Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика монгольского дзерена 6
1.1 Таксономическое положение и биологические особенности монгольского дзерена 6
1.2 Пространственное распределение и численность монгольского дзерена на территории России, Монголии и Китая в XX веке 9
1.3 Важнейшие факторы, определяющие распределение монгольского дзерена 12
Географические барьеры и климат 12
Антропогенное воздействие 13
Кормовые ресурсы 14
1.4 Изменение ареала монгольского дзерена в четвертичный период 19
Глава 2. Филогеография и молекулярно-генетический подход к решению экологических проблем 30
Глава 3. Материалы и методы 37
Полевые исследования и методы их обработки 37
Исследованный биоматериал и отбор проб 37
Контроль за загрязнением 43
Выделение ДНК из мышц и кожи 43
Выделение ДНК из костного и рогового вещества 44
Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
с ДНК из музейных и современных тканей 45
Очистка ПЦР продуктов 46
Определение первичной последовательности ДНК. 46
Статистическая обработка генетических данных 46
Глава 4. Особенности ДНК анализа при использовании тканей разной степени сохранности 49
Глава 5. Генетическое разнообразие и филогеографическая структура монгольского дзерена 51
Анализ полиморфизма фрагмента D-петли мтДНК 51
Экспериментальная оценка репрезентативности выборки 61
Анализ полиморфизма фрагмента гитохрома ...62
Глава 6. Реконструкция возможных путей формирования ареала монгольского дзерена в четвертичном периоде 65
Глава 7. Положение монгольского дзерена внутри рода Ргосарга. 69
Глава 8. Генетические особенности группировок монгольского дзерена в Забайкалье и возможные пути восстановления вида на территории России 76
Заключение 78
Выводы 79
Литература 80
Приложение 99
- Таксономическое положение и биологические особенности монгольского дзерена
- Филогеография и молекулярно-генетический подход к решению экологических проблем
- Особенности ДНК анализа при использовании тканей разной степени сохранности
Таксономическое положение и биологические особенности монгольского дзерена
Монгольский дзерен относится к роду Ргосарга (Artiodactyla, Bovidae). Это среднего размера антилопа с короткой и широкой головой. Дзерены по внешнему виду и морфологии сильно напоминают газелей. Так же как и у джейрана (Gazella subgutturosa), у дзерена самки безроги. Редукция кожных желёз, характерная для Gazella,, у Ргосарга выражена в меньшей степени. Для самцов монгольского дзерена характерна сильно развитая гортань, выступающая снизу в виде зоба (Гептнер и др., 1961). Несмотря на описанную географическую форму altaica из долины реки Баян-Цаган, сравнение большого количества черепов и шкур из различных районов Монголии говорит об отсутствии заметных географических форм у монгольского дзерена (Банников, 1954). По палеонтологическим и генетическим данным род Ргосарга также близок к роду Gazella (Chen, 1997; Кузнецова и др., 2002; Lei et al., 2004), причем по генетическим данным самым близким видом к роду Ргосарга является джейран (Lei et al, 2003а).
В роде Ргосарга выделяют три вида. Их ареалы показаны на рис. 1. Тибетский дзерен (P. picticaudata) встречается на Тибетском плато от северной части Гималаев до Нань-Шаня и в провинции Ганьсу (Schaller et al, 1988). Предпочитает горные луга и степи. В Юго-Восточном Тибете распространён на высоте 4000-4500 м. (Feng et al., 1981). Численность этого вида трудно оценить с достаточной степенью точности, однако она может достигать 100 тыс. особей (Schaller, 1998). По другим оценкам численность составляет от 20 до 186 тыс. особей (Yin and Liu, 1993). В Северо-Западном Цинхае его ареал совпадал с местами обитания Procapra przewalskii (рис.1),
Так как тибетский дзерен обитает в горах, а дзерен Пржевальского встречается в долинах и на плато Кукунор фактического перекрывания ареалов не происходит (Строганов, 1949; Allen, 1940; Schaller, 1998). Дзерен Пржевальского (P. przewalskii), эндемик северо-западного Китая, встречался в западной части плато Ордос во Внутренней Монголии, в западном Ганьсу и плато Кукунор вблизи озера Цинхай (Allen, 1940; Jiang et al., 1996). На данный момент этот вид обитает, вероятно, лишь около озера Цинхай (Jiang et al., 2000), где сохранились три небольшие полностью изолированные группы животных. В 1986 г. их численность оценивалась в 350 особей. В 1997 г. группа, обитающая на западном берегу, состояла из семи особей, а две группы, населяющие территорию восточнее озера, из пятидесяти одной и пятидесяти шести особей (Jiang, Sung, 2001). Дзерен Пржевальского первоначально был описан как подвид тибетского дзерена (Allen, 1940), однако в дальнейшем был выделен в отдельный вид (Groves, 1967; 1985).
Монгольский дзерен (Procapra gutturosa) - единственный представитель рода Procapra обитающий на территории России, Монголии и Китая (рис. 2. приложения). Из биологических особенностей этого типичного степного вида можно отметить следующие: отсутствие привязанности к водопоям, как в зимний, так и в летний период (Банников, 1954); высокую выживаемость детёнышей и ряд других. По данным К. Олсона (Olson et al., 2005а) в годы с отсутствием экстремально холодных зим и инфекций, которые на данный момент являются одними из важнейших факторов, влияющих на численность, выживаемость детёнышей составляет 0,71, а взрослых животных 0,95. При таких условиях за год численность популяции может увеличиваться в 1,21 раза и удваиваться меньше чем за 4 года. Благодаря адаптациям к быстрому бегу дзерен может развивать скорость до 75 км/ч и легко избегать хищников. Данные биологические особенности позволяют совершать протяжённые миграции, в ходе которых формируется определённая пространственно-временная структура видового населения.
Филогеография и молекулярно-генетический подход к решению экологических проблем
Термин "филогеография" (направление в исторической биогеографии, изучающее принципы и процессы, управляющие географическим распределением генеалогических линий) был предложен относительно недавно (Avise et al., 1987). В ходе фил о географических исследований выявляется пространственное распределение генеалогических линий внутри одного или нескольких близких видов. Таким образом, филогеография является частью биогеографии и использует данные множества биологических дисциплин таких как: экология, популяционная генетика, историческая география, палеонтология, демография, молекулярная генетика и других (Avise, 2000). Своему появлению эта область знаний обязана прежде всего бурному развитию молекулярно-генетических методов исследований популяциоиного полиморфизма в последние десятилетия. Открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР) существенно расширило возможности ДНК-анализа (Saiki et al.,1988). Реакция ПЦР происходит следующим образом. Каждая из двух цепей определенного фрагмента ДНК служит матрицей, на которой с помощью термостабильной ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная последовательность. Процесс проводится при определенном температурном режиме в присутствии праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных к концевым последовательностям данного фрагмента, инициирующих этот процесс (Mullis et al., 1986). Реакция многократно повторяется в автоматическом режиме, при этом каждый раз количество ДНК удваивается, и после 30 циклов число исходных молекул ДНК увеличивается более чем в миллион раз (Park et al., 1994). Благодаря этому стало возможным осуществлять амплификацию определенных фрагментов ДНК, выделенной даже из образцов, содержащих следовые концентрации ДНК: из шерсти, кусочков кожи, слюны, костей, экскрементов (Taberlet, Luikart, 1999). Твёрдые ткани животных, такие как кости, рога, зубы представляют собой важный долгохранящийся ресурс ДНК для эволюционных и популяционных исследований. Они помогают восстановить эволюционную историю исчезнувших видов (Shapiro et al., 2002), проанализировать изменения генетического разнообразия в угрожаемых популяциях (Bouzat et al., 1998). Материалы, собранные от разных поколений и из различных популяций, позволяют идентифицировать временную динамику потока генов и изменения генетической структуры (Nielsen et al. 1999; Glenn et al., 1999). Очень важную и интересную информацию может дать анализ ДНК из древних захоронений различных животных для восстановления общей картины распространения и видообразования разных групп организмов (Watanobe et al., 2004). Так как нуклеиновые кислоты со временем очень сильно деградируют в результате воздействия различных излучений, химических веществ и гидролитической активности ферментов живых организмов, то использовать ядерные маркеры для анализа таких образцов практически не возможно (Wandeler et al, 2003; Lindahl, 1993). В исследованиях, связанных с древними тканями, чаще всего используют мтДНК, так как количество её копий в клетке в тысячи раз больше чем ядерной ДНК (Hoss, 2000, Наумова и др., 1997). При этом ДНК в зубах, рогах, костях гораздо лучше сохраняется, чем в других тканях. Благодаря тому, что при сборе тканей в полевых условиях, не наносится никакого ущерба отдельным особям и популяции в целом, данные методы с успехом могут применяться в экологических и этологических исследованиях. Появляется также возможность работы с редкими и исчезающими видами (Taberlet, Luikart, 1999). Существует несколько ДНК маркеров, используемых для изучения внутрипопуляционного полиморфизма. Они могут быть ядерными и цито плазматическими. Одним из наиболее широко используемых цитоплазматических маркеров является митохондриальная ДНК (мтДНК). У позвоночных животных мтДНК имеет вид замкнутой кольцевой молекулы. Она содержит 37 различных генов, в том числе два рибосомальных, гены 22 транспортных ДНК, 13 генов, кодирующих белки, и некодирующую контрольную область, участвующую в репликации (Anderson, 1991). Местоположение и размеры этой области отличаются у разных групп позвоночных животных (Jeffrey L. Вооге, 1999). Для большинства млекопитающих характерно следующее строение контрольного региона мтДНК (рис. 5).
Особенности ДНК анализа при использовании тканей разной степени сохранности
Исходя из наших данных, наиболее подходящими тканями для ДНК анализа являются свежие кусочки мышц, пуповины и кожи, а также рога, собранные в полевых условиях от недавно погибших животных. При этом, если наблюдаются активные процессы гниения, то наиболее эффективно использование роговой ткани. Также довольно высокий процент успешности выделения отмечен для тканей, взятых от животных, погибших зимой и пролежавших в условиях степи около полугода. Это, вероятно, в первую очередь связано с замедлением процессов гниения и, соответственно деградации ДНК, в первые несколько недель после гибели животного. Несмотря на применение специально разработанной методики выделения из костных тканей (Холодова и др., 2005), процент успешных выделений из тканей музейных образцов был низким, что вероятно связано с плохой сохранностью генетического материала. Из-за этого использование образцов от музейных тканей (как костных, так и других) для генетического анализа является крайне затруднительным. Из-за неподходящих условий хранения коллекций, применения агрессивных по отношению к ДНК консервантов (формалин, уксусная кислота, квасцьт) и невозможности изменения внешнего вида коллекционного материала использование таких образцов сильно ограничено. Между тем, использование различных остеологических коллекций для популяционных и другого рода исследований возможно, и более того, это иногда является единственным способом изучения уже исчезнувших популяций или видов (Shapiro et al., 2002). Отметим, что наиболее подходящими участками для взятия ДНК проб у полорогих являются подроговьте костные стержни, а использование роговых чехлов мало эффективно. При этом из-за высокой вероятности загрязнения тканей различными ингибиторами и чужеродной ДНК, по возможности, желательно брать целые фрагменты костных тканей. Затем, уже в лабораторных условиях проводить механическую и химическую очистку и стерилизацию образцов, после чего измельчать их до порошкообразного состояния.