Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Гуминовые вещества. Строение и функции 8
1.2. Возможные механизмы действия гуминовых веществ на живые организмы 16
1.3. Промышленные гуминовые препараты. Получение и опыт применения 24
1.4. Вопросы стандартизации гуминовых препаратов 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы 48
2.1. Гуминовые препараты и гуминовые кислоты, выделенные из них 48
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методы исследования основных физико-химических свойств гуминовых препаратов 50
2.2.2. Методы выделения и исследования гуминовых кислот из препаратов и почвы 53
2.3. Спектральные исследования 55
2.3.1. Спектральные исследования гуминовых препаратов 55
2.3.2. Спектральные исследования гуминовых кислот из препаратов и почвы 56
2.4. Биологическая активность гуминовых препаратов 56
2.4.1. Оценка биологической активности препаратов при непосредственном взаимодействии с живыми организмами 57
2.4.2. Оценка биологической активности препаратов в модельных экспериментах
2.4.2.1 Влияние препаратов при их внесении в почву на бактерии на примере биосенсора «Эколюм» 59
2.4.2.2 Влияние препаратов при их внесении в почву на клетки микроводорослей Scenedesmus quadricauda 59
2.5. Оценка детоксицирующей способности гуминовых препаратов в модельных экспериментах 60
2.5.1. Оценка детоксицирующей способности гуминовых препаратов по отношению к фосфогипсу в эксперименте с модельным почвогрунтом 60
2.5.2. Оценка детоксицирующей способности гуминовых препаратов по отношению к ионам меди в эксперименте с модельным почвогрунтом 63
ГЛАВА 3. Химические свойства гуминовых препаратов 68
3.1. Физико-химические свойства гуминовых препаратов и их элементный состав 68
3.2. Качественный и количественный состав гуминовых веществ гуминовых препаратов 75
3.3. Молекулярно-массовое распределение гуминовых препаратов 77
ГЛАВА 4. Спектральные свойства 81
4.1. Спектры поглощения водных растворов гуминовых препаратов 81
4.2. Спектры флуоресценции водных растворов гуминовых препаратов 82
4.3. Квантовый выход флуоресценции 87
4.4. «Синий сдвиг» спектров испускания при увеличении длины волны возбуждения 89
ГЛАВА 5. Свойства гуминовых кислот препаратов и чернозема обыкновенного 91
5.1. Химические свойства 91
5.2. Спектральные свойства
5.2.1. ИК-спектры гуминовых кислот 94
5.2.2. Спектры поглощения водных растворов гуминовых кислот 96
5.2.3. Спектры флуоресценции водных растворов гуминовых кислот 98
ГЛАВА 6. Биологическая активность гуминовых препаратов 100
6.1. Непосредственное влияние гуминовых препаратов на живые организмы в различных тест-системах 100
6.1.1. Фитотестирование 101
6.1.2. Бактериальное тестирование 103
6.1.3. Альготестирование 104
6.2. Биологическая активность гуминовых препаратов при их внесении в почву 105
6.2.1. Влияние на бактерии на примере биосенсора «Эколюм» 105
6.2.2. Влияние препаратов на клетки микроводорослей Scenedesmus quadricauda 107
ГЛАВА 7. Детоксицирующая способность гуминовых препаратов 109
7.1. Оценка детоксицирующей способности гуминовых препаратов по отношению к фосфогипсу в модельном эксперименте 109
7.1.1. Биотестирование 111
7.1.2. Влияние на химические показатели 113
7.2. Оценка детоксицирующей способности гуминовых препаратов по отношению к ионам меди в модельном эксперименте 116
7.2.1. Содержание меди в водной и в ацетатно-аммонийной вытяжках 116
7.2.2. Функциональное биоразнообразие почвенного микробного сообщества 118
7.2.3. Биотестирование 121
Выводы 126
Список литературы 128
- Возможные механизмы действия гуминовых веществ на живые организмы
- Оценка биологической активности препаратов при непосредственном взаимодействии с живыми организмами
- Качественный и количественный состав гуминовых веществ гуминовых препаратов
- Квантовый выход флуоресценции
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время выявлены и сформулированы биосферные функции гуминовых веществ (ГВ); показаны перспективы их использования в качестве стимуляторов роста растений, почвенных кондиционеров или агентов ремедиации загрязненных природных сред. В связи с этим освоено производство широкого спектра промышленных гуминовых препаратов (ГП) из различных источников органического сырья - углей, торфов, сапропелей, органических отходов. В условиях обилия и разнообразия ГП, предлагаемых для применения в сельском хозяйстве и охране окружающей среды, особую актуальность приобретает всестороннее изучение их свойств с целью дальнейшей разработки принципов управления функционированием агроэкосистем при использовании ГП, а также оценка их эффективности и безопасности на экосистемном уровне.
Значительную роль играет специфика гуминовых ресурсов: состав ГВ различен в зависимости от состава гумифицируемого материала и условий гумификации. В ряду каустобиолитов торф и сапропель являются самыми молодыми ископаемыми, сохранившими фрагменты растительных тканей. Бурые угли прошли более глубокие стадии гумификации и углефикации, приведшие к относительному накоплению конденсированных ароматических структур и потере протеинов, углеводов и алифатических фрагментов. В отличие от ГВ этих природных сред, состав и свойства которых изучены довольно хорошо (Драгунов, 1962, Лиштван и др., 1990, Swift, Spark, 2001), свойства промышленных ГП, полученных из этих источников органического сырья, исследованы недостаточно. В то же время, указанные особенности состава ГВ различного генезиса, вероятно, будут определять особенности их взаимодействия как с организмами, так и с экотоксикантами, находя отражение в проявляемой ими биологической активности. В конечном итоге свойства ГП, во многом определяемые генезисом органического сырья, обусловливают оптимальный выбор препарата согласно цели его использования: стимулирование роста организмов или детоксикация, а также позволяют управлять функционированием агроэкосистемы. Данная работа представляет собой первичный скриннинг химических свойств, биологической активности и детоксицирующей способности широкого набора ГП с целью разработки обоснованных экологических норм воздействия хозяйственной деятельности человека на живую природу.
Цель: выявить взаимосвязь между химическими свойствами ряда промышленных ГП и источником происхождения органического вещества (ОВ), оценить
их биологическую активность и установить особенности проявления детоксициру-ющего эффекта.
В задачи работы входило: 1) исследовать общие химические и физико-химические свойства ряда ГП, полученных из различного органического сырья (торф, сапропель, угли, вермикомпост, лигносульфонат); 2) исследовать свойства гуминовых кислот (ГК), входящих в состав ГП; 3) изучить биологическую активность ГП в различных тест-системах; 4) оценить возможность использования препаратов различного генезиса в качестве детоксикантов фосфогипса и ионов меди.
Научная новизна. Впервые детально изучены химические и спектральные свойства широкого набора ГП, полученных из различных источников и сделан их сравнительный анализ. Выявлены особенности проявления ими биологической активности по отношению к ряду тест-культур, а также детоксицирующего эффекта по отношению к двум видам токсикантов в зависимости от генезиса и химических свойств ГП.
Практическая значимость. Определен набор химических и спектральных характеристик, а также специфика тест-откликов ряда стандартных тест-культур, которые могут быть рекомендованы для включения в систему сертификации ГП. Результаты работы могут быть полезны потребителям гуминовых продуктов для оптимизации целевого использования ГП. Отдельные положения могут быть включены в образовательные программы для студентов экологических специальностей ВУЗов.
Апробация. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на «» (СПб, 2010), на (Минск, 2011), на молодежных конференциях Докучаевские чтения, Ломоносов 2012, на VI съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Петрозаводск, 2012), а также на заседаниях кафедры химии почв факультета почвоведения МГУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав и выводов. Она изложена на 148 страницах печатного текста, включает 33 рисунка,
Возможные механизмы действия гуминовых веществ на живые организмы
Влияние ГВ на физиологическую активность растений многообразно. В частности установлено, что под действием ГВ у растений активизируется корнеобразование, за счет изменения селективности клеточных мембран усиливается поступление воды и элементов питания, что гумусовые соединения положительно влияют на все фазы митотического цикла клеток и вызывают увеличение значения митотического индекса в 1,5 раза (Чуков и др., 1995; Чуков, 2001; Чуков, Голубков, 2005; Chen et al, 1990; Ayuso et al, 1996; Magdi et al, 2011; Clapp et al, 2001; Nardi et al, 2002; Rose, 2014). В работах А.И. Карпухина (Карпухин, 1993) отмечено положительное влияние естественных комплексонов на рост и развитие растений. Было установлено положительное влияние комплексов фульвокислот с железом и марганцем на прорастание семян кукурузы. Радиовегетационные опыты с 45Са показали, что внесение ФК в питательный раствор в дозе 40мг/л оказывает более эффективное воздействие на рост и развитие подсолнечника по сравнению с минеральными формами кальция. В радиовегетационных опытах с 59Fe показано, что в комплексах с ФК доступность железа для растений выше, чем в ионной форме. Обнаружены достоверные различия в поглощении пшеницей железофу-льватных комплексов в зависимости от их молекулярной массы и зарядов. Установлено влияние железофульватных комплексов на фотосинтетическую активность растений (Карпухин, 1993).
Большое количество работ посвящено вопросам взаимодействия гуми-новых веществ с металлами, изменению биодоступности элементов (Halim et al, 2003; Kholodov et al, 2004; Soler-Rovira et al, 2010). Исследования молекулярных механизмов действия ГВ, в которых были использованы цитофото-метрические и радиоавтографические методы показали, что они положитель-16 но влияют на процессы синтеза ДНК, РНК и белка в нормальных условиях, а при угнетении их радиационным и химическими факторами способствуют реактивации указанных жизненно важных процессов (Горовая, 1993).
Влияние ГВ, выделенных водной и щелочной вытяжкой из торфа, исследовалось и в работе Н.А. Куликовой с соавт. (Куликова и др., 1997). Было показано, что водная вытяжка ОВ из торфа оказывает стимулирующее действие на фотосинтез растений в области низких концентраций ( 0,3г/л), а в области больших ( 0.3г/л) отмечено угнетение процесса фотосинтеза. Установлено, что во всем диапазоне исследованных концентраций щелочная вытяжка ОВ оказывала ингибирующий эффект на фотосинтез.
В работе И.В. Греховой и И.Д. Комиссарова (Грехова, Комиссаров, 2007) установлено, что ГП «Росток» обладает по отношению к растениям ауксиновой (превышение длины колеоптиля по сравнению с контролем при концентрации 0,001% на 44%) и гибберелиновой активностью (прирост ги-покотиля салата на 225% по сравнению с контролем). В той же работе была проведена проверка влияния ГП на корневую систему огурца. Выявлено, что при концентрации препарата 0,001%, длина основного корня превысила контроль на 13%, количество придаточных корней - на 150%, длина придаточных корней - на 100%. Так же было установлено, что применение ГП увеличивает доступность таких важных элементов питания, как азот (превысил контроль в 2 раза), фосфор (в 1,8 раза) и калий (в 1,6 раза). ГП положительно влияют на структуру урожая: лучше формировался колос, количество колосков и число зерен в колосе, увеличивалась масса 1000 зерен. Повышалось содержание клейковины в пшенице на 12-23%. Существуют данные о повышении скорости прохождения фенологических стадий при применении гумино-вого препарата «Росток». Установлено (Зубкова и др., 2007), что применение ГП вызывает увеличение энергии прорастания семян. В работе А.А. Комарова с соавт. (Komarov et al., 2008) показано, что применение ГП приводит не только к увеличению роста растений в условиях закрытого грунта, но и к снижению содержания нитратов. Все вышеперечисленные примеры еще раз подчеркивают важность изучения механизмов воздействия гуминовых веществ на растения. Так, по мнению А.И. Попова (Попов, 2004), способность ГВ проявлять физиологическую активность возможна благодаря: 1. наличию в составе разнообразных функциональных групп; 2. коллоидным свойствам; 3. компонентному составу. Все это позволяет ГВ участвовать в реакциях окисления-восстановления, поставлять разнообразные биофильные элементы в растения, в том числе и в составе хелатных комплексов, принимать участие в фермент-субстратных взаимодействиях (Sebestova, E., 1997; Evangelou M., 2004; Kaschl, Chen, 2005; Burlakovs et al, 2013). Наличие поверхностно-активных и электроповерхностых свойств ГВ позволяют участвовать в гидрофобно-гидрофильных взаимодействиях на границе раздела фаз.
В тоже время, существует мнение (Демин и др., 2006,ч.1), что данные свойства сказываются достаточно негативно на функционировании клетки, т.к. нарушают обменные процессы. В связи с этим авторами высказывается гипотеза о коэволюции живых организмов с полимерами нерегулярного строения, при этом для нивелирования негативных (с точки зрения живой клетки) качеств молекул ГВ организмами были выработаны следующие приспособления: 1. химическое строение и пространственная ориентация клеточных стенок позволяет эффективно связывать полимеры нерегулярного строения; 2. клеточные мембраны не пропускают высокомолекулярные полимеры нерегулярного соединения и достаточно устойчивы к природным полимерам-детергентам; 3. гетеротрофное питание осуществляется в результате эндоцитоза. Нерегулярные полимеры могут захватываться либо отдельно - в результате неспецифического эндоцитоза, либо совместно - с биополимерами регулярного строения (белками, нуклеиновыми кислотами и др.).
Оценка биологической активности препаратов при непосредственном взаимодействии с живыми организмами
Механизм, обуславливающий способность гуматов снижать токсическое действие нефти и нефтепродуктов подробно исследовался в работе А.В. Дагурова с соавт. (Дагуров, Стом и др., 2005). В работе использовались «Гу-мат-80» (ООО «Гумат», Россия) и «Powhumus» (гумат калия из ленардита). Нефтепродукты: дизельное топливо, топочный мазут М-40, алифатические углеводороды: октан, изооктан, нонан, декан, ундекан, додекан, гексадекан. В качестве детергента использовался «Tween-20». Оценку токсичности гума-тов и нефтепродуктов проводили на лабораторной культуре ветвистоухих рачков Daphnia magna. В своей работе авторы связывают антидотную активность гуматов по отношению к углеводородам с их поверхностно-активными свойствами. Отмечен сходный эффект гуматов и детергентов - в частности отмечается способность обеих групп веществ предотвращать всплытие рачков на границу раздела вода-воздух; способность вызывать обратный переход дафний в толщу эмульсии; взаимоусиление их эффективности при их совместном использовании и др.
Еще одним аспектом применения ГП для рекультивации нефтезагряз-ненных почв является способность ГК оказывать стимулирующее действие на почвенную биоту, включая деструкторов нефти (Ivanov et. al., 2008). Так, в Институте химии нефти СО РАН проводилось исследование стимулирующее воздействия ГП, выделенных из торфа на почвенную биоту, в условиях нефтяного загрязнения. В качестве вариантов рассматривались ГП, экстрагируемый щелочью из торфа, вариант с предварительной механоактивацией торфа, ГП из бурого угля (Aldrich). В качестве тестируемой микрофлоры рассматривались группы гетеротрофов и актиномицет. Также параллельно проводили анализ нефтяных фракций до и после воздействия ГП. Исследования показали, что ГП активизируют всю почвенную биоту, включая нефтеде-структоров, причем максимальный результат был показан для ГП, выделенного из механоактивированного торфа. По содержанию нефтепродуктов можно отметить, что наибольший вклад можно отнести за счет битум-подобных компонентов. Таким образом, применение ГП носит многостронний характер. Положительный эффект которых можно связать как с их молекулярной структурой, обусловленной химическими (функциональные группы) и физическими (гидрофобно-гидрофильные взаимодействия) параметрами, так и со стимуляцией почвенной биоты.
Проводилось исследование стимулирующего действия гуминового препарата из леонардита «Powhumus» на нефтеразрушающий штамм Pseu-domonas aeriginosa и дрожжи Saccharomices cereviciae (Вятчина и др., 2007). В результате проведенных исследований было выявлено стимулирующее влияние ГП «Powhumus» на рост нефтеразрушающего штамма Р. Aeriginosa в жидкой среде с гексаном. Наиболее оптимальное для развития стало 0,01%-ное содержание препарата в среде. Данное обстоятельство по мнению авторов связано со способностью ГВ диспергировать и солюбилизировать олео-фильные соединения, повышая их биодоступность. Предварительная обработка пекарских дрожжей гуматом приводила к увеличению их подъемной силы. Положительный эффект препарата, проявившийся и в системе «дрожжи-нефть», авторы связывают со способностью непосредственно ГВ нейтрализовать токсиканты, а также с прямой стимуляцией на клетки дрожжей.
Возможность применения механоактивации источника для более полного выделения ГК также требует более детального рассмотрения. В частности в работе А.Г. Пройдакова с соавторами (Пройдаков и др., 2005) была рассмотрена возможность повышения выхода ГК из углей при разных модификациях механоактивации и изучена физиологическая активность полученных препаратов ГК. Наибольший выход ГК достигался при сочетании окисления кислородом и механического воздействия на уголь, одновременно происходило улучшение качества получаемого продукта (обогащение кислородсодержащими функциональными группами). Параллельно проводилось сравнение физиологической активности полученных препаратов. Тестирование ставилось на пшенице, ячмене и горохе. Применение ГП как из исходных, так и из механообработанных углей, оказывало ростостимулирующий эффект на зерновые культуры, при этом, если эффективность первых не превышала 15%, то ГК из углей, подвергнутых механоактивации, увеличивали урожайность до 35%. Особо стоит отметить, что урожайность бобовых при внесении ГП из исходных углей увеличивается на 51-20%, в то время как использование ГП из механоактивированных углей приводит к заметному ингибирую-щему эффекту.
Интересным направлением является применение гуминовых веществ для мелиорации солончаковых почв (Александров и др., 1993). Натурную проверку возможности эффективного использования буроугольных мелиорантов солончаковых почв проводили на светло-каштановых почвах в условиях резко континентального климата Читинской области и Монголии. Одним из главных требований, предъявляемых к мелиоранту, является максимальная обменная емкость, увеличивать которую возможно за счет окисления. Для увеличения автоокисления и самовозгорания бурых углей к мелиоранту требуется вносить определенные добавки. Добавки к углям должны быть: а) нетоксичными и, желательно, являющимися минеральной подкормкой для растений; б) способными участвовать в ионном обмене; в) недорогим и технологически доступным. По мнению авторов, этим требованиям соответствует фосфорная кислота и ее соли. Так, в ходе опытно-промышленного испытания мелиоранта было показано, что эффективная доза внесения составляет 2-8 т/га, при этом снижается количество легкорастворимых солей и активность ионов натрия; рН почвы смещается в сторону нейтральной. Урожайность пшеницы составила с контрольного поля 7,7 ц/га, а с экспериментального - 17 ц/га.
Качественный и количественный состав гуминовых веществ гуминовых препаратов
К базовым свойствам ГП можно отнести рН, содержание сухого вещества, влажность, зольность и содержание основных макроэлементов. Результаты представлены в таблице 8.
Рабочие растворы всех препаратов характеризуются щелочной реакцией среды. Самое низкое значение (7,75) отмечено в препарате из торфа – Pe-FlexK, высокое (10, 1) – в препарате из лигнита Li-Ion.
Зольность препаратов находится в диапазоне 14 – 60 %. Наиболее низкозольными являются препараты из бурого угля – BC-Hum09Na и BC-En2010. Высокое содержание золы отмечено в препарате из сапропеля – Sa-BigK (51,5%) и вермикомпоста - OW-GulK (59,6%). Важно отметить, что для препаратов, представленных жидкой препаративной формой, характерны более высокие значения содержания золы (24 - 60%), чем для порошковой (сухой) препаративной формы (14 - 37%). Зольность указывает на содержание минеральных примесей в составе препарата. Многие фирмы-производители искусственно обогащают свою продукцию, с другой стороны большое количество примесей может указывать на недостаточную очистку препаратов при их производстве. Таблица 8. Физико-химические свойства гуминовых препаратов.
Для экстракции ГВ при производстве ГП часто применяют гидроксиды натрия или калия в твердом или жидком виде. Поэтому исследованные препараты представлены солями натрия или калия. Преобладание того или иного катиона зависит от экстрагирующего агента на производстве. В некоторых препаратах можно отметить высокое содержание кальция: препараты из сапропеля - Sa-Plod и леонардита - Le-HPA.
Одним из важнейших макроэлементов, определяющих структуру молекулы, является углерод. Он входит в состав ароматического «ядра» молекул ГВ и в состав алифатической части. Количество углерода свидетельствует о механизме трансформации органического вещества. При высокой длительности этого процесса происходит постепенное разложение легкогидролизуе-мых фрагментов и накопление конденсированных, высокоуглеродистых частей. Широко известно, что в процессе диагенеза органического вещества опад – торф – бурый уголь происходит накопление углерода, таким образом, содержание общего углерода является важнейшим диагностической характеристикой, связывающей ГП с источником сырья.
Содержание общего углерода в большинстве гуминовых препаратов не выходит за пределы значений. характеризующих ГК почв. Диапазон значений составляет 30 – 47%. Отдельно можно отметить низкое содержание углерода в препарате из вермикомпоста. Как было показано выше, препарат характеризуется высоким содержанием минеральных примесей, что частично объясняет низкое содержание органических веществ.
Другим важнейшим элементом, характеризующим структуру ГВ, является азот. Азот входит в состав и гетероциклических соединений, определяющих трудноразлагаемое ароматическое «ядро» молекул, и в легкогидроли-зуемые остатки протеинов и аминосахаров, входящих в состав легкогидроли-зуемой алифатической части молекул. Содержание азота, а если более строго, то отношение азота и углерода, может непосредственно свидетельствовать о процессах трансформации органического вещества.
В большинстве препаратов содержание общего азота находится ниже 2%. Но присутствуют препараты, выбивающиеся по своим свойствам из общего ряда. К таким можно отнести препарат из торфа Pe-IXPNa, в котором содержание азота достигает 5,25% и препарат Li-FA - 4,95%. Оба препарата представляют источники из так называемых «молодых каустобиолитов».
К технологическим особенностям производства препаратов следует отнести большое количество азота в ГП марки «Энерген». Оно находится на уровне 1,04 – 1,70% в разных формах выпуска. Этот фактор сильно выносит
эти препараты за уровень значений, характеризующих группу бурых углей в целом. Для нее диагностируются более низкие значения содержания азота, на уровне 0,4 - 0,5%.
Сера находится в препаратах в микроколичествах. Исключение составляют препараты из лигносульфоната. Это обстоятельство согласуется с технологией производства препарата из отходов целлюлозно-бумажной промышленности путем обработки отходов серной кислотой. А также препарат Li-BorgK, что связано, вероятно, со спецификой данного месторождения лигнита.
Несмотря на разницу в технологии производства, ГП сохраняют ряд черт, присущих источникам ОВ. Все источники можно разделить на три большие группы: «молодые каустобиолиты» (торф и сапропель), «зрелые ка-устобиолиты» (угли) и органические отходы промышленности. К первой группе относятся препараты из торфа и сапропеля, второй – ГП из углей, к третьей, самой разнообразной по свойствам, – ГП из лигносульфоната и вер-микомпоста. Для «молодых каустобиолтитов» характерен относительно небольшой период трансформации ОВ. Для «зрелых каустобиолитов» - высокое время трансформации. Группа из отходов промышленности - самая молодая по времени трансформации, в их структуре еще сохраняются полисахариды, а остальные свойства широко варьируют и зависят от природы исходного вещества (Якименко, 2010). Время и условия трансформации ОВ накладывают определенный отпечаток на строение ОВ ГП, а следовательно, и определяет их функции. Таким образом, имея представление об источнике ГП, можно было бы сделать определенные выводы и о качествах самого препарата, а источник мог бы служить идентификатором основных свойств препарата.
Квантовый выход флуоресценции
Как видно из рисунков 12-14, для большинства образцов ГП максимум флуоресценции (max) расположен в районе 500 нм (табл. 14).
Для растворов ГП из сапропеля, торфа, некоторых препаратов из гумолита максимум флуоресценции приходится на более коротковолновую область 430-480 нм, а максимум флуоресценции ГП из лигносульфоната расположен в УФ диапазоне (360 нм). Помимо основного пика флуоресценции в видимой области для большинства ГП характерны три небольших пика на 327, 355 и 371 нм при возбуждении на 270 нм.
Для ГП растительного происхождения, из торфов и сапропелей, а также для лигносульфоната характерно преобладание веществ КРФ (табл.12) – фульвокислот, а также низкомолекулярных карбоновых и фенолкарбоновых кислот, которые вносят существенный вклад в спектры испускания. Поэтому для таких ГП максимум флуоресценции смещается от длинноволновых значений, характерных для ароматических флуорофоров ГК, к более коротковолновым, характерным для фульвокислот. Определяющее значение, вероятно, имеет не только количество, но и качественный состав КРФ (Trubetskaya et al, 2002; Richard, 2004; Richard et al, 2009; Трубецкой, 2013). Таблица 14. Положение максимума испускания флуоресценции и спектральные характеристики для растворов ГП в воде при возбуждении на трех различных длинах волн (Гостева и др., 2011).
Так, в ГП из торфа Pe-EdaNa, несмотря на относительно низкую долю КРФ в его составе (14% по углероду), описанная закономерность прослеживается для ex= 310 и 355 нм, в то время как в ГП из лигнита Li-BGHa с содержанием КРФ 91% она не выявлена. Этот факт свидетельствует о том, что в отличие от ГП из торфа в составе данного препарата (как в ГК, так и в КРФ) отсутствуют вещества, способные флуоресцировать в коротковолновой области. ГВ природных вод или почв имеют максимум флуоресценции около 450-460 нм при возбуждении на 270 нм (Горшкова и др., 2009). По характеру спектров флуоресценции к ним наиболее близки ГП растительного происхождения, их максимумы флуоресценции приблизительно совпадают. Возможно, это связано со сходным составом органического вещества и довольно высоким содержанием фульвокислот и индивидуальных органических соединений. В отличие от них у гуматов из углефицированных материалов (бурого угля, лигнита, леонардита и некоторых препаратов из гумолита) максимум флуоресценции сдвинут относительно максимума флуоресценции растворимого органического вещества морского и почвенного происхождения в длинноволновую область на 40-50 нм и расположен около 500 нм.
Одной из основных оптических характеристик вещества является квантовый выход флуоресценции, который определяется как отношение числа испущенных фотонов флуоресценции к числу поглощенных фотонов возбуждающего излучения. При отсутствии взаимодействия флуорофоров квантовый выход флуоресценции не зависит от концентрации вещества, поэтому, в отличие от интенсивности флуоресценции или оптической плотности, является индивидуальной характеристикой молекул, а не их концентрации. На практике квантовый выход флуоресценции рассчитывают по интегральной интенсивности флуоресценции, отнесенной к значению оптической плотности на длине волны возбуждения. Для флуорофоров одного типа квантовый выход флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения, поэтому обнаружение в эксперименте нарушения этого правила говорит о гетерогенности состава флуоресцирующих молекул. Квантовый выход флуоресценции промышленных ГП не превышает нескольких процентов и составляет 0,5– 3,2% для возбуждения на длинах волн ex = 270, 310 или 355 нм (рис. 18). Для сравнения: квантовый выход флуоресценции ГВ морской и речной природной воды составляет от 2 до 5%, ГВ почвенного происхождения – от 0,1 до 0,3% (Горшкова и др., 2009, Милюков и др., 2007) при возбуждении на тех же длинах волн УФ диапазона. На рисунке 15 представлены величины квантового выхода флуоресценции для различных образцов ГП для трех разных длин волн возбуждения. Для большинства ГП квантовый выход флуоресценции убывает при возрастании ex в УФ диапазоне. Исключение составляют ГП, источником которых являлись торф и сапропель – квантовый выход для этих ГП практически не изменяется (препарат из сапропеля Sa-Plod и из торфа Pe-EdaNa) или монотонно увеличивается c ростом ex от 270 до 355 нм (препарат из торфа Pe-IXP). Для ГВ природных вод или почв наблюдается зависимость квантового выхода от длины волны возбуждения, противоположная той, что обнаружена для большинства промышленных ГП, а именно: квантовый выход флуоресценции с ростом ex увеличивается, причем иногда весьма значительно (Shubina et al., 2010). Например, для ГВ природной воды из озера Беломорского региона квантовый выход увеличивается в 2 раза при изменении ex от 270 до 355 нм. ГП из сырья растительного происхождения демонстрируют флуоресцентные свойства, близкие к свойствам природных ГВ – зависимость максимума испускания и квантового выхода флуоресценции от длины волны возбуждения.
Для ряда ГВ наблюдается так называемый «синий сдвиг» в спектрах флуоресценции (Горшкова и др., 2009, Милюков и др., 2007, Donard et al., 1989, Shubina et al., 2010). Это означает, что максимум флуоресценции сдвигается в более коротковолновую область спектра при увеличении длины волны возбуждения в определенном интервале. Величина «синего сдвига» для природных ГВ может составлять до 40 нм при изменении ex от 270 до 310 нм (Горшкова и др., 2009, Shubina et al., 2010). При дальнейшем увеличении ex до 355 нм длина волны максимума спектра испускания увеличивается, и ее значение может превысить длину волны максимума спектра флуоресценции при возбуждении длиной волны 270 нм. Такое явление свидетельствует о наличии разнородных компонент в составе вещества, флуоресценция которых по-разному возбуждается на разных длинах волн.