Введение к работе
Актуальность исследования. Живые системы различных уровней все больше испытывают на себе действие человека: применение вакцин, профилактических и лечебных препаратов; пестицидов, минеральных удобрений, регуляторов роста; использование диагностического и лечебного контактного оборудования (Луценко, Васильев, 1986). Эти воздействия в полной мере можно охарактеризовать как стрессорные факторы. Опасность антропогенных стрессоров состоит, прежде всего, в том, что биологические системы — будь то организмы, популяции или биоценозы - недостаточно адаптированы к ним. Антропогенные стрессоры создаются с такой скоростью, что эти системы не успевают активизировать соответствующие адаптационные процессы (Lohs, 1982). Многие антропогенные факторы становятся опасными для живого, потому что они отличны по величине, интенсивности, продолжительности и моменту воздействия от той обычно существующей в природе нормы, к которой адаптированы биологические системы.
Не представляется возможным исключить действие человека на живые системы. Имешю поэтому важнейшими задачами экологов, наряду с другими специалистами, являются: выявление стрессорных факторов антропогенного происхождения, оценка современными методами их влияния на живые системы, прогноз последствий воздействия и мероприятия по снижению действия стрессов. Активным антропогенным влиянием на человека и сельскохозяйственных животных является введение живых вакцин против опасных зооантро-понозных инфекций, таких как чума, туляремия, бруцеллез. Поиск новых эффективных средств защиты от инфекций идет в основном по двум направлениям - во-первых, влияние на иммунную систему человека и животных. Во-вторых, модифицирующий эффект на микроорганизмы, с целью получения вакцин или профилактических препаратов, способных вызывать стойкий длительный иммунитет и обладающих низкой реактогенностью.
Одним из современных стрессорных факторов является лазерное излучение. Эффективность и результат применения лазеров с диагностической и лечебной целью продолжает вызывать дискуссии в литературе. В последнее время, как в России, так и за рубежом, низкоинтенсивное лазерное излучение часто используют в медицинской практике при лечении многих заболеваний. Получены данные о воздействии лазера на различные уровни живых систем: молекулярный (Кару, 1986; Панасюк и др., 1987; Тифлова и др., 1987; Генкин и др., 1989; Романова и др., 1993; Зурьянова и др., 1994), клеточный (Королев и др., 1997; Клебанов и др., 1997; Кару и др., 1998; Prodouz at al., 1992; Daniels et al., 1994; Morimoto et al., 1994; Kane et al., 1994; Knappe at al., 1995; Logan et al., 1995) и даже генетический (Callaghan et al., 1996). В экспериментальных и клинических исследовашіях обнаружено улучшение микроциркуляции крови за счет вазодилятации (Козлов и др., 1993, 1998), изменения агрегащюнных и адгезивных свойств клеток крови (Брилль и др., 1999), клеточной пролиферации (Кару, 1991; Grossman et al., 1992), увеличение бактерицидности (Клебанов и др., 1997). Лазерное излучешіе используют при лечении и профилактике боль-
того числа заболеваний. В литературе широко описано активирующее влияние лазерного излучения в дозах до 15 Дж/си~. Когерентный свет эффективен гґри лечении болезней органов дыхания (Егорова и др., 1998; Александрова и др., 1999; Успенский и др., 2000), сердечно-со су диетой системы (Родионов и др., 1991; Кипшидзе и др., 1992; Рыжов и др., 1993; Черток и др., 1993; Пучков и др., J994: Шувалова и др., 1.997), органон кроветворения (Воитенок к др., 1983; Зяблицкнй и др., 1992), эндокринной (Брук и др., 1992; Куликова и др., 1997), нервной (Андреева, 1980; Русаков, І987; Челышев и др., 19У6; Сгупак и др., 1998; Basford at al., 1993) и иммунной систем (Земской и др., 1988, Кулиев и др., 1991; Борисова и др., 1992; Семепков и др., 1993; Кончу го ва и др., 1997). Благотворное воздействие лазерного излучения отмечается не только на отдельные системы, но также и на функционирование всего организма в делом (АвруцкиЙ, 1991). Однако, несмотря на обилие работ, посвященных вопросам лазерное терапии и исследованиям механизмов влиянии лазерного света на живые системы, роль когерентности света в процессах его взаимодействия с тканями к настоящему моменту времени, по сути, абсолютно не изучена. Важнейшее, и практически единственное, отличие лазерного излучения от не ко гере Ніною света состоит в его способности формировать спекл-поля внутри рассе-вающих биотканей и бактериальных взвесей. Под спекл-полями (от англ. speckle, что в переводе означает пятнышко, крапинка) понимают случайное распределение интенсивности и фазы световых воли внутри биологических объектов, которое носит няттшстыИ характер. Типичная реализация спекл-поля представлена на рис. 1.
Рас. 1. Фотография развиты» сасклои
Важно отметить, чем выше уровень рассеяния в среде, тем мельче становятся спеклы виуїри биологического образца (т.е. тем меньше становится степень пространствеппои коїерентностц излучения). Очевидно, что пространственно-временная когерентность света чрезвычайно важна с точки зрения воздействия на жшзые системы Сам биологический объект также воздействует на оптическое поле, изменяя его когерентные свойства. Следовательно, при анализе эффектов лазеров на функцию облучаемых клеток и тканей следует принимать во внимание процессы взаимодействия когерентного напучення е живой системой.
Однако до настоящего времени, по сути, не было опубликовано ни одной работы, посвященной вопросу, в какой мере главные свойства лазерного излучения (а именно его пространственная и временная когерентность) важны с точки зреїшя воздействия на организм человека и животных. Не принимается во внимание и то обстоятельство, что рассеяние света в биотканях является самосогласованным процессом: световое излучение влияет на живую систему, но, в свою очередь, и рассеивающая среда существенным образом изменяет когерентно-оптические свойства света, используемого для облучения. Пространственно-временные характеристики оптических спекл-полей, длина и время когерентности света не принимаются во внимание при рассмотрении первичных молекулярных механизмов действия лазеров на биолопіческие структуры. Не предпринималось также попыток построить математическую модель взаимодействия динамических биоспеклов со взвесями бактериальных клеток (участвующих в броуновском движении), идентифицировать на основе данных планируемого эксперимента параметры этой модели и оптимизировать режимы облучения на основе компьютерного моделирования.
Получение новых данных об антропогенной модификации живых систем лазерными спеклами, биотестирование их состояшм современными методами оптики спеклов являются актуальными задачами. Диссертационная работа посвящена решению комплексной проблемы: разработке фундаментальных основ взаимодействия когерентного оптического излучения с живыми системами и выявлению степени его негативного влияния.
Цель - разработка новых спекл-методов биотестирования и теоретическое обоснование процессов, происходящих при антропогенной световой модификации живых систем.
Задачи:
обосновать экологический подход к изучению проблемы взаимодействия оптических спеклов с живыми системами; возможность их применения при биотестировании для оценки и прогнозирования степени антропогенного влияния на эти системы;
разработать и усовершенствовать методы спекл-диагностики применительно к задачам экологии;
выявить роль пространственной когерентности света в процессе взаимодействия спекл-полей с тканями организма лабораторных животных методами доплеровской диагностики и когерентной микроскопии, спекл-микроскопии, доплеровской спекл-микроскошш и спекл-кросс-коррелометрии;
- выяснить степень влияния временной когерентности динамических
спеклов на микроциркуляцию крови лабораторных животных методами допле
ровской диагностики и спекл-имиджинга;
разработать макет установки для получения препаративного количества инактивированных бактериальных клеток, облучаемых низко-когерентными спекл-полями в присутствии фотосенсибилизатора малой концентрации;
определить возможность инактивации бактериальных культур при взаимодействии с динамическими спеклами с использованием разработанного макета установки;
- разработать биофизическую модель взаимодействия динамических
спеклов с бактериальными взвесями, учитывая антропогенную модификацию
клеток;
провести компьютерное моделирование процессов взаимодействия час-тично-когерентых спеклов с бактериальными взвесями;
методами спекл-микроскопии и спекл-имиджинга изучить токсическое действие бактериальных взвесей, прошедших фотоинактивацию лазерными спеклами;
определить влияние нейромедиатора ацетилхолина на процессы формирования иммунитета к туляремии методом низкоинтенсивной спектрофотомет-рии; оценить токсическое действие вакцины, введенной морской свинке на фоне ацетилхолина, методами спекл-микроскопии и спекл-имиджинга;
разработать высокоэффективные экспресс методы спекл-диагностики биотестирования живых систем: клетка, ткань, орган, организм, находящихся под антропогенным влиянием.
Научная новизна. Впервые научно обосновано, с точки зрения экологии, взаимное влияние оптических спеклов на живые системы и их использование при биотестировании. Разработан метод инактивации спеклами бактериальных взвесей в присутствии фотосенсибилизатора. Использован новый метод - доп-леровская спекл-микроскопия высокого пространственного разрешения - для изучения влияния лазерного излучения на микроциркуляцию крови брыжейки лабораторных животных. Метод когерентной микроскопии впервые применен для измерения размеров и контрастов биоспеклов, формирующихся при оптическом воздействии в тканях животных.
Усовершенствованы методы спекл-микроскопии высокого пространственного разрешения, доплеровской диагностики биотканей высокого пространственного разрешения и спекл-имиджинга, позволяющие in vivo наблюдать за изменениями движения крови в микроциркуляторном русле.
Исследованы условия превращения когерентного излучения в естественный некогерентный свет в коже животных. Показано, что спекл-поля полностью утрачивают пространственную когерентность при распространении в коже на глубину 200-300 мкм.
Впервые проведено компьютерное моделирование процессов взаимодействия динамических спеклов с бактериальными взвесями. Установлена зависимость степени инактивации клеток от длительности, дозы и плотности мощности излучения, концентрации фотосенсибилизатора; а также выявлено соотношение между "временем жизни" биоспеклов во взвеси и характерным эффективным временем взаимодействия молекул синглетного кислорода с бактериальной мембраной.
Математически обоснован новый подход к оценке допустимого порога интенсивности лазерного излучения, попадающего в зрачок глаза человека.
Впервые исследовано in vivo влияние низкоинтенсивного излучения на церебральный кровоток белых крыс методами спекл-имиджинга.
Разработан макет установки, позволяющий одновременно получить препаративное количество (более 30 мл) бактериальных клеток, инактивированных
в присутствии фотосенсибилизатора. Определены условия инактивации бактериальных культур при их взаимодействии с динамическими спеклами с использованием разработанного макета установки. В сравнительном аспекте методами спекл-микроскопии и спекл-имиджинга in vivo на брыжейке белых крыс показано токсическое действие различных бактериальных взвесей, прошедших фотоинактивацию лазерными спеклами.
Методом низкоинтенсивной спектрофотометрии выявлено стимулирующее влияние неиромедиатора ацетилхолина при парентеральном введении на процессы формирования поствакцинального иммунитета к туляремии. Методами спекл-микроскопии и спекл-имиджинга выявлено, что токигаеское действие туляремийной вакцины, введенной на фоне ацетилхолина, является непродолжительным.
Практическая значимость работы. Разработан новый спекл-метод фотоинактивации бактерий, сохраняющий их антигенную структуру. Для этого создан макет установки, позволяющий:
получить препаративное количество инактивированных в присутствии фотосенсибилизатора бактериальных клеток; выполнять бактериологическую работу в стерильных условиях; варьировать параметры облучения;
проводить облучение бактериальных клеток в анаэростате, термостате и других приборах с ограниченным объемом.
Предложена компьютерная модель, позволяющая прогнозировать процессы взаимодействия динамических спеклов с бактериальными взвесями, на основании установленной зависимости степени инактивации клеток от изменения параметров излучения и характерным эффективным временем взаимодействия молекул сииглетного кислорода с бактериальной мембраной.
Модификация метода двумерной кросс-спекл-коррелометрии дает возможность изучать временные изменения скоростей микропотоков крови в капиллярах диаметром менее 10 мкм в брыжейке лабораторных животных при антропогенном влиянии.
Применение метода спекл-имиджинга позволяет in vivo изучать влияние лазерного излучения на церебральный кровоток лабораторных животных.
Разработанные методы спекл-микроскопии высокого пространственного разрешения и спекл-имиджішга применяжі для экспресс диагностики in vivo на лабораторных животных токсического действия бактериальных клеток возбудителей инфекционных заболеваний, прошедших лазерную фото инактивацию.
Разработаны три аспекта рационального использования новых и усовершенствованных методов:
для инактивации бактериальных взвесей с целью получения новых профилактических препаратов;
для определения степени токсичности профилактических препаратов, применяющихся при вакцинации сельскохозяйственных животных и человека;
для установления снижения допустимого порога интенсивности лазерного излучения, попадающего в зрачок глаза человека.
Внедрение результатов работы в практику. Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций студентам специальностей «Агроэкология», «Плодоовощеводство и виноградарство», «Агрономия», «Генетика и селекция растений» ФГОУ ВПО Саратовского ГАУ имени Н.И. Вавилова по дисциплинам «Основы экотоксиколопш» и «Экология человека»; при чтении лекций на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при Рос-НИПЧИ «Микроб».
Метод частично-когерентных оптических спеклов был использован при выполнении хоздоговорной работы на тему: «Оценка масштабов загрязнения нефтью почвы в ИП Крючков» (2005).
Материалы диссертации включены в методические рекомендации «Определение иммунокомпетентных клеток с рецепторами к биологически активным веществам для оценки иммуногенности противочумных вакцинных препаратов», которые были одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 4 от 03.06.97) и утверждены директором института 03.06.97 г.
Основные результаты и положения, выносимые на защиту;
Экологический подход к изучению влияния оптических спеклов на живые системы различных уровней.
Комплекс методик с использованием оптических спеклов при биотестировании живых систем различного уровня.
Закономерности превращения когерентных спеклов в некогерентный (естественный монохроматический) свет при распространении света в тканях кожи животных.
Методологический подход к обоснованию снижения допустимого порога интенсивности лазерного излучения, попадающего в зрачок глаза человека.
Особенности влияния когерентности света на состояние микроциркуляции крови лабораторных животных.
Новый способ девитализации бактерий динамическими спеклами в присутствии фотосенсибилизатора с сохранением антигенных структур клеточных мембран.
Математическая модель взаимодействия динамических спеклов с бактериальными взвесями.
Спекл-методы позволяют in vivo на лабораторных животных определить токсическое действие бактериальных взвесей, прошедших лазерную фотоинактивацию.
Нейромедиатор ацетилхолин оказывает стимулирующее влияние на процессы формирования иммунитета к туляремии.
Апробация работы. Материалы исследований были представлены и обсуждены на конференциях различного уровня: 1-м съезде иммунологов (Новосибирск, 1992); 1st International Conference on Imrnunorehabilitation (Sochi, 1992); 7th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. 7th International Congress of Mycology Division (Czech Republic, 1994); межгосударственной научной конференции "Профилактика и меры борьбы с чумой",
посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Алматы, 1994); научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию АМН (Москва, 1994); 8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division (Israel, 1996); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образовашш противочумной службы России (Саратов, 1997); научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб»; «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000); научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб». «Итоги и перспективы фундаментальных исследований в институте «Микроб», посвященной 100-летию со дня рождения Б.К. Фешока. (Саратов, 2002); 6th International Conference on Correlation Optics (Ukraine, 2004); Complex Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics II (USA, 2005); международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию кафедры экологии «Актуальные проблемы экологии на современном этапе развития сельского хозяйства» (Саратов, 2005); Optical Technologies in Biophysics and Medicine VI (Saratov, 2005); конференции, посвящешюй 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2006); 7th International Conference on Correlation Optics, (Ukraine, 2006); Optical Technologies in Biophysics and Medicine VII, (Saratov, 2006); Complex Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics III (USA, 2006); международной научно-практической конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); NIAID Research Conference (Croatia, 2006), научных конференциях кафедры «Экология» ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» (Саратов, 2004-2007) и др.
Личный вклад автора в работы, выполненные самостоятельно или в составе научных групп в период с 1990 по 2006 гг. и включенные в диссертацию, заключается в теоретическом обосновании проблемы, постановке и решении основных задач исследования, обосновании их практического применения, систематизации, обобщении и интерпретации полученных результатов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовашы 52 научные работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 370 страницах текста, состоит из введения, семи глав, заключения и выводов. Содержит 9 таблиц, 176 рисунков. Список использованной литературы включает 391 источник.