Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Состояние вопроса 15
1.2. Состав и свойства сорбентов природного происхождения 17
1.3. Кристаллохимические характеристики монтмориллонита 19
1.4. Адсорбционные явления 21
1.5. Активные центры на поверхности монтмориллонит содержащих глин 24
1.6. Природные сорбенты в медицине и ветеринарии 26
1.7. Современные способы получения ранозаживляющих композиционных материалов 28
1.8. Механизм адгезии бактерий 30
Выводы 31
ГЛАВА 2. Метододика определения объективных и коллоидно-химических свойств экспериментальных фитоминералосорбентов
2.1. Объекты исследования 33
2.1.1. Обогащение природной глины 33
2.1.2. Химический состав лекарственного растительного сырья 34
2.2. Модифицирование монтмориллонит содержащих глин экстрактами лекарственных растений 35
2.2.1. Экстрагирование биологически активных веществ лекарственных растений 36
2.3. Рентгенофлуоресцентный и рентгенофазовый анализ 37
2.4. Гранулометрический анализ 39
2.5. Аналитическая электронная микроскопия 40
2.6. Определение текстурных характеристик з
2.7. Определение электрокинетического потенциала нативных и модифицированных монтмориллонит содержащих глин 43
2.8. Определение механизма адгезии бактерий к монтмориллониту 43
2.9. Определение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к экспериментальным сорбентам 44
2.10. Определение способности сорбировать уксусную кислоту нативных и модифицированных монтмориллонит содержащих глин 45
2.11. Определение способность нативных и модифицированных монтмориллонит содержащих глин сорбировать ионы Fe3+ 46
2.12. Определение поглотительной способности экспериментальных сорбентов по отношению к органическим красителям 48
2.13. Методика определения влияния экспериментальных сорбентов на ранозаживление 50
Выводы 50
ГЛАВА 3. Модифицирование экспериментальных сорбентов и определение их коллоидно-химических свойств
3.1. Вещественный состав, структурные и коллоидно-химические характеристики экспериментальных сорбентов 51
3.1.1. Химический состав экспериментальных сорбентов 51
3.1.2. Минералогический состав экспериментальных сорбентов 55
3.1.3. Гранулометрический состав экспериментальных сорбентов 57
3.1.4. Структурно-морфологические характеристики экспериментальных сорбентов 58
3.1.5. Текстурные характеристики экспериментальных сорбентов 61
3.1.6. Электрокинетический потенциал экспериментальных сорбентов 64
3.2. Сорбционные свойства экспериментальных сорбентов 65
3.2.1. Результаты определения адгезии бактерий к монтмориллониту 65 3.2.2. Результаты определения чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к экспериментальным сорбентам 67
3.2.3. Сорбционная активность экспериментальных сорбентов в кислой среде по отношению к уксусной кислоте 72
3.2.4. Сорбция ионов Fe3+ экспериментальными сорбентами 74
3.2.5. Сорбция метиленового голубого и конго-красного экспериментальными сорбентами 77
3.2.6. Оценка эффективности экспериментальных сорбентов при лечении гнойно-воспалительных ран 78
Выводы 80
ГЛАВА 4. Разработка способа получения сорбентов на основе монтмориллонитовой глины и экстрактов лекарственных растений и оценка их эффективности
4.1. Технологическая схема обогащения и модифицирования монтмориллонитовых глин 82
4.2. Оценка экономической эффективности экспериментальных сорбентов 85
4.3. Утилизация отходов отработанных экспериментальных сорбентов 88
Выводы 89
Заключение 90
Список литературы
- Состав и свойства сорбентов природного происхождения
- Химический состав лекарственного растительного сырья
- Химический состав экспериментальных сорбентов
- Оценка экономической эффективности экспериментальных сорбентов
Введение к работе
Актуальность исследования:
Объектами исследований в коллоидной химии являются дисперсные системы и поверхностные явления, возникающие на границе раздела фаз. Важное место в коллоидной химии занимает разработка сорбентов и изучение адсорбционных явлений. В данной работе рассматривается вопрос создания сорбентов на основе монтмориллонит содержащих глин, модифицированных экстрактами лекарственных растений (эхинацея, тмин, ромашка аптечная, календула лекарственная, чабрец), обладающих высокой антибактериальной активностью. Рассмотрены процессы, происходящие на границе раздела фаз и выявлены вещественный (гранулометрический, минералогический и химический) состав, изучены коллоидно-химические, в частности сорбционные свойства разработанных сорбционно-активных материалов. Выбор сырьевых материалов и способа получения конечных продуктов основан на следующих принципах: большая сорбционная емкость монтмориллонита, высокая антибактериальная активность лекарственных растений, низкая стоимость и большая возобновляемая сырьевая база.
Большинство представленных на рынке сорбентов с высокими сорбционными характеристиками, используемых для ускорения процессов ранозаживления и лечения гнойных ран, имеют неприемлемые физико-механические свойства, высокую чувствительность к изменению ионного состава окружающей среды и высокую себестоимость. Главная проблема в разработке новых сорбентов – улучшение их сорбционных свойств, которые в некоторых случаях полностью теряются при переходе к реальным системам, что существенно ограничивает их потенциальные возможности применения. Существующий ассортимент современных раневых покрытий привязан как к форме ран, так и к его фазе и видам повреждений. Как следствие, такие изделия являются узконаправленными и дорогостоящими.
Несмотря на все многообразие существующих раневых покрытий на
рынке медицинских товаров, практически не существует экологически
безопасных материалов, комплексно воздействующих на раневой процесс. В
медицинской практике для лечения и профилактики ожоговых,
огнестрельных и гнойных ран применяются такие отечественные препараты
как Полифит (М, Д), Микотон, Левомеколь и фитосорбент ФСЭ. Данные
препараты обладают существенным недостатком: они приводят к резорбции
из раневой поверхности антибиотиков, химико-терапевтических и
антибактериальных препаратов, что способствует развитию патогенных микроорганизмов, ухудшающих заживление ран. Другим существенным недостатком природных биоактивных раневых покрытий, таких, как «Свидерм» (РФ), «AlloaskD» (Япония), «AlloDerm» (США), «Integra» (США),
«Dermagraft» (США) и т.п., является небольшой срок хранения. Пористые материалы для заживления ран из природных полимеров («Колласпон», «Комбутек-2», «Облекол»; «Альгипор», «Аубазидан» (РФ), и т.п.) не могут применяться в течение всего процесса заживления ран. Известные гелеобразные покрытия («Галагран» (РФ), «Галактон» (РФ) и др.) на основе сорбентов природного происхождения. Гелеобразные покрытия размягчают некротические образования за счет регидратации тканей (т.е. оказывают пластифицирующее воздействие), за счет чего предотвращают развитие инфекции под струпом и на поверхности раны. Их недостатком является фрагментация биоактивного полимерного покрытия непосредственно в самой ране.
Предложенные в данной работе фитоминералосорбенты (ФМС) на основе монтмориллонит содержащих глин и экстрактов лекарственных растений (эхинацея, тмин, ромашка аптечная, календула лекарственная, чабрец) обладают низкой стоимостью и высокой сорбционной емкостью. Модифицирование глинистой матрицы биологически активными веществами (БАВ), экстрагированными из лекарственных растений, положительно влияет на процесс заживления инфицированных ран.
Используемая монтмориллонитовая глина содержит в своем составе
пленочные кристаллы монтмориллонита, состоящие из трёхслойного пакета,
с толщиной элементарных слоев – 0,96 нм. Данный материал можно
рассматривать как наноструктурный, который в настоящее время
используется при разработке универсального раневого покрытия, в качестве
компонента композиционного материала, способствующего оттоку гноя из
раневой поверхности, тем самым сокращая сроки заживления
инфицированных ран. Экстракты лекарственных растений, входящие в
состав композиционного препарата, усиливают выраженные
антибактериальные свойства. Модифицирование монтмориллонит
содержащих глин действующими веществами, находящимися в экстрактах лекарственных растений, позволяет получить ФМС для лечения ожоговых, огнестрельных и гнойных ран. Проведенные доклинические исследования показали, что полученный ФМС химически инертен для организма человека и животного. Он способствует образованию струпа, состоящего из экссудата раневой поверхности и фитоминералосорбента, благодаря которому активные вещества будут действовать местно, не всасываясь в кровь и не вызывая аллергическую реакцию, тем самым способствуя быстрому заживлению ран.
Таким образом, получение ФМС из материалов местной минерально-сырьевой и растительной базы, изучение их сорбционных свойств и влияние на процесс заживления инфицированных ран является актуальной задачей.
Степень разработанности темы. Исследование в области разработки
сорбционно-активных композиционных материалов на основе
монтмориллонит содержащих глин ведутся научным коллективом кафедры
общей химии Института инженерных технологий и естественных наук
(Везенцев А.И. и др.), кафедры биохимии (Шапашников А.А. и др.) НИУ
БелГУ и кафедры информационных технологий топливно-энергетического
комплекса Санкт-Петербургского национального исследовательского
университета информационных технологий, механики и оптики (Успенская М.В.) и др.
Цель работы: разработка сорбционно активных композиционных
материалов с повышенной адсорбционной и антибактериальной активностью
по отношению к условно-патогенным микроорганизмам путем
модифицирования монтмориллонит содержащей глины (МСГ) биологически активными веществами, полученными из экстрактов лекарственных растений (эхинацея, тмин, ромашка аптечная, календула лекарственная, чабрец), и изучение их коллоидно-химических свойств.
Задачи:
изучить вещественный состав, коллоидно-химические свойства монтмориллонитовых глин месторождения «Поляна» Белгородской области и оценить возможность использования их для разработки композиционного сорбционно-активного материала с повышенной антибактериальной активностью;
провести обогащение монтмориллонит содержащей глины с целью выделения ее высокодисперсной части;
провести экстракцию БАВ лекарственных растений (эхинацея, тмин, ромашка аптечная, календула лекарственная, чабрец) и определить технологические параметры экстракции;
установить оптимальный режим модифицирования монтмориллонит содержащих глин полученными экстрактами;
определить наиболее эффективный вид лекарственного растения для разработки фитоминералосорбентов;
определить сорбционные характеристики разработанных композиционных сорбционно-активных материалов по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, уксусной кислоте и катионам железа (III);
выявить бактерицидное действие нативной монтмориллонит содержащей глины;
провести исследование влияния ФМС на заживление инфицированных ран и подавление роста условно-патогенных микроорганизмов в условиях in-vitro и in-vivo.
Научная новизна работы:
разработаны физико-химические параметры получения материалов на основе минерального и растительного сырья путем модифицирования поверхности монтмориллонита биологически активными веществами, экстрагированными из лекарственных растений. Установлено, что модифицирование МСГ биологически активными веществами происходит путем физической сорбции и приводит к агломерации частиц за счет смачивания монтмориллонита экстрагированными флавоноидами;
определены оптимальные параметры модифицирования антибактериальных сорбентов и зависимости сорбционных и бактерицидных характеристик от массового соотношения исходных компонентов и дисперсности композиционного сорбента;
установлено, что частицы экстрагированных БАВ осаждаются на поверхности кристаллов монтмориллонита и частично блокируют процесс сорбции уксусной кислоты, что благоприятно влияет на процесс ранозаживления, так как уменьшение кислотности в очаге раневого процесса приводит к замедлению процесса ранозаживления;
методом растровой аналитической электронной микроскопии установлены структурно-морфологические особенности модифицированного МСГ биологически активными веществами. В образце ФМС присутствуют удлиненные частицы и поры, заполненные БАВ. Данные характеристики указывают на поглощение экстрагированных БАВ монтмориллонит содержащими глинами по механизму объемного заполнения микропор.
Теоретическая и практическая значимость:
разработаны сорбционно активные композиционные материалы с повышенной антибактериальной активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам путем модифицирования МСГ биологически активными веществами, полученными из экстрактов лекарственных растений (ромашка аптечная и календула лекарственная);
установлено, что оптимальное массовое соотношение сорбента и сухого остатка лекарственных растений для разработки ФМС составляет 1 : 1;
выявлен оптимальный вид лекарственного растения (календулы лекарственной и ромашки аптечной), что позволило получить наиболее эффективный сорбционно-активный материал;
доклинические исследования ФМС на лабораторных животных показали положительное влияние разработанных материалов на процесс заживления инфицированных ран;
выявлена возможность применения полученных композиционных материалов для ускорения процесса ранозаживления живых организмов;
себестоимость 100 г разработанного материала ФМС (ромашка аптечная) составляет 61,86 руб., а ФМС (календула лекарственная) – 79,86 руб. С учетом всех операционных затрат предприятия отпускная цена производителя составит 90 и 100 руб. соответственно;
разработана производственно-технологическая схема обогащения и модифицирования монтмориллонитовой глины с целью получения сорбционно активных композиционных материалов с повышенной антибактериальной активностью.
Методология и методы исследований:
В работе использованы следующие физико-химические методы исследований: рентгенофазовый и рентгенофлуоресцентный анализы с использованием рентгеновской рабочей станции ARL 9900 series x-ray workstation с Co анодом, излучением Ka1, U = 60 кВ, растрового аналитического ионно-электронного микроскопа Quanta 200 3D с энергодисперсионным анализатором EDAX; изучение гранулометрического состава на лазерном анализаторе дисперсного состава твердых материалов Microtrac S3500, определение удельной поверхности, объема и среднего размера пор материалов по методу БЭТ реализован на автоматизированной сорбционной установке TriStar II 3020 производства Micromeritics, методом электрофоретического рассеяния света определен электрокинетический (дзета) потенциал поверхности исследуемых образцов на анализаторе Zetasizer Nano ZS фирмы Malvern Instruments, спектрофотометрия проводилась с помощью спектрофотометра SPECORD 210 PLUS.
Для оценки бактерицидного действия и сорбционной способности условно-патогенных микроорганизмов монтмориллонит содержащей глиной использовали метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Nikon DIGITAL ECLIPSE C1 plus (Япония) и флуоресцентный зонд 5-карбоксифторесцеин диацетат. Определение антибактериального действия разработанных ФМС проводилось путем измерения зоны задержки роста микроорганизмов в условиях in-vitro. Эффективность сорбции гноя ран оценивали по общему морфологическому анализу крови подопытных крыс.
Использование перечисленных методов позволило произвести
комплексную оценку коллоидно-химических и структурно-морфологических свойств фитоминералосорбентов.
Положения, выносимые на защиту:
способ модифицирования сорбционно-активных монтмориллонит содержащих глин экстрактами лекарственных растений (ромашка аптечная, календула лекарственная, тмин, эхинацея, чабрец);
оптимальные физико-химические параметры получения композиционных материалов с повышенными адсорбционными и антибактериальными свойствами;
результаты экспериментальных исследований по определению коллоидно-химических свойств, в частности сорбционной активности по отношению к ионам железа (III), уксусной кислоте, органическим красителям;
экспериментальные данные о бактерицидном действии и сорбционной способности МСГ и ФМС по отношению к условно-патогенным микроорганизмам в условиях in-vitro и in-vivo;
результаты доклинических исследований экспериментальных сорбентов на лабораторных животных.
Достоверность результатов работы основывается на использовании
современных физико-химических методов исследований, стандартных
методик современного инструментального анализа, получении
воспроизводимых экспериментальных данных, непротиворечащих
современным научным представлениям и закономерностям.
Работа выполнялась в соответствии с тематическим планом секции сорбционных явлений Научного совета по физической химии РАН 2013-2015 годов, в виде раздела «Разработка фитоминералосорбента на основе монтмориллонитовых глин» темы под номером 2.15.4.М «Разработка и исследование сорбентов на основе нативных и модифицированных слоистых силикатов структурного типа 2:1».
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и
обсуждены на всероссийских и международных научно-практических
конференциях: Международная научная конференция «Экология и
рациональное природопользование агропромышленных регионов»
(Белгород, 2013); Х Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием «Современные проблемы горно-
металлургического комплекса. Энергосбережение. Экология. Новые
технологии» (Старый Оскол, 2013); Всероссийская конференция
«Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной
селективности» с международным участием (Москва-Клязьма, 2014); I
Международная научно-практическая интернет-конференция
«Теоретические и практические аспекты исследования лекарственных растений» (Харьков, Украина, 2014); Всероссийская научная конференция с международным участием «Сорбционные и ионообменные процессы в нано-и супрамолекулярной химии» (Белгород, 2014); Международная научно-техническая конференция «Энерго- и ресурсосберегающие экологически чистые химико-технологические процессы защиты окружающей среды» (Белгород, 2015); II Международная научно-практическая интернет-конференция «Теоретические и практические аспекты исследования лекарственных растений» (Харьков, Украина, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных публикаций, включая две статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Подана заявка о выдаче патента Российской Федерации на изобретение № 2015151461 от 01.12.2015 г.
Объем и структура работы:
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы, включающего 130 наименований и трех приложений. Работа изложена на 108 страницах, включающего 24 рисунка, 13 таблиц.
Состав и свойства сорбентов природного происхождения
Природные сорбенты (породы и минералы) – обладают уникальными ионообменными, адсорбционными и каталитическими свойствами [34]. Среди них наибольший интерес представляют цеолиты, палыгорскитовые и бентонитовые глины, глаукониты, опал – кристобалитовые породы (трепелы, диатомиты, опоки), перлиты и вермикулиты.
Природные сорбенты можно разделить на две группы в зависимости от кристаллической структуры: первый групп сорбентов имеют кристаллическую структуру и второй групп – аморфную гелево-пористую структуру [35, 36]. К группе сорбентов с кристаллической структурой относятся сорбенты с жесткой кристаллической решеткой – цеолиты (каркасного типа), ленточно-слоистые и слоистые сорбенты глинистого типа с разбухающей кристаллической структурой (палыгорскиты и бентониты) и слоистые сорбенты неразбухающего глинистого типа (глаукониты). К группе сорбентов, имеющих аморфную гелево-пористую структуру относятся перлиты и опал-кристобалитовые породы. В связи с различиями кристаллической структуры и минерального состава, технологические и физико-химические свойства природных сорбентов весьма разнообразны. Например, палыгорскиты и опоки имеют большую удельную поверхность, а бентониты, вермикулиты и цеолиты – высокую ионообменную способность.
В зависимости от размера пор разделяются сорбенты макропористые — перлиты, диатомиты; микро- и переходно-пористые бентониты, глаукониты, опоки и ультра микропористые со свойствами молекулярных сит — палыгорскиты, цеолиты.
В зависимости от кристаллохимии поверхности глинистые минералы подразделяются на две основные группы [35-38]: первая группа – минералы с нейтральными электрическими решетками (не имеющие изоморфных замещений). Структура и состав базальных поверхностей этой группы минералов кристаллохимически разные: поверхность, содержащая атомы кислорода имеет тетраэдрическую сетку, а другая содержит гидроксильные группы и имеет октаэдрическую сетку. Эти минералы относятся к слоистым силикатам структурного типа 1:1. К этой группе относятся каолинитовые минералы (рис. 1). Структурная формула каолинита – Al2Si2O5[OH]4, тем не менее состав отдельных частей этой структуры может отличаться от первоначального. Пакет каолинита – электронейтрален. Прочная связь между слоями в пакете возникает между атомами кислорода и группами ОН- (водородная связь). Энергия водородных связей составляет 34 – 42 кДж/моль и соединяет отдельные пакеты между собой [38-42].
Ко второй группе относят гидрослюдистые и монтмориллонитовые минералы, имеющие электрически неуравновешенные решетки в результате изоморфных замещений. Отрицательный заряд этих минералов компенсируется обменными (Mg2+, Na+, Са2+ и др.) или необменными катионами (чаще всего К+). Однотипные базальные поверхности этой группы минералов состоят из кремнекислородных тетраэдрических сеток содержащихся атомы кислорода [43]. Расположены между кремнекислородных тетраэдрических сеток находятся алюминальные, либо магнезиальные, либо железистые октаэдрические сетки, которые образуют пакет структурного типа 2:1.
В группу слюдоподобных минералов входят глауконит, гидромусковит, иллит и др. В трехслойных пакетах кристаллов слюд, часть атомов алюминия замещают атомы кремния, в следствии чего, отрицательный заряд кристаллической решетки уравновешивается ионами калия, которые располагаются между пакетами. Толщина трехслойного пакета слюдоподобных минералов составляет 1 нм. Изоморфные замещения характерны для кристаллической решетки гидрослюд: калий может замещаться катионами с большим ионным радиусом, например, кальцием или натрием, а алюминий – магнием и железом. Электрически неуравновешенная кристаллическая решетка гидрослюд возникает за счет большого количества отрицательных зарядов вследствие изоморфных замещений [39].
В гидрослюдах неактивными являются внутренние поверхности, а активными -краевые участки и внешние поверхности базальных граней. Надо отметить, что по величине площади активных поверхностей, между монтмориллонитом и каолинитом, промежуточное положение занимают гидрослюды.
Химический состав лекарственного растительного сырья
На полученную сеточку с углеродной пленкой наносили каплю водной суспензии исследуемого образца. Причем согласно методическим рекомендациям [110] для получения достоверных результатов исследования, анализ образцов проводили для трех сеточек с образцом, нанесенным из одной и той же пробы после тщательного перемешивания пробы перед каждым нанесением на сеточку. Согласно методическим рекомендациям [111] лабораторную пробу формировали выделением части средней пробы в количестве, достаточном для проведения однократного анализа
Проведено изучение элементного состава адсорбентов на электронном ионно-растровом сканирующем микроскопе «Quanta 200 3D» методом энергодисперсионного анализа. Данная система в растровом электронном микроскопе предназначена для анализа вторичного излучения. После возбуждения первичными электронами луча микроскопа, при релаксации атомы вещества излучают кванты. Энергия излучаемых квантов эквивалентна разности энергии между оболочками где происходят переходы.
Набор элементов, образовавших определенный спектр и составляющих образца можно определить с помощью вторичных спектров так как энергии электронных уровней определены строго для каждого элемента таблицы Менделеева. Концентрация соответствующего элемента может быть определена интенсивностью линии спектра. На основе результатов такого исследования можно представить содержании определенного элемента в весовых процентах от общего количества элементов в данной точке образца.
Удельная поверхность образцов определена методом низкотемпературной адсорбции азота в анализаторе удельной площади TriStar II 3020 [112]. Количество адсорбированного азота на 1г сорбционно-активного материала зависело от температуры (Т), равновесного давления (Р), а так же от происхождения определяемого материала. Площадь поверхности твердых материалов измеряли с помощью метода Брюнера – Эммета – Теллера (БЭТ). Удельная поверхность соответствует следующему уравнению БЭТ: (3) где Р0 – давление насыщения газа адсорбата, Wm – масса адсорбированного вещества, покрывающий всю поверхность монослоя, W – масса адсорбированного газа, при относительном давлении Р/Р0, С – константа ВЕТ, относящаяся к энергии адсорбции в первом адсорбированном слое и, следовательно, ее значение является показателем магнитуды взаимодействия адсорбент/адсорбат. Средний размер частиц вычисляют из уравнения: — (4) где - плотность, S - удельная поверхность. Определение удельной поверхности, объема и среднего размера пор материалов по методу БЭТ реализуется на автоматизированной сорбционной установке TriStar II 3020 производства Micromeritics (США). Прибор размещен на ЦКП НИУ «БелГУ». Используется объемный вариант сорбционного метода. Удельная поверхность рассчитывается по изотерме низкотемпературной сорбции паров азота по одноточечному методу БЭТ в точке P/P0 = 0.318937093.
Электрический потенциал образцов находящихся во взвешенном состоянии в дистиллированной воде определили на анализаторе Zetasizer Nano ZS фирмы Malvern Instruments. Знак и величины -потенциала определяли с помощью фазового анализа рассеянного света и лазерного измерения скорости.
С помощью измерения электрического потенциала, возникающего между границей скольжения и поверхностью заряженной частицы, т.е. при электрофорезе, определяли знак заряда на поверхности исследуемых образцов.
С целью выявления механизма бактериальной адгезии к монтмориллониту, оценки бактерицидного действия использовали метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [116] и флуоресцентный зонд 5-карбоксифторесцеин диацетат (5-Carboxyfluorescein diacetate, С4916 Sigma-Aldrich) [117]. Из стоковых растворов сорбента шестикратно отбирали по 10 мкл суспензии.
Каждую пробу вносили в отдельные чашки Петри диаметром 35 мм покровным стеклом (SPL Lifesciences) с центральным отверстием. Стоковые растворы флуоресцентного зонда были приготовлены по следующей схеме: 5 мг 5 карбоксифторесцеин диацетата растворяли в 1,1 мл. диметил сульфоксида (DMSO) для получения 10 mM раствора флуоресцентного зонда (JustynaKozlowska1, LouicS. Vermeer1, GeraintB. Rogers1, NabilaRehnnuma1, Sarah-BethT. A. Amos1, GarritKoller2, MichaelMcArthur3, KennethD. Bruce1, A. JamesMason1. Combined Systems Approaches Reveal Highly Plastic Responses to Antimicrobial Peptide Challenge in Escherichia coli// PLOS Pathogens. May 2014, Vol. 10, pp. 1-14). Затем в чашку Петри добавляли 180 мкл раствора Дюльбекко (ПанЭко) и 10 мкл флуоресцентного зонда, после перемешивания пробы помещали в термостат и инкубировали при +37 С в течение 30 мин. После истечения времени инкубации провели сканирование образцов с помощью конфокального лазерного санирующего микроскопа Nikon DIGITAL ECLIPSE C1 plus при длине волны 488 нм. На основе полученных данных конфокальной микроскопии определяли количество живых клеток в поле зрения в объеме исследуемой пробы.
Для определения антибактериального действия, использовали мясопептонный агар после автоклавирования с температурой 43-45С. На горизонтальной поверхности, в одноразовые чашки Петри вносили культуру исследуемых микроорганизмов исходя из расчета, что концентрация микроорганизмов будет 1,5107 КОЕ в мл агара и вносили необходимую навеску стерильного ФМС, где расставляли 6 трубчатых цилиндриков из нержавеющего стали. В них насыпали по 100 мг исследуемого ФМС, а затем капали сыворотку крови крупного рогатого скота по 0,2 мл для того, чтобы выяснить связывается ли плазма крови раневой поверхности с экстрактом лекарственных растений ФМС. Затем помещали чашки в термостат и культивировали при температуре 37С в течение 16-18 часов. Далее для определения чувствительности микроорганизмов к исследуемым сорбентам рассчитали зоны задержки роста микроорганизмов (рис. 4).
Химический состав экспериментальных сорбентов
ФМС с экстрактом тмина подавляет рост бактерии Candida albicans на 39,58% больше чем обогащенной МСГ, и на 8,33% больше чем ФМС с экстрактом ромашки аптечной. По отношению к микроорганизмам Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, эффективность ФМС с тмином отличается от МСГ на 5,44% и 5,56% соответственно. В случае микроорганизма Enterococcus faecalis и Escherichia coli эффективность подавления роста ФМС с экстрактом тмина меньше чем ФМС с экстрактом ромашки аптечной на 19,6 и 5,5% соответственно. По сравнению с ФМС с экстрактом календулы лекарственной меньше на 20,58 и 4,59% соответственно. Средняя эффективность подавления зона задержки роста условно-патогенных микроорганизмов ФМС с экстрактом тмина составляет 11,24%.
ФМС с экстрактом чабреца подавляет рост микроорганизма Escherichia coli эффективнее остальных ФМС: на 35,78% больше МСГ, на 22,94% больше ФМС с экстрактом ромашки аптечной и на 23,85% больше ФМС с экстрактом календулы лекарственной. Не смотря на высокую чувствительность бактерий Escherichia coli к данному экспериментальному сорбенту, ФМС с экстрактом чабреца менее эффективно подавляет рост бактерии Candida albicans, Enterococcus faecalis и Pseudomonas aeruginosa чем остальные экспериментальные сорбенты.
Наиболее эффективнее по подавлению роста бактерий Enterococcus faecalis оказался ФМС с экстрактом эхинацеи (на 38,24% больше МСГ, на 5,89% больше ФМС с экстрактом ромашки аптечной и на 4,91% больше ФМС с экстрактом календулы лекарственной). Исходя из представленных результатов, исследование сорбционных и антибактериальных свойств проводилось на образцах ФМС содержащих аптечной ромашки и лекарственной календулы. Установлено, что Введение экстрагированных БАВ в качестве антибактериального наполнителя в монтмориллонитовую матрицу позволит получить значимый бактерицидный эффект в композиционных материалов на его основе. Все экспериментальные сорбенты обладают антибактериальными свойствами, однако исходя из представленных данных, установлено, что наиболее результативное действие оказывают ФМС с экстрактом ромашки аптечной и календулы лекарственной (122,93 и 122,08% соответственно) так как они, в среднем, проявляют самые устойчивые результаты по отношению ко всем видам условно-патогенным микроорганизмам.
Сорбционная активность экспериментальных сорбентов в кислой среде по отношению к уксусной кислоте С целью определения сорбционной активности экспериментальных сорбентов в кислой среде (в подобие кислой среды вызванной накоплением большого количества лейкоцитов в ответ на проникновение в ткани возбудителей бактериальной инфекции) проведена сорбция уксусной кислоты экспериментальными сорбентами в водных растворах. На основе полученных данных построены изотермы адсорбции (рис. 20) и проведен сравнительный анализ. Полученные данные показывают, что обогащенная МСГ сорбирует уксусную кислоту на 26% больше ФМС, полученный с экстрактом календулы лекарственной и на 24% больше чем ФМС, полученного с экстрактом ромашки аптечной. Высокая сорбционная емкость МСГ объясняется тем, что в кристаллах монтмориллонита ионно-обменный процесс происходит внутри кристаллической решетки в полостях между кремнекислородными тетраэдрическими слоями и на внешней поверхности кристалла. Кроме того, МСГ содержит 6-7% СаО в своем составе, что способствует химической нейтрализации уксусной кислоты, тем самым оказывает отрицательное влияние на процесс ранозаживления, так как образованная кислая среда обусловленная лейкоцитами нужна для нейтрализации бактерии. В случае ФМС частицы экстрагированных БАВ осаждаются на поверхности кристаллов минералов монтмориллонит содержащих глины и препятствуют процессу сорбции, частично блокируя активные центры, отвечающие за нейтрализации кислой среды, что объясняет менее активное поглощение уксусной кислоты, что положительное влияет на процесс ранозаживления. а) а) изотермы сорбции уксусной кислоты из модельных растворов; б) линеаризованные формы изотерм сорбции типа Фрейндлиха Данные, полученные при анализе изотерм сорбции, обработаны на соответствие преобразованному уравнению Фрейндлиха: , где A – величина адсорбции, ммоль/г ; С – равновесная концентрация уксусной кислоты, моль/л ; К – сила связывания адсорбат-адсорбента. Уравнение Фрейндлиха применяется для обработки экспериментальных данных при молекулярной адсорбции. Таким образом, путем графического решения уравнения Фрейндлиха определили максимальную сорбцию экспериментальных сорбентов. Образец МСГ отличается максимальной адсорбцией и более отрицательной энергией взаимодействия (G = -13,23), но сила связывания адсорбат-адсорбент меньше, чем у других образцов и равна К = 72,38. Это хорошо тем, что на поверхности МСГ сорбируется максимальное количество уксусной кислоты по сравнению с другими образцами, но при этом легко происходит процесс десорбции, что способствует понижению рН раствора и приводит к быстрому заживлению ран. Данные подтверждающие выше приведенный анализ представлены в таблице 9.
Установлено, что в первую минуту сорбция ионов железа максимальна, Для МСГ первоначальная концентрация ионов Fe3+ в модельных растворах (5 мг/л) снижается до 0,45 мг/л для МСГ. Для ФМС (ромашка аптечная) и ФМС (календула лекарственная) снижается до 1,44 и 1,2 мг/л соответственно. Затем наблюдается выход кинетических кривых на плато после 5-ой минуте сорбции (концентрация ионов Fe3+ для МСГ, ФМС (ромашка аптечная) и ФМС (календула лекарственная) составляет 0,3, 0,85 и 0,76 мг/л соответственно). Данное явление связано с образованием насыщенного мономолекулярного слоя, что соответствует выходу кривых на плато. Эффективность поглощения из модельных водных растворов катионов железа (III) после 60 минут для МСГ достигает 98,5% (0,023 мг/л), что может затруднять действие форменных элементов в крови, содержащих гемоглобин. Концентрация ионов Fe3+ после 60 минут для ФМС с экстрактом ромашки аптечной и ФМС с экстрактом календулы лекарственной составляет 0,59 и 0,73 мг/л соответственно, что указывает на уменьшение поглотительной способностью по сравнению с МСГ на 11,4% и 14,2%, что положительно влияет на процесс ранозаживления. На основании полученных данных рассчитана скорость сорбции ионов железа (III) в модельных растворах (рис. 22).
Оценка экономической эффективности экспериментальных сорбентов
Отходы сорбентов подлежат утилизации, поскольку содержащиеся в них вещества не представляют угрозу вторичного загрязнения окружающей среды. На основе литературных данных можно предложить использовать их в качестве строительного материала при приготовления черепиц для покрытия домов [38, 126-130]: композитная, битумная и керамическая. Введение глины в состав керамической черепицы как метод их утилизации распространен. При использовании глин, всегда отмечается порообразование, сжигающее водонепроницаемость черепицы и ее морозостойкость. Для устранения этих недостатков наносится слой жидкой глины, обжиг которой приводит к образованию плотного покрытия. Выводы 1. Разработана технологическая схема получения сорбционно-активных компонентов композиционных материалов с повышенной антибактериальной активностью. 2. Рассчитана стоимость разработки экспериментальных сорбентов с учетом затрат на сырьевые материалы, удельные нормы расхода электроэнергии и воды. 3. Проведен анализ рынка зарубежных и российских аналогов и установлено, что разработка экспериментальных сорбентов на основе природного минерального и растительного сырья, расположенного на территории России, позволит создать технологии производства эффективных и менее дорогостоящих композиционных материалов с повышенной антибактериальной активностью и представляются как решение вопроса импорт замещения. 4. Предложено использовать отходы производства модифицированных сорбентов, которые могут быть использованы в качестве добавки к керамическим смесям.
Итоги выполненного исследования:
1. В результате изучения коллоидно-химических свойств монтмориллонит содержащей глины модифицированной экстрактами лекарственных растений разработан композиционный сорбент с повышенной антибактериальной активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis и Pseudomonas aeruginosa.
2. Выявлено, что внедрение экстрагированных биологически активных веществ в структуру монтмориллонит содержащей глины происходит путем физической сорбции и приводит к агломерации за счет смачивания монтмориллонита флавоноидами экстрагированными веществ, то есть, к изменению структурно-морфологических характеристик ФМС, в котором наблюдаются частично заполненные поры исходного сорбента, удлиненные частицы экстрагированных БАВ размером до 10 мкм и частицы размером до 2,5 мкм осаждающиеся и прикрепляющиеся к поверхности сорбционно активного монтмориллонита.
3. Доказано, что гранулометрический состав в МСГ имеет равномерное распределение частиц в диапазоне значений от 0,6 мкм до 250 мкм, и наибольшая доля частиц (45 – 52%) имеет размер 6,5 – 13 мкм. В гранулометрическом составе ФМС преобладают частицы размером 4 – 9 мкм (доля частиц составляет 45 – 53%) и 32 – 74 мкм (доля частиц составляет 30 – 35%). Также диапазон значений размеров частиц составляет – 0,5 мкм - 490 мкм.
4. Полученные значения относительного давления для образцов МСГ и ФМС при которых происходит смыкание кривых гистерезиса на изотермах десорбции при относительном давлении 0,46 и 0,47 соответственно, что свидетельствует о наличии микропористых структур. 5. Установлено, что максимальные значения поглощения газообразного азота одним граммом экспериментального адсорбента равны 44,65 см3 для МСГ и 20,52 см3 для ФМС, а средние размеры пор в образце МСГ равны 70 - 80 и в образце ФМС – 300 - 330 .
6. Доказано частичное блокирование активных центров монтмориллонита отвечающих за поглощение уксусной кислоты в процессе его модифицирования экстрактом ромашки аптечной и календулы лекарственной на 24% и 26% соответственно по сравнению с МСГ, что положительно влияет на процесс ранозаживления.
7. Исследована эффективность сорбции экспериментальных сорбентов МСГ и ФМС по отношению к катионом Fe3+ в течении 60 минут и установлено, что ФМС с экстрактом ромашки аптечной и ФМС экстрактом календулы лекарственной сорбируют Fe3+ на 11,4% и 14,2% меньше чем МСГ, что положительно влияет на процесс ранозаживления так как высокая сорбционная активность по отношению к Fe3+ может затруднять действие форменных элементов в крови, содержащих гемоглобин.
8. Показано, что все экспериментальные сорбенты обладают антибактериальными свойствами. Введение экстрагированных БАВ в качестве антибактериального ингредиента в монтмориллонитовую матрицу позволило получить значимый бактерицидный эффект в композиционных материалов на его основе.
9. Сравнительное исследование по оценке биосовместимости проведенное на беспородных лабораторных белых мышах, выявило повышенную биосовместимость разработанных ФМС, быстрое снижение кровопотери и эффективное влияние в процесс ранозаживления.
10. Установлено, что разработка экспериментальных сорбентов на основе природного минерального и растительного сырья, расположенного на территории России, позволит создать технологии производства эффективных и менее дорогостоящих композиционных материалов с повышенной антибактериальной активностью и представляются как решение вопроса импорт замещения. Цена производства 1 г ФМС (ромашки аптечной) и ФМС (календулы лекарственной) составляет 0,63 руб. и 0,81 руб. соответственно в ценах апреля 2016 г. Отпуская цена 1 г ФМС (ромашки аптечной) и ФМС (календулы лекарственной) составляет 0,83 и 1 рубль соответственно.
Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы: Экспериментальные и теоретические результаты диссертационной работы могут быть рекомендованы к внедрению в исследовании и производстве современных композиционных материалов с ранозаживляющими и антибактериальными свойствами, а также в учебном процессе при подготовке бакалавров по направлению 19.03.01 «Биотехнология» и магистрантов по направлению 04.04.01 «Химия».
Дальнейшие исследования в этой области могут быть направлены на изучение физико-химических процессов взаимодействия глицериновых смесей и элементов содержащих целлюлоза с разработанными фитоминералосорбентами, а также влияния дисперсности сырьевых компонентов на коллоидно-химические и ранозаживляющие свойства.