Фторсодержащие -дикарбонильные бензогетероциклические соединения для экологического анализа биозагрязнителей Кострюкова, Татьяна Сергеевна

Введение к работе

Актуальность исследований.

Обнаружение опасных биологических загрязнителей - прионов, вирусов, риккетсий, бактерий, грибов, простейших и других биологических инфекционных загрязнителей, а также токсинов у инфицированных людей, животных, растений, в объектах окружающей среды следует рассматривать как важный элемент системы обеспечения экологической безопасности. Одно из основных направлений анализа, наиболее интенсивно развивающееся последние годы, это иммунофлуоресцентный анализ (ФИА), в основе которого находится регистрация реакций биоспецифического взаимодействия люминесцирующими реагентами - маркерами. На первоначальных этапах развития в различных вариантах флуоресцентного иммуноанализа применялись олигобензоциклические и гетероциклические соединения, которые относятся к ряду ксантена, нафталина, антрацена, пирена, кумарина, порфирина и т.д. Многие из них успешно используются и в настоящее время. Наибольшее значение в последние десятилетия получили методы ФИА, основанные на использовании комплексов металлов. Среди них наиболее известны порфириновые комплексы благородных металлов (Pt, Pd), и комплексы лантанидов (Eu, Tb, Sm, и т.д.). Существенным преимуществом этих реагентов являются большие времена жизни в возбужденном состоянии (~0,04-1,0 мс), что позволяет реализовать методики регистрации флуоресценции с временной задержкой и исключить фоновое влияние биологического материала проб (белка) и материалов подложки (пластика планшета). В результате пороговый уровень детекции люминесцентных меток повышается в 100-1000 раз. Аналитические методы, основанные на применении лантанидных комплексов сгруппированы в методе ЛИФА – лантанидом иммунофлуоресцентном анализе, технологии которого базируются на детектировании комплексов фторированных -дикетонов с лантаноидом. Наиболее часто используются комплексы Eu³⁺. В настоящее время чувствительность методик ЛИФА достигает 10^-14 моль/л, однако для многих целей экологического анализа даже такая чувствительность не является удовлетворительной. В частности, многие патогены, токсины, а также и абиотические экотоксиканты представляют опасность и в меньших концентрациях, особенно при продолжительных воздействиях. Таким образом создание новых эффективных комплексообразующих реагентов ряда фторированных -дикетонов, увеличивающих чувствительность экологического анализа биологических загрязнителей, является актуальным. Актуальность темы исследования проистекает из следующих причин. Во-первых, для практического использования люминесцентных методик в экологическом анализе целесообразным является применение дешевых источников возбуждения, что может быть достигнуто при реализации методик с применением хромофоров с длинноволновым возбуждением (360-400 нм). Метки, содержащие такие хромофоры, в методе ЛИФА и других люминесцентных методиках с временной задержкой разработаны недостаточно. Во-вторых, целесообразно увеличить устойчивость комплексов Eu³⁺ в сравнении с используемыми в настоящее время (~10^-7 М^-1), что должно привести к симбатному увеличению чувствительности экологического анализа. В-третьих, диссоциативные варианты иммунофлуоресцентного анализа, в частности реализованный в клиниках метод «Delfia», предполагают использование стадии перекомплексообразования ионов лантаноидов и не пригодны для многих методик прямого мечения и, в том числе, для мультикомпонентного определения экотоксикантов в одной пробе. В связи с этим перспективна разработка реагентов, имеющих возможность для последующего конъюгирования с белковыми молекулами посредством активных функциональных групп, отделенных от хромофорной части специальной инертной "ножкой" - спейсером. Эти же реагенты могут стать чрезвычайно полезными для создания флуоресцирующих частиц нанопараметрового размера.

Настоящая работа посвящена разработке фторсодержащих -дикарбонильных бензогетероциклических соединений как аналитических реагентов, которые могут использоваться в экологическом анализе биологических загрязнителей.

Целью настоящего исследования является разработка фторсодержащих -дикарбонильных бензогетероциклических реагентов, удовлетворяющих требованиям современного иммунофлуоресцентного анализа биозагрязнителей.

В соответствии со сформулированной целью в работе были поставлены следующие задачи:

1. На основе обзора литературных сведений, касающихся современного состояния люминесцентного анализа, выбрать объекты изучения среди аналитических реагентов с оптимальным комплексом свойств, определяющих перспективы их дальнейшего практического использования.

2. Исходя из анализа литературы, а также экспериментально, определить оптимальные условия получения фторсодержащих -дикарбонильных бензогетероциклических соединений, осуществить синтез известных ранее и новых представителей этого ряда. Изучить особенности их строения и физико-химические свойства.

3. Изучить комплексообразование полученных комплексонов с лантанидами и ионами других металлов, представляющих интерес в экологическом плане, оценить люминесцентно-спектральные свойства образующихся комплексов. Разработать методы получения фторсодержащих -дикарбонильных бензогетероциклических синтонов, имеющих активные функциональные группы, пригодные для создания флуоресцирующих наночастиц и для введения в белковые молекулы.

4. Провести мечение белковых молекул фторсодержащими -дикарбонильными бензогетероциклическими соединениями и оценить возможности использования полученных конъюгатов для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий.

5. Разработать методы получения флуоресцирующих частиц нанопараметрового размера на основе ковалентного и сорбционного принципов введения разрабатываемых флуорогенов или их комплексов. Оценить люминесцентно-спектральные свойства дисперсий наночастиц, выбрать наиболее перспективные из них для последующего мечения белковых молекул. Определить возможности конъюгации разрабатываемых наночастиц с белками и их применимость для целей иммунофлуоресцентного анализа биологических загрязнителей.

Научная новизна результатов исследований.

1. В результате систематического изучения реакций конденсации, приводящих к получению фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений, оптимизированы методики получения ранее известных соединений, а также получены новые представители тетракетонов, дикетоэфиров и тетракетодиэфиров этого ряда.

2. Изучение люминесцентно-спектральных свойств и процессов комплексообразования показало, что большинство из изученных веществ образует стабильные, длительно люминесцирующие комплексы с европием, сравнимые или превышающие по своим характеристикам комплексы применяющегося в практике реагента - 2-нафтоилтрифторацетона (НТА). Полученные реагенты имеют, как правило, длинноволновые максимумы возбуждения - 360-395 нм. При этом комплексы дибензогетероциклических соединений люминесцируют несколько более интенсивно, чем комплексы бензогетероциклических соединений, однако и те и другие перспективны в качестве реагентов в иммунофлуоресцентном анализе с временным разрешением.

3. Предпринятое исследование влияния фосфорсодержащих синергистов на люминесценцию изучаемых комплексов и ее устойчивость во времени показало, что все изученные синергисты менее эффективны в сравнении с триоктилфосфиноксидом (ТОФО). Более объемный синергист трифенилфосфиноксид (ТФФО) менее эффективен, однако препятствует медленно развивающимся процессам стейкинг-взаимодействия плоских бензогетероциклических лигандов, в результате чего люминесценция комплексов в его присутствии падает медленно.

4. Разработка методов получения наночастиц ковалентным введением флуорогенов в матрицы и сорбционными способами привела к получению активно флуоресцирующих дисперсий частиц нанопараметрового размера, содержащих флуорогены ряда фторсодержащих -дикарбонильных бензогетероциклических соединений. При изучении методов допирования по сорбционному механизму удалось получить более перспективные нанодисперсии на основе поливинилкарбазола и полистирол-дивинилбензола.

5. При апробации разработанных конъюгатов показана возможность проведения иммуноанализа в системе кроличья сыворотка – антиIgG кролика, меченного наночастицами, при этом надежно регистрируется люминесцентный сигнал при определении IgG в концентрации 2х10^-13 г/мкл.

Практическое значение результатов исследований.

Разработаны препаративные методы получения ряда фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений, которые могут находить применения в различных вариантах иммунофлуоресцентного анализа.

Маркированием белковых молекул стрептавидина и иммуноглобулина получены новые реагенты для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий, содержащие фторированные -дикарбонильные бензогетероциклические соединения.

Результаты иммуноанализа холерного токсина, проведенного с захватывающими антителами, находящимися на поверхности микрочастиц, нагруженных комплексом копропорфирина с Pt (II) (Pt-КП), и проявлением иммунокомплекса с биотинилированными антителами стрептавидином, меченым комплексом Eu, показывают применимость разработанных меток для обнаружения биозагрязнений в экологическом анализе.

Основные положения, выносимые на защиту:

На защиту выносится совокупность сведений по методам получения фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений.

Результаты изучения люминесцентно-спектральных свойств комплексов фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений, а также допированных ими наночастиц.

Методы получения и оценка свойств флуоресцирующих нанодисперсий.

Оценка разработанных реагентов в иммунофлуоресцентном анализе биологических загрязнений.

Достоверность результатов исследований и обоснованность выводов основываются на экспериментальных данных, полученных с применением комплекса современных физико-химических методов анализа, с использованием стандартных и аттестованных методик. Корректность результатов подтверждается их сходимостью при повторных экспериментах, обработанных методами математической статистики.

Личный вклад. Автором, с учетом рекомендаций руководителя, сформулированы цель и задачи исследования, выбраны методические подходы к их решению; в течение 2007-2011 гг. получены и интерпретированы экспериментальные результаты.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научных конференциях "Актуальные проблемы биоэкологии" (МГОУ, 2008; МГОУ, 2010), Международной конференции “Органическая химия для медицины” (Черноголовка, 2008), VIII Всероссийской конференции “Химия фтора” (Черноголовка, 2009), Международном симпозиуме “Экология арктических и приарктических территорий” (Архангельск, 2010), 2-ой научной региональной конференции с международным участием ”Химия 2011. Физическая химия. Теория, эксперимент, практика” (Коломна, 2011), VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды “Экоаналитика 2011” (Архангельск, 2011), XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2011), научной конференции преподавателей, аспирантов и молодых ученых Московской области, посвященной 300-летию М.В. Ломоносова и 80-летию МГОУ (Москва, 2011), а также на заседаниях и научных семинарах кафедры общей и аналитической химии МГОУ.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (204 источника, из них 118 иностранных). Работа включает 177 страниц машинописного текста, 27 рисунков, 27 таблиц, 59 схем.