обитания: низкое содержание органических соединений в почвогрунтах, недостаточная обеспеченность подвижными формами фосфора.
2. Фосфатмобилизующие микроорганизмы играют ведущую роль в формировании функциональных взаимоотношений в системе «почва-микроорганизмы-растение». Специфичность распространения данной группы бактерий определяется тем, что в почвогрунтах распространены виды, использующие широкий набор минеральных субстратов для мобилизации фосфора, тогда как в прикорневой зоне пионерных растений присутствуют виды, трансформирующие органофосфатные соединения и фосфаты кальция.
Апробация работы. Основные положения работы представлены на VI Международном симпозиуме «Проблемы устойчивого развития регионов в XXI веке (Биробиджан, 2002); региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Будущее амурской науки» (Благовещенск, 2002); II Международной конференции «Ресурсовоспроизводящие, малоотходные и природоохранные технологии освоения недр» (Москва, 2003); Международном симпозиуме «Геотехнология: нетрадиционные способы освоения полезных ископаемых» (Москва, 2003); VI, XI и IX молодёжных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2000, 2003 и 2005); региональной конференции молодых учёных «Проблемы экологиии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2004); VII региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии (Владивосток, 2004); III региональной школе-семинаре молодых учёных, аспирантов и студентов Дальнего Востока «Территориальные исследования дальнего Востока» (Биробиджан, 2005).
Работа проводилась на базе: лаборатории микробиологии Амурского филиала Ботанического сада-института ДВО РАН; лаборатории микробиологии и биохимии Института геологии и природопользования ДВО РАН, г. Благовещенск; отдела «Всероссийская коллекция микроорганизмов» Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы (глава 1), описание объектов и методов исследования (глава 2), результаты экспериментов (главы 3 и 4), выводы и список литературы, включающий 244 источника, из которых 139 - на иностранных языках. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, содержат 18 рисунков и 4 таблицы.
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. Павловой Л.М. Автор благодарен ученому секретарю Амурского филиала БСИ ДВО РАН к.б.н. Куимовой Н.Г., а также к.б.н. Католе В.М., к.б.н. Тену О.А., д.б.н. проф. Крылову А.В., к.б.н. Газдиеву Д.О., к.х.н. Радомской В.И., к.б.н. Старченко В.М., к.б.н. Поляковой Т.А. и всем сотрудникам лаборатории микробиологии и биохимии (ИГиП ДВО РАН) за разностороннюю поддержку в выполнении исследований и ценные советы в подготовке рукописи. Особую благодарность за консультации и помощь в проведении исследовании автор выражает заведующему сектора бактерий отдела ВКМ к.б.н. Акимову В.Н (ИБиФМ им. Скрябина).
Роль корневых выделений растений во взаимоотношениях с микроорганизмами
Первые наблюдения, касающиеся выделений корней, были сделаны в начале 19 века D. Candolle и Р. Германом (цит. по Самцевич, 1972). Вначале в них искали соединения, способствующие растворению труднодоступных для питания растений веществ, затем токсические соединения, вызывающие «утомление» почвы при длительном культивировании некоторых растений на одной площади. В последние десятилетия исследования направлены, главным образом, на определение в выделениях корней разнообразных химических соединений и физиологически активных веществ, влияющих на состав и деятельность прикорневой микрофлоры.
Анализ многочисленных литературных данных показал, что, несмотря на разнообразные вещества, которые выделяют растения и микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности независимо друг от друга, между ними существует устойчивое растительно-микробное взаимодействие (Самцевич, 1972; Бабьева, Зенова, 1989; Заварзин, 2004; Jones, 1998; Nautiyal, Shekhar, 2000; Lugtenberg et. al, 2002). Это взаимодействие считается преимущественным механизмом, ответственным за нормальное существование природных экосистем. При этом, взаимное влияние корневых выделений растений и почвенных микроорганизмов сложно и неоднозначно. Влияние корневых растительных экссудатов, вследствие которого вокруг корней развиваются популяции микроорганизмов более высокой плотности и физиологической активности в сравнении с почвой, получило название «ризосферного эффекта». Установлено и противоположное явление - «ризосферный антиэффект», заключающийся в том, что корневые выделения растений ингибируют развитие функционирующих в среде микроорганизмов и тем самым формируют в прикорневой зоне растений специфический состав микрофлоры (Ермаков, Степанова, 1992; Benizi et. al, 2001).
Влияние растений на прикорневую микрофлору осуществляется посредством соединений, входящих в состав корневых экссудатов корней. Наиболее подвижные фракции органического вещества (углеводы, белки, низкомолекулярные органические кислоты) и биологически-активные вещества (фенольные соединения, витамины, алкалоиды, гликозиды и фитогормоны) легко усваиваются почвенными микроорганизмами и, тем самым, определяют их функциональную активность.
Органические кислоты корневых выделений, изменяя рН среды в кислую сторону, ингибируют развитие фитопатогенных микроорганизмов.
Входящие в состав корневых выделений белки и вещества пептидной природы, в частности, ферменты, могут выступать в роли химических модификаторов выделяемых микроорганизмами веществ, токсичных для растений. Некоторые ферменты, наоборот, способны изменять вещества, находящиеся в почве таким образом, что они становятся полезными для растений и ассоциированных с растениями микроорганизмов. Существуют растительные ферменты, которые катализируют перекисное окисление липидов в почве. В результате образуется активная форма кислорода, являющаяся токсичной для некоторых микроорганизмов прикорневой зоны растений (Дебабов, 1999).
Фитогормоны, обнаруженные в корневых выделениях высших растений, также принимают участие в конкурентных отношениях данного растения с другими членами биоценоза. Вещества с физиологической активностью фитогормонов (гиббереллины, ауксины, кинетины) являются продуктами жизнедеятельности почвенных микроорганизмов. В ряде работ было установлено положительное влияние обработки растений фитогормонами, синтезируемыми микроорганизмами (Варфоломеев, 1992; Vancura, 1972).
Фенолъные соединения принимают участие в важнейших физиолого-биохимических процессах, тесно связанных с процессами роста, развития и старения растений. Синтезируемые высшими растениями фенольные соединения являются наиболее распространенными токсинами, обладающими физиологической активностью и выступающие активаторами или ингибиторами многих обменных процессов. Защитный эффект растительных фенольных соединений против фитопатогенных микроорганизмов реализуется через ингибирование факторов вирулентности патогенов (Рунков, 1980; Hartwig, 1991).
М.Н. Запрометовым (1993) показано, что фенольные соединения корневых выделений выступают и в роли сигнальных веществ во взаимосвязях растения с микроорганизмами, являются активирующим компонентом экссудата корня и обладают способностью экспрессировать гены, необходимые для осуществления последовательных стадий взаимодействия растения-хозяина с микроорганизмами. Подобная функция описана Е. Martinez (1994) для бактерий Rhizobhim, имеющих nod-гены, ответственные за процессы формирования клубеньков на корнях растения.
Некоторые фенол ьные вещества корневых экссудатов растений накапливаются в почве в довольно значительных количествах. Кроме того, источниками фенольных соединений служат и метаболиты микроорганизмов. Н. Bonner (1960) установлена способность микроорганизмов, синтезирующих фенольные вещества, оказывать ингибирующее действие на растения.
Учет численности основных физиологических групп микроорганизмов
Объектами исследований служили микроорганизмы, выделенные из почвогрунтов отвалов россыпной добычи золота и корневой зоны произрастающих на отвалах пионерных растений. Отбор проб проводили с 2000 по 2005 г.
Для отбора биологического материала нами были выбраны участки гале-эфельных отвалов Яснополянской россыпи (Дамбукинский золотоносный узел, Амурская область). Россыпь расположена по правобережью рек Джалта и Иликан и имеет протяженность 15 км при ширине 0.6-2.0 км. Отвалы являются технологическими отходами россыпной золотодобычи, образованные 7-Ю дет назад в результате промывки и переотложения золотосодержащей породы гидравлическими приборами (рис. 5 и 6). На исследуемых отвалах была проведена первичная механическая рекультивация, состоящая в выравнивании поверхности (рис. 7).
Почвогрунты отвалов в разрезе имеют простое строение: слабостратифицированный грунт с преобладанием промытой крупной гальки и гравия, мелкозём занимает 10-30% объёма. На поверхности, освоенной высшей растительностью, выделяется корнеобитаемый слой (10-15 см), который морфологически не отличается от нижележащей массы.
По аналитическим данным содержание гумуса в мелкозёме минимально и составляет 0.34%, содержание азота - 1.9%. Почвогрунты обеспечены обменным калием (155-190 мг/кг). Содержание подвижного фосфора очень низкое и составляет 27-42 мг/кг грунта. Содержание же общего фосфора высокое (340-380 мг/кг), что очевидно, обусловлено минеральным составом горных пород. Минимальное содержание подвижного фосфора в сравнении с высоким его общим содержанием свидетельствует о преобладании в грунтах минеральных фосфатов и незначительной доли органического фосфора (Оценка...., 2001). Актуальная кислотность почвогрунтов близка к нейтральной (рН водный 6.6).
Естественное возобновление фитоценозов на рекультивируемых исследуемых участках отвалов 7-Ю летней отработки идет за счет видов растений, присутствующих в окружающих ценозах, в наибольшей степени представленных сосной обыкновенной, лиственницей Гмелина, березой даурской и ивовыми. Среднее расстояние между растениями составляет от 0.5 до 2.0 м. Отмечено небольшое видовое разнообразие травянистых растений и отсутствие кустарников, более требовательных к экологическим условиям, чем древесные виды растений. Травостой покрывает не более 1-3% площади.
В качестве растительных источников выделения микроорганизмов служили произрастающие на исследуемых отвалах растения лесообразующих пород: сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.), лиственница Гмелина (Larix gmelini Rupr.), относящиеся к семейству сосновых (Pinaceae); берёза даурская (Betula davurica Pall.) относящаяся к семейству берёзовые (Betulaceae); чозения толокнянколистная (Chosenia arbutifolia Pall.), ива Шверина (Salix schwerinii Wolf.), тополь душистый (Populus suaveolens Fish.), относящиеся к семейству ивовых (Salicaceae); а также травянистых: полынь цельнолистная (Artemisia integrifolia L.) семейства сложноцветных и подорожник приземистый (Plantago depressa Willd.), семейства подорожниковых (Plantaginaceae).
Анализ структуры сапротрофного бактериального комплекса
Наряду с бактериями, принадлежащими к родам, обычно широко распространенным в почвенных экосистемах (p.p. Bacillus, Paracoccus, Serratia, актинобактерии), выделены представители редко встречаемых родов бактерий, являющихся кислото- и щелочно-толерантными формами {Acinetobacter и Planococcus соответственно). Причём вид Acinetobacter Iwoffii явился доминантным по отношению к другим видам и обнаружен во всех источниках выделения. Это может быть обусловлено тем, что малопригодные для жизнедеятельности основных групп почвенных микроорганизмов природные субстраты являются благоприятными экологическими нишами для заселения видами,более адаптированными к условиям обитания.
Таксономический анализ видового сообщества бактерий, ассоциированных с корневой зоной обследованных пионерных растений, позволил установить следующие закономерности. Только в корневой зоне растений семейства сосновых выявлены такие бактериальные виды как Bacillus thuringiensis, Micrococcus luteus, Paracoccus aminovorans, Sporolactobacillus inulinus, Sporosarcina ureae и Staphylococcus saprophyticus. Тогда как в корневой зоне берёзы обнаружены Agrococcus jenensis, Bacillus vallismortis, Planococcus psychrotoleratus и Serratia ficaria. Почвогрунты также отличаются по видовому бактериальному составу от растений. Только в почвогрунтах обнаружены виды Kocuria rosea, Serratia marcescens и Lactobacillus delbrueckii. Согласно литературным сведениям (Gransee, Wittenmayer, 2000) отмеченные различия могут быть связаны с созданием селектирующих условий среды обитания микроорганизмов со стороны растений, в результате чего корневые зоны занимают наиболее приспособленные к определённым условиям бактериальные ассоциации.
Следует также отметить, что таксономическое разнообразие сапротрофных бактерий коррелирует как с их общей численностью, так и с распределением в зависимости от места выделения. Количественный анализ распределения филогенетических классов бактерий-сапротрофов по исследуемым объектам (почвогрунты и пионерные растения) представлен на рисунке 11. В корневой зоне всех исследуемых растений преобладающими явились бациллы и протеобактерии. Их количество в корневой зоне сосны составило 65 и 68 тыс. КОЕ/г, лиственницы - 44 и 43 тыс. КОЕ/г, берёзы - 43 и 41 тыс. КОЕ/г соответственно. В почвогрунтах доминирующей явилась группа грамотрицательных бактерий в количестве 52 тыс. КОЕ/г. Актинобактерии явились минорными компонентами исследуемого сапротрофного комплекса прокариот, что свидетельствует о невысоком их содержании в таком специфичном местообитании, каким является ризосфера пионерных растений, произрастающих на отвалах россыпного золота. В корневой зоне сосны их количество составило 27 тыс. КОЕ/г, лиственницы - 13 тыс. КОЕ/г, берёзы - 6 тыс. КОЕ/г, в почвогрунтах - 30 тыс. КОЕ/г.
По общему количественному отношению доминирующими явились бациллы и протеобактерии, составляющие 42 и 38% от общего числа изолятов соответственно. Известно, что бактерии класса Bacilli распространены повсеместно — в почве, воздухе, водоемах, на растительных остатках и других естественных субстратах. Большинство из них отличаются способностью образовывать споры (p.p. Bacillus, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Lactobacillus) или цистоподобные покоящиеся клетки (p.p. Staphylococcus, Planococcus), обладающие повышенной устойчивостью к внешним воздействиям (Головлев, 1998; Ильинская и др., 2002). Такие формы микроорганизмов остаются жизнеспособными при самых неблагоприятных условиях, выдерживая резкие колебания температуры, отсутствие влаги и воздуха, действие различных неблагоприятных экологических факторов, обычно губительно влияющих на другие организмы.
