Введение к работе
Актуальность темы. Исследование процессов сворачивания и разворачивания глобулярных белков представляет одну из основных задач современной физической химии растворов белков, важную также и для многих смежных областей, таких как биофизика, молекулярная биология и химия высокомолекулярных соединений. Поскольку большинство биохимических процессов в клетке происходит у клеточных мембран, особое значение приобретает изучение конформационных переходов белковых молекул на границе между двумя флюидными фазами. Интерес к процессу реорганизации глобулярной структуры белков в ходе адсорбции связан также с широким использованием природных высокомолекулярных соединений в качестве стабилизаторов дисперсных систем.
Большинство результатов по конформационным переходам в белковых системах, сворачиванию или разворачиванию молекул белка в растворах, полученных в последние несколько десятилетий, относятся, однако, только к процессам в объёмных фазах. В то же время информация о состоянии белковых молекул в поверхностном слое и об изменении третичной и вторичной в процессе адсорбции оказывается довольно скудной. Степень разрушения глобулярной структуры белка при адсорбции на границе раствор/газ до сих пор остаётся предметом дискуссии. Так, например, потеря активности некоторых энзимов после их адсорбции на водной поверхности, низкая скорость адсорбции белков и образование прочной сети межмолекулярных связей в поверхностном слое рассматривались в течение длительного времени в качестве доказательств разрушения третичной и вторичной структуры при переходе молекул белков из объёмной фазы в поверхностный слой. Некоторые результаты последних лет, полученные с помощью отражения рентгеновских лучей и спектроскопии кругового дихроизма, подтверждают этот вывод. В то же время данные отражения нейтронов и инфракрасной спектроскопии отражения-поглощения свидетельствуют о сохранении глобулярной структуры при адсорбции в тех же системах.
Суходолов Н.Г.
Существующие трудности при исследовании адсорбционных пленок белков вызваны, прежде всего, ограниченным набором экспериментальных методов, доступных для изучения конформационных переходов белков в поверхностном слое. В данной работе для этой цели используется дилатационная поверхностная реология. Недавно было показано, что адсорбция гибких макромолекул
сопровождается возникновением локальных максимумов на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости, вызванных переходом некоторых сегментов из ближней области поверхностного слоя в дальнюю область. В то же время адсорбция компактных наночастиц приводит к монотонным зависимостям поверхностной упругости, достигающей высоких значений. Это позволяет использовать дилатационную поверхностную реологию для оценки состояния третичной структуры белков в поверхностном слое.
Цель данной работы состоит в определении механизма формирования адсорбционной пленки глобулярных белков на поверхности водного раствора и оценки влияния на этот процесс различных денатурирующих агентов на основе данных дилатационной поверхностной реологии на примере растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА) и Р-лактоглобулина (БЛГ).
Для достижения этой цели в диссертации решались следующие основные задачи:
Определение концентрационных и кинетических зависимостей комплексной динамической поверхностной упругости растворов глобулярных белков и их смеси с денатурантами с помощью метода осциллирующего барьера.
Определение зависимости поверхностной концентрации для растворов смеси глобулярного белка и ионогенного поверхностно-активного вещества (ПАВ) от возраста поверхности и концентрации в объеме с помощью эллипсометрии.
Определение динамического поверхностного натяжения растворов смеси глобулярных белков и денатурантов в широкой области концентраций и времен жизни поверхности.
Определение морфологии адсорбционных слоёв глобулярных белков в присутствии денатурантов с помощью атомно-силовой микроскопии.
Создание кинетической модели адсорбции комплексов глобулярных белков и ионогенных ПАВ.
Сравнение результатов расчета кинетики адсорбции с экспериментальными данными и определение эффективного заряда комплекса белок/ПАВ.
Научная новизна. Впервые обнаружены локальные максимумы на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости растворов смесей БСА и БЛГ с различными денатурантами. Полученные результаты показывают, что разрушение третичной структуры этих белков происходит в поверхностном слое при меньших концентрациях денатурантов, чем в объемной фазе, т.е. межфазная граница оказывает дестабилизирующее влияние на белковые
глобулы. Возникновение дальней области поверхностного слоя происходит при некотором характеристическом для данного белка значении поверхностного давления, не зависящим от концентрации и химической природы денатуранта. Показано, что скорость изменения поверхностных свойств растворов глобулярных белков и их комплексов с ПАВ в области нейтральных значений рН определяется электростатическим адсорбционным барьером. Построена кинетическая модель адсорбции заряженных глобул на поверхности жидкости и определен эффективный заряд адсорбирующихся комплексов БСА и додецилсульфата натрия (ДСН).
Практическая ценность. Белки характеризуются значительной поверхностной активностью и образуют на межфазных границах прочные адсорбционные пленки. С этим связано широкое применение белковых систем в качестве стабилизаторов пен и эмульсий в таких областях промышленности, как фармакологическая, пищевая и косметическая. Полученные данные о механизме формирования адсорбционных плёнок глобулярных белков и их комплексов с поверхностно-активными веществами, а также о реологических свойствах этих пленок необходимы для оптимизации технологических процессов, а также для создания новых высокодисперсных материалов.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
-
-
Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси глобулярных белков с гидрохлоридом гуанидина (ГХГ), мочевиной, ДСН, бромидом додецилтриметиламмония (ДТАБ), проявляющиеся при увеличении концентрации денатурирующего агента в растворе.
-
Обнаружение и интерпретация немонотонных кинетических зависимостей динамической поверхностной упругости растворов, содержащих глобулярные белки.
-
Механизм формирования адсорбционных пленок в растворах смеси БСА с ГХГ и мочевиной.
-
Механизм адсорбции комплексов БСА и БЛГ с ДСН и ДТАБ.
-
Кинетическая модель адсорбции комплексов глобулярных белков с ионогенными ПАВ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Научная сессия Секции коллоидной химии и физико-химической механики Научного совета по физической химии РАН (Москва, 2010); V
Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011); 7th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, 2011); 25th European Symposium on Applied Thermodynamics (Санкт-Петербург, 2011); I Всероссийский симпозиум по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011); 25th European Colloid and Interface Science conference (Берлин, 2011); VI Всероссийская конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (Санкт-Петербург, 2012); 26th European Colloid and Interface Science conference (Мальмо/Лунд, 2012); Семнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых учёных и специалистов (Санкт-Петербург, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в международных журналах и 9 тезисов докладов.
Объём и структура работы. Диссертационная работа объёмом 151 страница машинописного текста (148 страниц основного текста и 3 страницы приложения) состоит из введения, шести глав, содержащих 54 рисунка и 1 таблицу, выводов, списка литературы, включающего 202 наименования, и приложения.
Похожие диссертации на Влияние денатурантов на динамические поверхностные свойства растворов глобулярных белков
-
