Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Суть и значение биологического метода защиты растений 11
1.2. Систематическое положение бактерий рода Pseudomonas 16
1.3. Морфологические, физиологические и культуральные особенности бактерий Pseudomonas 18
1.4. Экология бактерий рода Pseudomonas 21
1.5. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas 22
1.6. Влияние биопрепаратов на основе псевдомонад на микробиологическую активность почвы и на рост и развитие растений 28
Глава II. Объекты и методы исследования 36
2.1. Объект исследования 36
2.2. Методы исследования 36
2.2.1. Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 36
2.2.1.1. Микроскопический метод 36
2.2.1.2. Культуральный метод 37
2.2.1.3. Биохимические свойства 37
2.2.2. Оценка антагонистической активности Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 39
2.2.3. Изучение динамики роста Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 43
2.2.4. Методика фитопатологического анализа семян пшеницы в рулонах фильтровальной бумаги 43
2.2.5. Получение экспериментальных форм биопрепарата на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 44
2.2.6. Методика проведения исследования по влиянию температуры на хранение биопрепаратов 46
2.2.7. Методика проведения полевого мелкоделяночного эксперимента 47
2.2.8. Отбор и подготовка почвенных образцов 48
2.2.9. Определение влажности почвы 48
2.2.10. Метод выделения и учета почвенных микроорганизмов на плотных питательных средах 49
2.2.11. Метод комочков обрастания 50
2.2.12. Метод выделения анаэробных азотфиксаторов 51
2.2.13. Определение титра бактерий группы кишечной палочки 51
2.2.14. Определение термофильных бактерий 52
2.2.15. Определение интенсивности дыхания почв 52
2.2.16. Статистическая обработка результатов 53
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение 54
3.1. Морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки Pseudomonas sp 54
3.2. Антагонистическая активность Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens при различных условиях культивирования 55
3.2.1. Подбор питательной среды оптимальной для синтеза антибиотических веществ Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 55
3.2.2. Кривая роста Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 59
3.2.3. Антибактериальная активность Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 60
3.2.4. Антифунгальная активность Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 62
3.2.5. Влияние Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens на прорастание конидий плесневых грибов 68
3.2.6. Фитопатологический анализ семян пшеницы в рулонах фильтровальной бумаги 71
3.3. Влияние температуры хранения на титр бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 72
3.4. Состояние микробоценоза почвы после применения биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 79
3.5. Санитарное состояние почвы по микробиологическим показателям 90
3.6. Сравнение эффективности применения жидкой, торфяной, вермикулитной и перлитной форм биопрепарата на рост и развитие ярового ячменя 92
Заключение 101
Выводы 106
Список литературы 108
Приложение 133
- Метаболиты бактерий рода Pseudomonas
- Оценка антагонистической активности Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
- Антифунгальная активность Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
- Состояние микробоценоза почвы после применения биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
Введение к работе
Актуальность исследований. Ускоренные темпы научно-технического прогресса и совершенствование сельскохозяйственного производства расширяют степень воздействия человека на биосферу в целом и особенно на агробиоценозы. Интенсификация приемов возделывания сельскохозяйственных культур приводит к сдвигу баланса между микроорганизмами в сторону патогенов. Одной из главных причин заболеваний растений является нарушение их питания из-за снижения плодородия почв, которое существенно зависит от состояния почвенной биоты (Шуляковская, Сасова, 2012). В сложившихся условиях современного аграрного производства для получения биологически полноценной продукции растениеводства и сохранения плодородия почв необходимо экологически целесообразное хозяйствование (Новикова, 2005). Глобальное нарушение экологического равновесия в природе и появление патогенов, толерантных к большинству современных химических средств защиты растений, требуют разработки биологических препаратов на основе ризосферных микроорганизмов – естественных антагонистов фитопатогенных бактерий и грибов (Кравченко и др., 2006). Среди различных таксономических групп широким набором полезных для растений свойств выделяются грамотрицательные ризосферные бактерии рода Pseudomonas (Боронин, 1998; Боронин, Кочетков, 2000), которые являются одной из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Логинов, 2005; Горбунов, 2008; Benizri et al., 2001). Недостаток знаний о взаимоотношениях ризобактерий с другими компонентами экосистем существенно снижает эффективность применения этих препаратов в земледелии.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании антагонизма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens с целью создания на его основе экспериментального биопрепарата, а также проверка его влияния на микробоценоз почвы.
Задачи исследования:
идентифицировать культуру Pseudomonas sp., выделенную из почв г. Ростова-на-Дону;
исследовать антагонистическую активность Pseudomonas sp. в отношении различных видов бактерий и плесневых грибов;
оптимизировать состав питательной среды для культивирования исследуемого штамма псевдомонады с целью повышения синтеза антагонистических веществ;
разработать основные принципы получения экспериментальных биопрепаратов в жидкой форме и на основе носителей (торфа, вермикулита и перлита) в лабораторных условиях;
установить оптимальные температурные режимы хранения биопрепаратов;
определить влияние разработанного биопрепарата на почвенную микрофлору (численность основных физиологических групп: бактерий, актиномицетов, грибов, олигонитрофилов, содержание аэробных и анаэробных азотфиксаторов);
исследовать действие разных форм экспериментального биопрепарата (жидкая форма, на торфе, вермикулите, перлите) на рост и развитие ярового ячменя в условиях полевого мелкоделяночного эксперимента.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Культура Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, выделенная из почв г. Ростова-на-Дону, обладает способностью к синтезу метаболитов с антибактериальными и антифунгальными свойствами.
-
Экспериментальные биопрепараты, полученные на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, как в жидкой форме, так и на твердых носителях (торф, перлит, вермикулит), сохраняют потребительские качества в течение двух - шести месяцев.
-
Экспериментальные биопрепараты оказывают стимулирующее действие на микробоценоз почвы.
Научная новизна работы. Установлена антагонистическая активность штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens в отношении бактерий и плесневых грибов, в том числе и фитопатогенных. Впервые выполнены исследования по изучению возможностей использования перспективных носителей: перлита и вермикулита, для ризосферной бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens с целью создания технологичной и эффективной формы микробного биопрепарата. Изучена динамика жизнеспособности исследуемой псевдомонады при хранении в лабораторных условиях в составе экспериментальных биопрепаратов разных форм (жидкой, вермикулитной, перлитной и торфяной). Дана сравнительная характеристика влияния экспериментального биопрепарата и химического препарата «Дивиденд Стар» на структуру урожая ярового ячменя и микробоценоз почвы.
Теоретическая и практическая значимость. Подобраны питательные среды и сроки для культивирования Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, оптимальные для синтеза метаболитов, обладающих антибактериальной и антифунгальной активностями. Проведены испытания экспериментального биопрепарата на культуре ярового ячменя. Результаты исследования позволяют судить о том, что Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens может быть использован для стимуляции роста и защиты растений. Результаты работы могут быть применены для оздоровления и повышения плодородия почв, а также для производства экологически чистой сельскохозяйственной продукции.
Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении общих курсов («Микробиология», «Биология почв»), специальных курсов («Техническая микробиология», «Промышленная микробиология» и др.) и элективного курса «Микроорганизмы и окружающая среда» в Южном федеральном университете.
Личный вклад автора. Тема, цель, задачи, объекты, методы и план исследования определены автором совместно с научным руководителем. Полевые исследования, отбор образцов почвы, лабораторные опыты осуществлены лично автором. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и основных защищаемых положений сделаны лично автором при направляющем и корректирующем участии научного руководителя.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на III, IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011); 8-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века – будущее Российской науки» (Ростов-на-Дону, 2010); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии (XIII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования». Секция 1: «Биологические науки» (Махачкала, 2011); 5-й международной конференции молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция» (Одесса, 2011); I международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2011); 50-й юбилейной международной студенческой научной конференции «Студент и научно-технический прогресс». Биология. (Новосибирск, 2012); научной конференции «Неделя науки 2012» студентов и аспирантов факультета биологических наук Южного федерального университета (Ростов-на-Дону, 2012); научно-практической конференции “Адаптационные стратегии живых систем» (Крым, 2012); II Всероссийской с международным участием молодежной научной школе-конференции: «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2012); третьем съезде микологов России (Москва, 2012); II международной научно-практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); молодежной конференции «Миссия молодежи в науке» (Ростов-на-Дону, 2012).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 19 научных работ, объемом 1 п.л., из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Личный вклад автора составил 85 %.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа содержит 8 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 214 источников, из них 55 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность доценту кафедры биохимии и микробиологии ЮФУ, к.б.н. А.В. Поляковой за постоянное внимание и большую помощь в работе, а также профессору, д.б.н. И.В Корниенко. за помощь в идентификации Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens. Автор благодарит доцента кафедры ботаники ЮФУ, к.б.н. В.А. Русанова за консультации при работе с плесневыми грибами.
Метаболиты бактерий рода Pseudomonas
Бактерии рода Pseudomonas обладают природной способностью продуцировать свыше 300 видов антимикробных соединений, фитогормоны, микробные пигменты, гидролитические ферменты, а также соединения, стимулирующие иммунитет растений и повышающие их устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды (Смирнов, Киприанова, 1990; Максимова и др., 2011; Chancey et al., 2002).
Синтез антибиотиков и антибиотикоподобных веществ зарегистрирован у представителей более 20 видов рода Pseudomonas, значительную часть которых составляют ризосферные и почвенные бактерии "флюоресцирующей группы" — Pseudomonas fluorescens, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. putida. В настоящее время у псевдомонад обнаружено более 100 антибиотиков ароматического строения, интерес к которым связан с их активностью в отношении ряда возбудителей болезней животных и сельскохозяйственных растений (Худяков и др., 1965; Феклистова, Максимова, 2008; Thomashow et al, 1990; Raaijmakers et al., 2002).
По химической природе антибиотики псевдомонад принадлежат к феназинам, пирролам, производным индола и являются промежуточными или конечными продуктами метаболизма ароматических соединений (Лысак, 2007).
Среди антибиотиков, продуцируемых псевдомонадами, обнаружены феназин-1-карболовая кислота, производные флороглюцина, пирролнитрин, цианид водорода и пиолютеорин, циклические липополипептиды (Vincent et al., 1991; Nielsen et al., 2000; Loper, Gross, 2007).
Феназиновые антибиотики представляют собой низкомолекулярные гетероциклические азотсодержащие соединения, синтезируемые в ходе реакций ароматического пути. Основу всех соединений данного ряда составляет феназин-1-карбоксилат (PC А), а феназин, 2-оксифеназин-1-карбоксилат, пиоцианин, оксихлорорафин, гемипиоцианин - его производные (рис. 1).
Как правило, бактерии одного и того же штамма могут продуцировать несколько типов феназиновых соединений. Так, например, Ps. chlororaphis {aureofaciens) штамм 30-84 продуцирует феназин-1-карболовую кислоту, 2-гидрокси-феназин-1-карболовую кислоту и 2-гидрокси-феназин (Pierson et al., 1994; Delaney et al., 2001; Maddula, 2008). Установлено, что эти феназины и quorum-sensing (QS) участвуют в формировании биопленок у штамма 30-84 Ps. chlororaphis {aureofaciens) (Maddula et al., 2008). Показано, что уровень продукции феназиновых соединений коррелирует с антифунгальной активностью (Веремеенко и др., 2009; Whistler, Pierson, 2003; Morello et al., 2004).
Известно, что в основе механизма действия соединений феназинового ряда лежит способность генерировать активные формы кислорода (02—, ОН- и Н2О2), обладающие чрезвычайно высокой реакционной способностью, что вызывает гибель чувствительных к ним микроорганизмов (Веремеенко и др., 2010).
Значительный интерес представляет антибиотик широкого спектра действия, продуцируемый бактериями Pseudomonas, - пирролнитрин - ([3 хлоро-4-(2 -нитро-3-хлорофенил)пиррол]). Активность пирролнитрина обусловлена нарушением работы электрон-транспортной цепи вследствие блока передачи электронов на участке между дегидрогеназой и цитохромом сь что приводит к нарушению клеточного дыхания, и, как следствие, угнетению роста микроорганизмов. В настоящее время пирролнитрин признан одним из самых эффективных антибиотиков по способности подавлять вегетативную и генеративную функции патогенных грибов. В отношении бактерий действие пирролнитрина является менее выраженным (Феклистова, Максимова, 2008). Многие представители рода Pseudomonas синтезируют пигменты, относящиеся к различным группам соединений. Наиболее разнообразно представлена у них группа феназиновых пигментов. Производными феназина являются следующие пигменты: пиоцианин, гемициоцианин, феназин-1 карбоксиловая кислота, хлорорафин и др. (Рубан, 1986). В условиях «металлического» стресса наблюдается стойкое снижение пигментсинтезирующей способности бактерий и образование безпигментных колоний (Rylskiy, 2010).
Среди антимикробных веществ, продуцируемых ризосферними бактериями рода Pseudomonas, особый интерес вызывают флуоресцирующие пигменты - пиовердины - уникальные соединения, которые характеризуются высокой хелатирующей ионы железа способностью и являются сидерофорами бактерий данного рода (Кулишова и др., 2008). Сидерофоры псевдомонад имеют различную химическую структуру и обладают, как правило, высоким сродством к трехвалентному железу, образуя с ним стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, такими как Alternaria sp., Pythium sp., Fusarhtm sp. (Воронин, 1998; Современная микробиология, 2009; Farhan et al., 2010). Например, желто-зеленый пигмент - псевдобактин (пиовердин), будучи сидерофором, обеспечивает фунгистатическое действие Р. fluorescens за счет создания дефицита железа для фитопатогенных грибов (Вязовая и др., 2006). В опытах с тест-объектом Pythium aphanidermatum водорастворимые сидерофоры в щелочной среде (рН 8) проявляют более сильное ингибирующее действие на патоген, чем в кислой (рН 6), что объясняется различиями в концентрации доступного железа в среде (Соколов, 1990). Молекулярная масса псевдобактинов, полученных из различных видов псевдомонад, составляет в среднем 1500 Д. Главные компоненты молекулы -хинолиновый хромофор и 6-ти членная пептидная цепь, содержащая в частности, необычный Ыб-оксиорнитин (Смирнов, Киприанова, 1990) (рис. 2).
Флуоресцирующие пигменты бактерий рода Psendomonas (пиовердины и псевдобактины) относятся к сидерофорам смешанного типа, так как связывание ионов железа обеспечивается одной катехольной группой хромофора, а также одной гидроксаматной и одной ооксикислотной группами, которые принадлежат модифицированным аминокислотам N -оксиорнитину и Р-оксиаспарагиновой кислоте, находящимся в составе пептидной части молекулы сидерофора (Кулешова и др., 2006). Антагонистическая активность пиовердинов определяется уникальностью строения их пептидной составляющей. Вместе с тем, изменяя состав и композицию аминокислот в этой части молекулы можно получать мутантные штаммы псевдомонад с более широким спектром антибактериальной активности (Кулешова и др., 2008). Способность бактерий рода Psendomonas продуцировать сидерофоры зависит от содержания железа и типа источников углерода в окружающей среде (Rachid, Ahmed, 2005; Jankiewicz, 2006).
Советские и зарубежные исследователи еще в 30-х годах прошлого столетия отмечали, что в состав желто-зеленого флуоресцирующего пигмента, синтезируемого псевдомонадами, входят рибофлавин, фолиевая кислота, птерин. Использование современных методов исследования позволило выделить в кристаллически чистом виде и определить составные части витаминов птеридинового и каротиноидного типов, образуемых псевдомонадами (Рубан, 1986).
Кроме этого, из бактерий рода Pseudomonas выделены новые своеобразные по структуре и спектру действия аминогликозиды, псевдомоновые кислоты, эффективные в отношении антибиотикорезистентных возбудителей заболеваний растений, животных и человека (Богданович, Страчунский, 1999).
Рядом авторов в составе культуральной жидкости бактерий рода Pseudomonas обнаружены новые метаболиты пептидной природы (триглицеридпептиды), обладающие фунгицидной активностью и не проявляющие свойств сидерофоров (Логинов и др., 2003). Показана способность триглицеридпептидных метаболитов штамма рода Pseudomonas образовывать межмолекулярные комплексы с такими экссудатами растений, как углеводы, органические кислоты и аминокислоты, тем самым лимитируя по субстрату фитопатогены (Четвериков и др., 2009).
Псевдомонады способны синтезировать и различные ферменты, расщепляющие липиды, белки и хитин, входящий в состав клеточной стенки грибов: например, ферменты хитиназа и 3-1,3-глкжоназа продуцируются Р. fluorescens (Nakkeeran et al, 2006).
Изучена способность ризосферных бактерий рода Pseudomonas продуцировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), которая является фитогормоном из ряда ауксинов, регулирующих рост и развитие корневой системы растений (Храмцова и др., 2006). Положительное влияние ИУК, выделяемой бактериями, зависит от её концентрации, и от вида самого растения (Олюнина, Шабаева, 1996). Кроме ИУК псевдомонады способны продуцировать цитокины. Так, для штамма бактерий P. chlororaphis ИБ 6 показана возможность выделять метаболиты с фитогормональной активностью цитокининовой природы (Четвериков, Логинов, 2011).
Оценка антагонистической активности Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
При подборе питательной среды оптимальной для синтеза антибиотических веществ антагонистическую активность штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens изучали методом агаровых блочков и методом колец (Егоров, 1986).
Для постановки первого метода было выбрано шесть агаризованных сред, из которых четыре являются универсальными для роста почвенных бактерий, такие как:
- мясо-пептонный агар (МПА) (1:10);
- мясо-пептонный агар (МПА) (1:100);
- крахмало-аммиачный агар (КАА);
- почвенный агар (ПА);
- среда № 1;
- среда №2 (приложение 1).
Для получения культуральной жидкости при постановке метода колец было выбрано восемь сред - это указанные выше шесть сред в жидкой консистенции и дополнительно среды №3 и №4 (приложение 1), используемые для получения антибиотических веществ при культивировании актиномицетов.
В качестве тест-культур было взято шесть штаммов микроорганизмов, отличающихся по морфологии, окраске по Граму, способности к спорогенезу: Proteus sp., Micrococcus sp. (из музея живых культур лаборатории микробиологии кафедры биохимии и микробиологии ЮФУ), Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Bacillus cereus и Erwinia herbicola (выделенные с поверхности листовых пластинок пшеницы).
Кроме того, была изучена антагонистическая активность к эндемичным видам. Доминирующие виды бактерий были получены из музея живых культур лаборатории микробиологии кафедры биохимии и микробиологии ЮФУ.
Культуры микроорганизмов ранее были выделены из почв с разной степенью антропогенной нагрузки: жилой, рекреационной и промышленной зон городов Ростова-на-Дону и Азова с глубин 0-20 см (верхний слой) и 20-40 см (нижний слой).
Доминанты почв г. Азова: Bacillus pumilus A3 - из верхнего слоя почв рекреационной зоны, Bacillus cereus А2, А4 и А6 - из нижнего слоя почв жилой, рекреационной и промышленной зон, соответственно. Доминанты почв г. Ростова-на-Дону: В. cereus PI и Р2 - из верхнего и нижнего слоев почв жилой зоны, В. panthotenticus PI - из верхнего слоя почв жилой зоны, В. panthotenticus РЗ и Р4 - из верхнего и нижнего слоев почв рекреационной зоны.
Антагонистическую активность штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens по отношению к плесневым грибам изучали на среде Чапека методом агаровых блочков (Егоров, 1986). В качестве тест-объектов для определения спектра антагонистического действия псевдомонад были использованы следующие плесневые грибы: Aspergillus niger Varga, Frisvad & Samson, Aspergillus amylovorus Panas, Penicillium sp. (1), Penicillium sp. (2), Fusarium moniliforme J. Sheld (из коллекции плесневых грибов кафедры биохимии и микробиологии и кафедры ботаники ЮФУ), Cladosporium cucumerinum El is & Arthur (выделенный с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов, идентифицирован Русановым В.A.), Penicillium ochrochloron ВКМ 2032 Biourge, Penicillium chrysogeniim BKM 245 Thorn, Penicillium brevicompactum BKM 234 Dierckx, Aspergillus terreus BKM 1025 Thorn. Культуры грибов хранили при 4 С на скошенной агаризованной среде Чапека. Штаммы грибов культивировали на скошенной среде Чапека при 24 С в течение 7 суток. Затем готовили 5 мл суспензии спор гриба (титр 10 спор/мл).
Культуру Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens выращивали поверхностно на двух агаризованных средах: среда №1 и среда №2. После трех-и пятисуточного культивирования вырезали блоки (высотой 5 мм, диаметром 10 мм) и помещали на среду Чапека, засеянную сплошным газоном суспензией спор плесневых грибов (по 2 блока одного штамма на 1 чашку). Влияние на развитие гриба оценивали в 2-кратной повторности. Чашки инкубировали в термостате в течение пяти суток, при температуре 28 С. Зоны отсутствия и подавления роста грибов, образовавшиеся вокруг блоков, измеряли в миллиметрах.
Антифунгальную активность штамма P. chlororaphis по отношению к фитопатогенным плесневым грибам Fusarium sp. (выделенный с пораженных семян пшеницы) и Cladosporium sp. (выделенный с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов) изучали на среде Чапека методом агаровых блочков и бумажных дисков. Культуру антагониста выращивали в течение двух, трех, четырех и пяти суток на четырех агаризованных и жидких средах: среда №1, среда №2, среда Кинг В и почвенная вытяжка. Плесневые грибы засевались «сплошным газоном» на среду Чапека, куда затем раскладывали агаровые блочки (диаметром 10 мм) с культурой псевдомонады или бумажные диски (диаметром 6 мм), пропитанные культуральной жидкостью изучаемого антагониста. Чашки инкубировали в термостате в течение семи суток, при температуре 28 С. Зоны отсутствия и подавления роста грибов от блока или диска до начала роста измеряли в миллиметрах. Для изучения влияния штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens на прорастание спор фитопатогенных грибов было проведено совместное культивирование исследуемого антагониста с плесневыми грибами Cladosporium cucumerinum (выделенный с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов) и Fusarium sp. (выделенный с пораженных семян пшеницы) методом микрокультуры. Культуру псевдомонады в течение трех суток выращивали на двух жидких питательных средах, оптимальных по составу для синтеза антифунгальных метаболитов, - среда №1 и среда №2. Культивирование осуществлялось в 100 мл питательной среды в колбах объемом 500 мл при температуре 28 С. Далее в каплю культуральной жидкости Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens (10 кл/мл) вносили конидии плесневых грибов (титр 106 спор/мл). Размеры ростковых трубок и гиф плесневых грибов измеряли на первые, вторые и третьи сутки совместного культивирования при температуре 27 С с помощью винтового окулярного микрометра. Контрольным считался рост плесневых грибов в капле стерильной водопроводной воды (Методы экспериментальной микологии, 1982).
Взаимодействие псевдомонады с плесневым грибом Fusarium sp. изучали на предметном стекле. Половину стерильного предметного стекла заливали агаризованной питательной средой № 2, которую засевали сплошным газоном Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens. Инкубацию проводили в течение трёх суток в термостате при температуре 28 С. Затем готовили суспензию спор Fusarium sp. и вносили её в питательную среду Чапека. Тщательно перемешивали и вылевали на вторую половину предметного стекла. После пяти суток инкубации в термостате при температуре 28 С проводили микроскопическое исследование. Эксперимент ставили в трех повторностях (Методы экспериментальной микологии, 1982).
Антифунгальная активность Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
У бактерий рода Pseudomonas обнаружено около 100 антибиотических веществ самого разного строения и только около 20% из них играют роль в подавлении плесневых грибов. Например, штамм P. chlororaphis 449 проявлял антагонистическую активность против широкого спектра фитопатогенных грибов. Клетки штамма синтезировали три антибиотика феназиновой природы, с продукцией которых было, главным образом, связано ингибирующее действие на фитопатогенные грибы (Веселова и др., 2006).
Фунгицидную активность Pseudomonas chlororaphis subsp. aareofaciens оценивали по размеру зоны подавления развития гриба. Зона подавления представляла собой прозрачную область вокруг лунок или агарового блока без следов мицелия гриба. Из данных таблицы 2 видно, что исследуемые плесневые грибы обладают разной степенью чувствительности к действию метаболитов, продуцируемых штаммом Pseudomonas chlororaphis: суммарные зоны фунгицидной и фунгистатической активности составляли от 2 до 16-18 мм. При сравнении полученных результатов с литературными данными, можно отметить, что максимальная антифунгальная активность исследуемого штамма псевдомонады по отношению к различным видам плесневых грибов больше на 12-16 мм, чем антифунгальная активность Pseudomonas chlororaphis SPB1217, выделенного из почв северо-западного региона России (Кравченко и др., 2002). Так диаметры зон ингибирования плесневых грибов штаммом SPB1217 варьировали от 6 до 30 мм, а для изучаемого штамма они составили от 14 до 42-46 мм (значения зон отсутствия роста мицелия плесневого гриба (табл. 2) помноженные на два, плюс диаметр блока (10 мм)).
Установлено, что Cladosporium cucumerinum среди исследованных десяти плесневых грибов наиболее чувствителен к воздействию культуры-антагониста, при этом следует помнить, что представители рода Cladosporium являются фитопатогенами.
Анализ данных показывает, что максимальную антибиотическую активность в отношении большинства плесневых грибов, за исключением PeniciUium ochrochloron и Penicillium sp. (2), исследуемый штамм проявляет на третьи сутки культивирования, при этом наблюдаются самые большие зоны отсутствия роста до 11 мм. А для таких грибов как Fusarium moniliforme и PeniciUium chiysogenum действие на третьи и пятые сутки одинаково.
Далее для подбора питательной среды с максимальным синтезом метаболитов для подавления роста фитопатогенных плесневых грибов {Fusarium sp. (выделенный с пораженных семян пшеницы) и Cladosporium cucumerinum (выделенный с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов) изучали антифунгальную активность штамма Pseudomonas chlororaphis методом «агаровых блочков» и бумажных дисков. Для этого культуру антагониста выращивали в течение двух, трех, четырех и пяти суток на четырех агаризованных и жидких средах: среде №1, среде №2, среде Кинг В и почвенной вытяжке. Среды №1 и №2 выбраны потому, что на них ранее установлена наибольшая антагонистическая активность; среда Кинг В -является одной из основных для выращивания бактерий рода Pseudomonas -продуцентов веществ с фунгицидной активностью (Сбойчаков, 2007), а почвенная вытяжка считается оптимальной для роста почвенных бактерий (Практикум по микробиологии, 2005).
Анализ данных показывает, что степень антифунгальной активности штамма Pseudomonas chlororaphis по отношению к исследуемым фитопатогенным грибам, так же как и антибактериальная активность, зависит от среды культивирования (табл.3). Так, при культивировании его на почвенной вытяжке антагонист проявил меньшую ингибирующую активность, чем на остальных трех средах. Из этого можно сделать вывод, что почвенная вытяжка являлась наименее оптимальной средой для продукции веществ с фунгицидной активностью. Наибольшую антагонистическую активность штамма наблюдали на среде №2, на которой и к Fusarium sp., и к Cladosporium cucitmerimim, отмечены максимальные суммарные зоны фунгицидной и фунгистатической активности (12 мм).
Из данных таблицы видно, что заметно выраженную фунгицидную активность псевдомонада проявила уже со вторых суток культивирования (6,5 -7 мм на среде №1 и Кинг В), а самые большие зоны отсутствия роста наблюдали на третьи-четвертые сутки и, они достигали 8 мм для Cladosporium cucumerinum на среде №2. Как правило, культивирование псевдомонад с целью получения антибиотиков фунгицидной природы проводят в течение 48-72 ч при температуре 24-28 С в условиях аэрации (Walsh et al., 2011). И также, как правило, максимальный рост фунгицидной активности наблюдается в стационарную фазу. Для исследуемого штамма псевдомонады переход в стационарную фазу роста наблюдался, как раз, ко вторым - третьим суткам.
Антифунгальная активность штамма Pseudomonas chlororaphis в отношении культур изученных видов фитопатогенных грибов отличалась. По сравнению с Fusarium sp., Cladosporium cucumerinum оказался более чувствительным к воздействию антагониста. Так, зоны отсутствия роста в случае Cladosporium cucumerinum составляют 7-8 мм (рис. 7).
При сравнении результатов методов агаровых блоков и бумажных дисков для определения антифунгальной активности обнаружили, что значения для всех питательных сред сходны. Поэтому можно говорить о том, что оба метода адекватны для изучения антагонистических свойств псевдомонад.
Таким образом, показано, что исследуемый штамм Pseudomonas chlororaphis проявил хорошо выраженную антифунгальную активность в отношении фитопатогенных грибов.
Состояние микробоценоза почвы после применения биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
Почвенный покров и почвы подвержены различным формам деградации агрогенного и техногенного происхождения, что приводит к снижению плодородия и нестабильности его (Хазиев, 2009).
Повышение и поддержание почвенного плодородия - одна из самых важных и сложных задач практической и теоретической деятельности человека. Микроорганизмы почвы являются активной частью природных биоценозов и играют существенную роль в создании почвенного плодородия. Микробное население почвы перерабатывает огромные количества органических и неорганических веществ, что приводит к обогащению почвы перегноем и накоплению соответствующих количеств различных минеральных соединений, которые используются растениями для питания. То есть, чем лучше показатели «благосостояния» почвенной микрофлоры, тем устойчивее состояние агроценоза. Поэтому для того, чтобы получить максимальный урожай и в то же время сохранить плодородие, необходимо создавать благоприятные условия для почвенной микрофлоры. Урожайность сельскохозяйственных культур и интенсивность микробиологических процессов, протекающих в почве, находятся в прямой зависимости, поэтому большое значение приобретают способы активизации микробиологических процессов в ней (Казадаев, Пономаренко, Вальков, 1997; Казадаев, Симонович, Везденеева, 2006).
Микробные сообщества - живые системы, которые подвергаются влиянию внешних факторов, что ведет к адекватным изменениям в сообществе - как качественным, так и количественным. Поэтому их изучение имеет большое значение (Buckley, Schmidt, 2003)
В ходе анализа полученных данных нами выявлено, что численность бактерий во всех опытных образцах достоверно превышала контрольное значение (рис. 11). То есть самый низкий показатель зафиксирован в почве контрольного варианта - 0,14±0,015х 105 КОЕ /г почвы. В варианте «Химический препарат» численность гетеротрофов превышала контроль незначительно, всего в три раза.
Максимальный показатель численности бактерий зафиксирован в почве, отобранной после применения биопрепарата «Перлит 1». Численность бактерий в этом варианте составила 4,39±0,13х10: КОЕ /г почвы, т.е. в 31,4 раза больше, чем в почве контрольного варианта, и в 8,8 раза превышала численность бактерий после применения химического препарата.
На участках с препаратами на основе жидких форм этот показатель ниже и составил 2,05±0,35хЮ5 КОЕ /г почвы у «Жидкой формы 1» и 2,24±0,18х105 КОЕ /г почвы у «Жидкой формы 2», что, однако в четыре раза выше, чем в почве, обработанной химическим препаратом.
Таким образом, для популяции гетеротрофных бактерий применение всех форм экспериментальных биопрепаратов оказывает позитивное влияние. Лучшей формой биопрепарата оказался «Перлит 1». Заметное увеличение численности микроорганизмов - положительное явление, так как с ростом активности почвенной микрофлоры возрастает и ее антагонистический потенциал по отношению к широко распространенным в почвах возбудителям корневой гнили зерновых культур (Евсеев, 2005; Отурина и др., 2008).
Численность актиномицетов, в отличие от предыдущей группы, в трех вариантах опыта, таких как «Химический препарат», «Торф 2» и «Вермикулит 2», ниже, чем у контрольного варианта (рис. 12).
Актиномицеты, в отличие от сапротрофов, живут не за счет экзосмоса растений, а принимают активное участие в разложении отмирающих корней, поэтому их наибольшая численность отмечается в завершающие фазы развития растений (Масленникова, 2011). Вследствие этого численность актиномицетов превышает численность бактерий во всех вариантах в несколько раз. Минимальное количество актиномицетов зафиксировано на участке с химическим препаратом - 4,98±0,25 10э КОЕ /г ночвы, в 1,33 раза меньше, чем в контрольном варианте. Видимо, данный препарат обладает не только явным выраженным фунгицидным действием, но и подавляет мицелиальные прокариотические организмы.
Биопрепарат на носителе перлит 1 оказал самое позитивное влияние на состояние популяции актиномицетов. В его присутствии их численность равна 16,90±4,5х105 КОЕ /г почвы, т.е. выше в 2,55 раза, чем в почве контрольного варианта.
Стоит отметить, что на участках с применением биопрепаратов на основе среды № 1, количество актиномицетов больше, чем на соответствующих участках с биопрепаратами с использованием среды № 2. В то время как для бактерий, наоборот, с одним исключением в варианте с применением перлита.
Суммируя полученные данные, можно сказать, что для актиномицетного сообщества лучшей препаративной формой является «Перлит 1».
Численность микроорганизмов, утилизирующих минеральный азот, превышает число аммонификаторов, что свидетельствует об активизации процессов минерализации органических соединений (приложение 4). Это подтверждается величиной коэффициентов микробиологической минерализации. Соотношение численности микроорганизмов, использующих минеральные формы азота, и аммонификаторов (КАА/МПА) характеризует процесс минерализации свежих органических остатков (рис. 13).
Наименьшая интенсивность процессов минерализации наблюдалась в почве после применения биопрепаратов на основе перлита на двух средах и вермикулита на основе среды 2. В этих вариантах данный показатель оставался на уровне ниже единицы, что свидетельствует о том, что их применение снижает интенсивность процессов минерализации в почве и является показателем аккумуляции органического вещества, в том числе в виде гумуса. Активация же процессов минерализации органического вещества выявлена в варианте «Химический препарат», где наблюдался самый высокий показатель коэффициента минерализации (2,06).
