Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Подходы к исследованиям серосодержащих удобрений в сельском хозяйстве. Новые серосодержащие удобрения 8
Глава 2. Современные тенденции исследований фосфолипидов 16
2.1. Общая характеристика фосфолипидов как класса химических соединений 16
2.2. Основные направления исследования фосфолипидов 28
Глава 3. Объекты и материалы исследований 48
Глава 4. Экологические последствия использования новых серосодержащих удобрений 55
4.1. Агрономические исследование влияния серосодержащих, удобрений (СУ) на разных стадиях развития растений подсолнечника, пшеницы и сои 56
4.2. Исследования влияния СУ на некоторые характеристики почвы 61
4.2.1. Изучение влияние СУ на дыхание почвы 61
4.2.2. Исследование влияния СУ на ионный состав почв 62
4.3. Влияние СУ на накопление пластидных пигментов в листьях подсолнечника 66
4.4. Изучение влияния СУ на содержание соединений с тиольными группами в листьях и проростках растений 68
4.5. Влияние СУ на содержание и динамику накопления фосфолипидов в проростках и листьях подсолнечника, сои и пшеницы,,..71
Выводы 78
Список литературы 80
Приложение
- Общая характеристика фосфолипидов как класса химических соединений
- Агрономические исследование влияния серосодержащих, удобрений (СУ) на разных стадиях развития растений подсолнечника, пшеницы и сои
- Изучение влияния СУ на содержание соединений с тиольными группами в листьях и проростках растений
Введение к работе
Возрастание антропогенного пресса на агроэкосистемы, связанное с интенсификацией продукционного процесса растений, вызывает накопление в продуктах растениеводства различных токсических веществ. Это связано с тем, что многие химические вещества не исследовали с учетом возможных превращений в окружающей среде, биоаккумуляции и влияния на различные компоненты экосистем. Такой подход породил проблему нитратов, пестицидов, тяжелых металлов в растениях, которая и сегодня представляет реальную угрозу для здоровья людей. Тем не менее, если в отношении вышеперечисленных веществ предложены схемы исследования экологических последствий от их применения, то для серосодержащих удобрений подобных подходов практически нет. В настоящее время накоплен определенный материал по влиянию серосодержащих удобрений на накопление Сахаров, белка, витаминов и пластидных пигментов в культурных растениях. Однако в литературе практически отсутствуют сведения о влиянии в результате применения серосодержащих удобрений на метаболизм фосфолипидов и низкомолекулярных тиолов культурных растений. Соотношение этих важнейших структурных элементов клеточных мембран является, во многом, определяющим в формировании адаптации растений к ряду неблагоприятных экологических факторов и создании ответов растительных клеток на стрессовые воздействия. Кроме того, нарушение нормального соотношения фосфолипидов может приводить к изменению проницаемости клеточных мембран по отношению к различным токсикантам. Это может негативно отразиться и на устойчивости растений к действию антропогенных факторов.. Поэтому исследование экологических последствий применения экспериментальных серосодержащих удобрений на характер изменения фосфолипидного состава растений приобретает особую актуальность.
/
Цель и задачи исследования
Целью работы явилось изучение воздействия экспериментальных серо-цеолитсодержащих материалов, рекомендуемых к использованию в виде удобрений на устойчивость агроэкосистем подсолнечника, пшеницы и сои.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
- разработать технологию производства экспериментальных серосодержащих
удобрений на основе газовой серы и опок Астраханской области;
- исследовать химический состав полученных материалов и оценить последст
вия их использования для всех компонентов агроэкосистем, на ранних стадиях
развития растений;
- провести серию микрополевых и вегетационных опытов на различных этапах
развития культур подсолнечника, пшеницы и сои;
изучить влияние СУ на биологическую активность и ионный состав почв под исследуемыми культурами;
исследовать влияние СУ на накопление пластидных пигментов в листьях подсолнечника,
изучить влияние СУ на соотношение фосфолипидов в проростках и листьях исследуемых культур;
оценить влияние СУ на накопление соединений, содержащих тиольные группы;
сделать заключение о возможных экологических последствиях использования в сельском хозяйстве и предложить рекомендации по применению СУ.
Выполнение этих задач в дальнейшем будет способствовать созданию оригинальной методики оценки влияния негативных факторов, в частности по-
/
вышенного содержания серы в объектах окружающей среды, на устойчивость клеточных мембран растений к действию токсикантов.
Научная новизна. Впервые изучено воздействие СУ на прорастание семян, рост и развитие корневой массы растений. Исследовано влияние СУ на характер накопления пластидных пигментов, соотношение фосфолипидов и низкомолекулярных тиолов в проростках и листьях растений подсолнечника, сои и пшеницы. Получены экспериментальные данные о влиянии СУ на интенсивность дыхания почвы и изменения ионного состава почв, на которых были использованы серосодержащие удобрения. Установлено, что применение СУ не приводит к ухудшению экологического состояния агроэкосистем исследуемых культур. Показана применимость предложенных методик для оценки экологических последствий использования средств химизации.
Практическая значимость. Результаты исследований являются начальным этапом исследования СУ вагрохимической практике. Апробированы лабораторные и промышленные способы получения различных форм СУ, позволяющие эффективно использовать отходы очистки углеводородов от серосодержащих примесей - газовую серу и природный цеолитсодержащий материал - опоки Астраханской области. Предложены практические рекомендации по использованию СУ в сельском хозяйстве. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении спецкурсов по экологической физиологии и биохимии культурных растений, а также в экологической практике при оценке возможных экологических последствий использования различных средств химизации в сельском хозяйстве.
Апробация работы. Материалы исследований докладывались и обсуждались на заседаниях кафедр ботаники, аналитической и физической химии Астраханского государственного университета (АГУ), ежегодных отчетных научных конференциях преподавателей и сотрудников АГУ (2001-2003гг.), на Всероссийских научных конференциях "Эколого-биологические проблемы Волж-
ского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань 2001,2002,2003), Международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001г.), VII Международной научно-практической конференции " Наукоемкие химические технологии" (Ярославль, 2001г.), Межвузовской научно-практической конференции "Научные разработки молодых ученых - социально-экономическому развитию региона"(Астрахань, 2002г.), II Международной конференции по экологической химии (Кишинев, 2002г.), VII Международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI ве-ка"(Пущино,2003), X Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 2003"(Москва,2003 г.). В целом работа доложена на расширенном семинаре кафедры ботаники Астраханского государственного университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Работа изложена на ПО страницах компьютерного текста, содержит 17 таблиц и 3 рисунка и приложение. Библиографический список содержит ссылки на 145 источников информации.
Благодарности. Автор выражает благодарность своим научным руководителям д.х.н. Алыкову Н.М. и д.б.н. Пилипенко В.Н. за неоценимую поддержку и руководство на всех этапах выполнения работы. Отдельное спасибо, хочется сказать, моим помощникам и друзьям: м.н.с. лаборатории фотосинтеза Института фундаментальных проблем биологии РАН - Забелину А.А., студентам АГУ Конд-рашину А.Г. и Дербасовой И.А. за помощь в проведении лабораторных и мик-рополевых исследований. Огромную признательность выражается д.б.н. Егорову М.А. за данные им ценные советы при подготовки рукописи диссертации. Большое спасибо моим родным, близким, коллегам по работе и вообще всем тем, кто был вместе со мной все это нелегкое время
Общая характеристика фосфолипидов как класса химических соединений
Постоянство белок-липидного состава мембран - раннее завоевание эволюции. Основной план химического строения мембран сформировался очень давно - у разных видов, не объединенных ни генетической, ни экологической общностью, встречаются ФЛ в близких соотношениях. Видимо, этот набор ФЛ обеспечивает мембранным структурам какие-то преимущества. Такими преимуществами могут быть термодинамическая стабильность в сочетании с подвижностью отдельных компонентов, легкость обмена компонентами со средой и определенная устойчивость структуры избирательность.
В соответствии с химическими свойствами липиды делят на две группы :1)нейтральные липиды, 2)полярные липиды. Каждая из групп включает несколько классов липидов. Обычно эта классификация базируется на наиболее существенных особенностях строения, но в сложных соединениях выбор определяющего признака не всегда однозначен. К группе нейтральных липидов относятся глицеролипиды, диольные липиды, гликолипиды, сфинголипиды, эфи-ры холестерина, воска. Полярные липиды разделены на три подгруппы: ФЛ, фосфонолипиды и сульфолипиды. В ФЛ имеется связь О-Р, а в фосфонолипидах С-Р. В подгруппу ФЛ входят глицерофосфолипиды, фосфогликолипиды и диольные ФЛ.
В литературе можно встретить различные классификации полярных липидов. Обычно называют два важнейших класса: ФЛ и гликолипиды. В дополнении к ним могут быть даны другие группы липидов, сформированные по самым различным химическим признакам. Наиболее часто встречаемым является деление полярных липидов на пять классов, сформированных по химическому принципу - наличию в молекуле гетероатома и (или) остатка моносахарида:1)фосфолипиды, 2)гликолипиды, 3)полярные липиды, 4)фосфогликолипиды, 5)мышьяколипиды[30]. Глицерофосфолипиды и фосфолипиды часто отождествляют. По другой классификации [31], класс ФЛ условно подразделяется на на фосфатиды, плазмалогены и сфинголипиды . Иногда отдельно выделяют хо-линфосфатиды или лецитины, коламинфосфатиды или кефалины, серинфосфа-тиды, инозитфосфатиды как классы, а название "фосфатиды" служит общим не только для вышеназванных фосфолипидов, но и для плазмалогенов и сфинго-миелинов [32]. Однако это деление удобно только в смысле раскрытия значимости отдельных подклассов фосфолипидов и наиболее правильно определять классы именно по близости химического строения представителей. ФЛ обладают большим разнообразием строения, связанного с возможностью замещения групп в различных положениях.
В зависимости от строения полярной группы фосфолипиды делются следующим образом: 1)фосфатидилхолины; 2) фосфатидилэтаноламины; 3)фосфатидилсерины;4)фосфатидилинозиты;5)фосфатидилсахара;6)плазмалоге ны. [33]
Фосфолипиды распространены в растительных и животных тканях, в микроорганизмах они являются преобладающей формой липидов. Грамположи-тельные бактерии (например, B.megaterium) содержат, в основном, кардиоли-пин, ФЛГ и ФЛХ; жирные кислоты в составе липидов представлены соединениями с нечетным количеством атомов углерода и с разветленными цепями. Грамотрипательные бактерии (E.Coli) содержат не ФЛХ, а ФЛЭ, имеют жирные кислоты с чсіньїм числом атомов углерода, а в составе гликолипидов обнаруживаются оксикислоты. Некоторые солелюбивые бактерии Halobacterium содержат в составе липидов вместо жирных кислот так называемые фитаниль-ные С2о -соединения. Фитанильные ФЛ обладают такой же стереоконфигураци-ей, аналогичным расположением зарядов в полярных головах и в смеси с глико-липидами образуют типичные липосомы. Получающ;:: . ..ри том бислой оказывается более плотно упакованным и обнаруживает повышенную стабильность по отношению к действию кислорода, кислот и щелочей. Таким образом, особенность строения и состава ФЛ обуславливает неприхотливость галофиль-ных бактерий в выборе мест обитания. В отличие от нейтральных жиров ФЛ практически содержатся только в клеточных мембранах и очень редко в небольших количествах обнаруживаются в составе запасных отложений. Значительные количества ФЛ содержатся в сердце и печени животных, в семенах растений, в яйцах птиц. Особенно высоко содержание их в нервной ткани человека и позвоночных животных.
По своим физико-химическим свойствам фосфатиды принадлежат к типичным липоидам, они хорошо растворяются в таких органических жидкостях, как бензол, хлороформ и т.д. В основном ФЛ - это гигроскопичные, белые воскообрг. ные вещества, которые быстро темнеют на воздухе вследствие окисления радикала ненасыщенной кислоты. С водой они могут при некоторых условиях давать стойкие эмульсии или даже образовывать коллоидные растворы. Эти свойства определяются, прежде всего, амфипатическим строением фосфолипидов. Они имеют неполярную часть, то есть остаток диацилглицерина, и полярную представленную фосфатом и спиртовыми остатками. Особенность строения ФЛ определяет их присутствие в составе клеточных мембран. Фосфатиды легко образуют комплексы с белками. Это связано с наличием в мембране в составе ФЛ цис-изомеров жирных кислот, разветвленных или содержащих циклические кольца углеводородных цепей, а также высокая скорость вращения вокруг С-С связей жирнокислотных радикалов делают бислой достаточно рыхлым. Как правило, цепи ФЛ в бислое скошены относительно перпендикулярной оси мембраны. Угол наклона определяется природой полярной головы молекулы: наклон возникает в том случае,-если объем гидратированной головы молекулы больше площади сечения хвоста. В случае, когда эти величины равны (например, для ФЛЭ), молекула располагается перпендикулярно поверхности мембраны. Таким образом, угол наклона молекул ФЛ в мембране определяется природой ФЛ и может служить критерием отбора при образовании кластеров в бислое. Сі и Сг -углеводородные цепи в молекуле ФЛ оказываются неравнозначными. Обычно из двух цепей лишь принадлежащая Сг -углеродному атому имеет двойные связи, обеспечивающие создание более рыхлой упаковки бислоя. Перемещение ненасыщенной жирной кислоты из положения Сг в положение Сі (обмен жирнокислотными радикалами внутри молекулы ФЛ) позволяет достичь более плотной упаковки - для 18:0/18:1 - ФЛХ критическая температура фазового перехода составляет 3, а для 18:1/18:0 - ФЛХ - 22.
Агрономические исследование влияния серосодержащих, удобрений (СУ) на разных стадиях развития растений подсолнечника, пшеницы и сои
Агрономическое исследование влияния серосодержащих удобрений на разных стадиях развития растений Как видно из данных табл.4, внесение новых серных удобрений оказывает различное влияние на прорастание исследуемых семян. Наиболее выраженный фитотоксический эффект наблюдается в случае подсолнечника, что выражено в уменьшении средней длины проростков и снижении всхожести семян. Это можно объяснить резким очаговым повышением концентрации солей в почвенном растворе, вызванным совместным внесением NPK и СУ, что приводит к снижению всхожести семян, ожогам молодых корешков, ненормальному развитию растений и их гибели. Именно поэтому в агротехнике подсолнечника не рекомендуется одновременное внесение удобрений с семенами. Другие исследуемые культуры более устойчивы к мелкоочаговому засолению. В меньшей степени описанный эффект характерен для сои и выражается только в незначительном ингибировании прорастания семян. В то же время, в случае с пшеницей наблюдается достоверная стимуляция прорастания, что может быть вызвано специфическим влиянием применяемого композита на всхожесть семян.
Проведенные вегетационные опыты показали следующую закономерность. Прежде всего, постепенно нивелировался фитотоксический эффект в случае с подсолнечником, что выразилось в стимуляции развития корневой системы. Также отмечается положительное влияние СУ на растения пшеницы и сои (данные табл.5). Все вышесказанное является подтверждением пролонгированнного действия исследуемых удобрений.
Наилучший результат достигается на 48-ой день развития растений, что связано с увеличением доступности серы из удобрений в этот период.
Опыт проводился на почвах с низким содержанием подвижной серы -5,2мг-экв/кг почвы, поэтому одной из основных задач исследования являлось изучение химического состава почвы после применения СУ и обеспеченность серой этой почвы. На 48-ой день опыта изучали содержание сульфат-иона в исследуемой почве по стандартной методике. Получены следующие результаты: под подсолнечником - 6,4, под соей - 6,8, под пшеницей - 7,2. (в мг-экв/кг почвы).
Таким образом, применение новых сероцеолитсодержащих удобрений позволяет значительно повысить содержание доступной для растений форм серы, в некоторых случаях стимулировать прорастание семян и развитие корневой системы в условиях вегетационного опыта.
Также были проведены исследования по изучению влияния СУ на развитие корневой системы пшеницы, подсолнечника и сои. Полученные результаты очень четко показывают, что использование СУ во всех вариантах опыта проявляется на уровне тенденции и не угнетает развитие корневой системы (табл. 6)
Как видно из табл. 6, действие подкормок для сои проявляется в основном на 22-ой день, для пшеницы и подсолнечника в этот период не наблюдается достоверных различий в развитие корневой системы для всех вариантов опыта. В более поздний срок различия в действии удобрений на исследуемые культуры проявляются более четко. Это может быть связано с тем, что в этот период процесс окисления элементарной серы в почве достигает максимума. Для сои этот процесс был несколько ускорен, к этому времени наблюдается выравнивание развитие корневой системы во всех вариантах опыта. Для пшеницы и подсолнечника можно отметить, то, что использование нитроаммофоски даже угнетало корневую систему этих растений, длина корней в случае с СУ достоверно была больше варианта в контроле лишь на уровне тенденции. Тем не менее, использование СУ нивелировало фитотоксический эффект нитроаммофоски и несколько стимулировало процессы развитие корневой системы.
В другом опыте оценивали рост и развитие молодых растений. И в данном случае можно отметить, что СУ в ряде случаев оказывает положительное влияние на развитие растений, которое проявляется по разному. Результаты средней длины для 40 образцов при трех вариантах опыта сведены в табл. 7.
Добавление питательных элементов оправдано только в случае сои, где результат от их использования очевиден, хотя эффект от использования СУ не наблюдается. Это может быть связано с тем, что для сои в этот период влияние СУ еще не является определяющим, так как в этот период деструкция элементарной серы в почве только начинается. В случае с подсолнечником и пшеницей применение СУ позволяет лишь несколько ослабить неблагоприятное влияние высоких доз нитроаммофоски на развитие растений. Интересно, что в контроле, то есть, без использования удобрений, развитие растений протекает лучше. Окончательный вывод был сделан нами перед снятием урожая. Размеры растений подсолнечника и сои, выращенные в предыду щем опыте, снова измерили, как и в предыдущем случае. Результаты приведены в табл. 8.
Для сои, как и в случае опыта с развитием корневой системы растений, влияние СУ практически не ощущается. Это объясняется повышенной потребностью сои в сере как в элементе питания и особенностями корневой микрофлоры, поэтому эффект от использования СУ проявляется только на ранних сроках развития растений. Для подсолнечника, эта ситуация противоположна, добавка СУ приводит к увеличению урожая зеленой массы, относительно вариантов без ее использования. Таким образом можно отметить, что использование СУ на фоне полного минерального питания не только ослабляет неблагоприятный эффект использования высоких доз удобрений, но и позволяет в ряде случаев значительно улучшить развитие некоторых с/х культур и может привести к значительным прибавкам урожая зеленой массы. Полученные результаты позволяют сделать обнадеживающий прогноз о дальнейшем использовании СУ в сельском хозяйстве.
Изучение влияния СУ на содержание соединений с тиольными группами в листьях и проростках растений
Соединения, содержащие тиольные группы, принимают активное участие при адаптации организмов к неблагоприятным экологическим условиям, В этой связи, задача определения содержания тиольных групп приобретает исключительную актуальность.
Изменения содержания водорастворимых небелковых соединений с тиольными группами в листьях и корнях исследуемых растений на 56-ой день после применения удобрений представлены в табл. 13.
Результаты показывают, что применение СУ на фоне полного минерального питания способствовало увеличению содержания соединений с тиольными группами во всех вариантах опыта. В целом содержание SH-групп было несколько выше в корнях, чем в листьях. Особенно значительно это проявляется, в случае корней и листьев сои, что может быть связано с усиленным включением серы в метаболизм этой культуры, в частности в синтез серосодержащих аминокислот и т.д. Для подсолнечника, как было показано выше потребность в сере несколько меньше, тем более, что основным направлением в метаболизме этой культуры является синтез жиров, а не белков. В случае с пшеницей картина должна отличаться и быть ближе к сое, так как для пшеницы синтез белков и клейковины более характерен, чем для подсолнечника. Те не менее результаты показывают практически полное отсутствие стимулирующего влияние использования СУ на накопление тиольных групп.
Для уточнения наблюдаемых эффектов нами было оценено содержание тиольных групп в урожае данных культур, в частности семенах подсолнечника, пшеницы и сои. Полученные результаты сведены в табл.14.
Действие СУ не проявляется в следующих поколениях, как видно из результатов определения тиольных групп в проростках исследуемых растений. Это говорит в пользу того, что использование этих удобрений экологически безопасно не только при непосредственном применении, но и в долгосрочной перспективе.
В целом, полученные данные красноречиво свидетельствуют о благотворном воздействии СУ на накопление соединений с тиольными группами в семенах всех без исключения культур. Повышение содержания тиолов в клетках растений является также убедительным доказательством в пользу того, что сера из удобрений эффективно используется растениями. Также можно предполо жить повышенную устойчивость растений, выращенных с использованием СУ к действию таких загрязнителей, как тяжелые металлы, фенолы и радионуклидов.
Структурно-функциональная роль липидов в метаболизме растительной клетки, изменение их синтеза и жирнокислотного состава при экстремальном воздействии определяет в последнее время интенсивное изучение этого класса соединений. Для выяснения характера воздействия СУ на фосфолипидный состав растений был поставлен ряд опытов
Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), были идентифицированы следующие фосфолипиды: фосфатидилхолин (ФЛХ), фосфатидилсерин (ФЛС) и фосфатидилинозит (ФЛИ). Как видно из результатов представленных в таблице 14, применение различных форм удобрений оказывает заметное влияние на содержание фосфолипидов в проростках исследуемых культур. I
Из представленных данных видно, что применение СУ на фоне полного минерального питания несколько стимулирует накопление всех исследуемых фракций ФЛ, причем в наибольшей степени это заметно для варианта с соей. Так как именно соя, является одним из основных растительных источников ФЛ, а оптимальный режим серного питания только стимулирует их биосинтез. В случае с подсолнечником влияние СУ практически не отмечается, что связано с меньшей потребностью в сере для этой культуры с одной стороны и нежелательностью внесения каких-либо средств химизации на ранних стадиях развития растений с другой. Практически не проявилось действие удобрений на проростках пшеницы, хотя в других опытах использование СУ оказывало эффект на всхожесть семян и развитие корневой системы. Возможно, в такой короткий срок действие СУ не проявляется, да и потребность в образовании.больших количеств ФЛ у пшеницы очень низкая. Вероятнее всего у пшеницы сера большей частью участвует в процессах синтеза белков и в энергетических процессах. В целом полученные данные хорошо согласуются с ранее полученными результатами по влиянию различных форм удобрений на всхожесть семян исследуемых культур. Стимуляция выработки основных ФЛ при прорастании возможно связана с улучшением режима серного питания и бкак следствие повышения уровня энергетических процессов в проростках. Более четкий вывод можно сделать при исследовании ферментов обмена фосфолипидов - фосфолипаз, что однако не является задачей данного исследования.
Дальнейшие испытания мы проводили на листьях исследуемых культур по методике приведенной в методической части работы. Необходимость проведе ния подобного исследования связана с тем, что основная масса ФЛ взрослого растения содержится в мембранах тилакоидов. Состояние этих мембран, нали чие в них необходимых составляющих, в совокупности с содержанием пластид ных пигментов, позволяет сделать объективный вывод о нормальном протека нии процессов в фотосинтетическом аппарате растений. Результаты исследова ний по влиянию удобрений на содержание ФЛ на 30-ый день постановки опыта в листьях подсолнечника, сои (3-4 ярус) и пшеницы (флаговые листья) пред ставлены в табл. Из приведенных результатов видно, что в случае с соей применение СУ достоверно увеличивает содержание ФЛХ и ФЛС в листьях, оказывая тем самым благотворное влияние на биосинтез этих компонентов в мембранах хлоро-пластов. Это может быть связано с нормализацией серного питания, и увеличения содержания серосодержащих кофакторов ферментов, в частности ацетил-коэнзима, который участвует в синтезе этих фосфолипидов. Концентрация ФЛИ достоверно не изменялась. Этот ФЛ является одним из ключевых, во многих реакциях энергетического обмена как переносчик фосфатных групп. В данном случае, можно полагать, что интенсификация энергетических процессов, (связываемая с повышением концентрации ФЛИ), в листьях сои не происходит.
