Содержание к диссертации
Введение
Благодарности 13
1. Литературный обзор 14
1.1. Общие сведения о сорбции 14
1.2. Металл-аффинная адсорбция 17
1.3. Фосфорорганические отравляющие вещества
1.3.1. Физические свойства и история разработки боевых ФОВ 19
1.3.2. Механизм действия 20
1.3.3. Реакция зарина с АХЭ 21
1.3.4. Взаимодействие с эстеразами 25
1.4. Аналитические методы определения ФОВ и продуктов воздействия ФОВ на организм 26
1.4.1. Масс-спектрометрия в фосфопротеомике 28
1.4.2. Электроспрей 28
1.4.3. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация 29
1.5. Сорбционная очистка и концентрирование 33
1.5.1. Металл-аффинные сорбенты 33
1.5.2. Металл-оксидные сорбенты 35
1.5.3. Металл-хелатные сорбенты 38
1.6. Тонкие пленки 40
1.6.1. Получение тонких пленок 40
1.6.2. История метода Ленгмюра-Блоджетт 40
1.6.3. Свойства пленок Ленгмюра-Блоджетт 41
2. Экспериментальная часть 47
2.1. Материалы и методы исследований 47
2.2. Методы исследования физико-химических свойств
2.2.1. Получение монослоев стеарата лантана 49
2.2.2. Исследование структурного звена монослоя стеарата лантана 49
2.2.3. Стандартизация монослоёв стеарата лантана 50
2.2.4. Измерение удельной поверхности стеарата лантана методом низкотемпературной адсорбции азота 50
2.2.5. Изотермы сжатия монослоев стеарата лантана 50
2.2.6. Определение изоэлектрической точки для стеарата лантана 51
2.2.7. Исследование устойчивости пленок стеарата лантана в различных растворителях 51
2.2.8. Сканирующая электронная микроскопия коллапсированных пленок стеарата лантана 52
2.2.9. Микроволновый синтез дисперсного хромита лантана 53
2.2.10. Рентген-дифракционное определение хромита лантана 54
2.2.11. Исследование хромита лантана методом лазерной дифракции 54
2.2.12. Определение площади поверхности хромита лантана методом низкотемпературной адсорбции криптона 54
2.2.13. Сканирующая электронная микроскопия хромита лантана 55
2.3. Методы исследования сорбционной способности 56
2.3.1. Количественное определение сорбционной емкости пленочного стеарата лантана по фосфорилированному пептиду методом ВЭЖХ УФ 56
2.3.2. Десорбция с перерастворением сорбента 57
2.3.3. Определение сорбционной способности стеарата лантана по бычьему казеину методом АСМ 57
2.3.4. Качественный масс-спектрометрический анализ сорбционной способности стеарата лантана методом МАЛДИ МС 58
2.3.5. Качественное определение сорбционной способности хромита лантана по фосфорилированному пептиду методом МАЛДИ МС 58
3. Обсуждение результатов 60
3.1. Получение монослоев стеарата лантана 60
3.2. Определение условий получения сорбента 65
3.3. Определение электрокинетического потенциала 66
3.4. Определение устойчивости сорбента в растворителях 69
3.5. Сканирующая электронная микроскопия пленок стеарата лантана 71
3.6. Микроволновый синтез хромита лантана 74
3.7. Определение фазового состава хромита лантана 75
3.8. Определение размера частиц хромита лантана методом лазерной дифракции 76
3.9. Сканирующая электронная микроскопия хромита лантана 3.10. Исследование сорбции и десорбции казеина с поверхности пленок стеарата лантана методом атомно-силовой микроскопии 80
3.11. Количественное определение сорбции и десорбции фосфорилированных пептидов пленками стеарата лантана методом ВЭЖХ УФ 82
3.12. Исследование сорбции аддуктов ФОВ с сывороточным альбумином человека на монослоях стеарата лантана 83
3.13. Исследование сорбции аддуктов ФОВ с сывороточным альбумином человека на хромите лантана 84
3.14. Обоснование выбора сорбента для дальнейших исследований 86
3.15 Выделение аддуктов сывороточного альбумина человека с ФОВ методом металл-аффинной хроматографии на монослоях стеарата лантана (определение условий сорбции-десорбции) 87
3.15.1 Определение условий сорбции фосфонилированных пептидов из пептического гидролизата сыворочного альбумина человека, модифицированного зоманом, на монослоях стеарата лантана 87
3.15.2 Определение условий десорбции фосфонилированных пептидов сыворочного альбумина человека, модифицированного зоманом, с монослоев стеарата лантана 90
3.15.3 Исследование возможности десорбции аддуктов ФОС с сывороточным альбумином человека с сорбента путем разрушения структуры монослоев 92
3.15.4 Оптимизация методики металл-аффинной хроматографии 94
3.15.5 Металл-аффинная хроматография на МАЛДИ мишени 99
3.16 Исследование возможности выделения методом металл-аффинной хроматографии аддуктов холинэстеразы с ФОВ 102
3.16.1 Исследование сорбции и десорбции бутирилхолинэстеразы лошади, модифицированной RVx, методом атомно-силовой микроскопии 102
3.16.2 Исследование возможности выделения аддуктов холинэстеразы с зоманом методом металл-аффинной хроматографии на монослоях стеарата лантана 103
3.16.3 Сравнение специфичных свойств монослоев стеарата лантана с коммерчески доступными металл-аффинными сорбентами 107
Основные результаты 108
Список сокращений 109
Приложение 110
Список литературы 111
- Аналитические методы определения ФОВ и продуктов воздействия ФОВ на организм
- Исследование структурного звена монослоя стеарата лантана
- Качественный масс-спектрометрический анализ сорбционной способности стеарата лантана методом МАЛДИ МС
- Исследование возможности выделения методом металл-аффинной хроматографии аддуктов холинэстеразы с ФОВ
Введение к работе
Актуальность темы. Получение пленок Ленгмюра-Блоджетт (ПЛБ) является методом создания двумерных молекулярных ансамблей регулярной структуры. Одной из наиболее привлекательных сторон метода является возможность контроля свойств пленок путем варьирования полярной и неполярной частей молекулы поверхностно-активного вещества, состава и pH водной субфазы, способа переноса пленок на твердую поверхность. Кроме того, особенность ПЛБ – возможность получения поверхности, равномерно заполненной ионами металла. С одной стороны, благодаря предсказуемым свойствам, ПЛБ являются хорошими модельными системами для исследования поведения иммобилизованных ионов металла, с другой стороны, благодаря большой удельной поверхности и легкости получения пленки, являются привлекательными материалами для практического применения – например, для получения металл-аффинных сорбентов, которые используются для обогащения и разделения пептидов на основании различного сродства гетероатома в составе пептида к иону металла сорбента. В частности, металл-аффинная хроматография позволяет выделить фосфорсодержащие пептиды – проблема анализа фосфорилирован-ных и фосфонилированных (содержащих остаток фосфоновой кислоты) пептидов актуальна в связи с широким распространением пестицидов в сельском хозяйстве, а также с возможным использованием фосфорорганических нервнопаралитических отравляющих веществ в военных и террористических целях.
Основным критерием оценки сродства гетероатома или функциональной группы пептида, имеющей в составе гетероатом, к иону металла считается теория жестких и мягких кислот и оснований Пирсона. К ионам металлов, которые широко используются в настоящее время для металл-аффинной сорбции относятся Ni2+, Fe3+, Ga3+, Ti4+, Zr4+. Каждый из этих металлов обладает уникальными свойствами и подходит для решения своего ограниченного круга задач. К перспективным ионам можно отнести трехзарядные ионы редкоземельных металлов, среди них наибольший интерес привлекает ион La3+ как наиболее жесткая кислота Пирсона.
В настоящее время металл-аффинные сорбенты принято делить на металл-хелат-ные и металл-оксидные. Первые создаются на основе хелатированных полидентат-ными лигандами ионов металлов, вторые состоят из оксидов металлов в виде порошков или иммобилизованы на инертном оксидном носителе. Каждый из этих подходов имеет свои особенности, но в целом позволяет создать материал, пригодный для решения задач протеомного анализа.
Создание металл-оксидного сорбента состоящего непосредственно из оксида лантана не представляется возможным, поскольку оксид лантана в водной среде гид-ролизуется, однако возможно создание комбинированного оксидного соединения с переходными металлами. В качестве такого элемента предпочтительнее всего выбрать металл, слабо проявляющий аффинные свойства: например, хром. Хромит лантана является устойчивым химическим соединением, не подвержен гидролизу. Сделано предположение, что синтез дисперсного хромита лантана, пригодного для применения в качестве металл-аффинного сорбента, может быть осуществлен с помощью модифицированного золь-гель метода с применением микроволнового излучения.
Преимуществом ПЛБ на основе стеарата лантана является наличие поверхности, регулярно заполненной иммобилизованными ионами лантана. Связь лантана со сте-арат-анионом оказывается достаточно прочной, чтобы лантан не переходил в раствор из состава сорбента, но при этом геометрические ограничения, налагаемые на
двумерную пленку, не позволяют остаткам стеариновой кислоты занять все доступные вакансии на ионе лантана. Экспериментально показано, что структурным звеном ПЛБ на основе стеаратов трехзарядных ионов являются дистеараты металла, а последняя свободная вакансия занимается анионом субфазы, и легко замещается гетероатомом пептида с образованием координационной связи, что позволяет использовать ПЛБ трехвалентных металлов в качестве металл-аффинных сорбентов.
Коммерчески доступные в настоящее время сорбенты для фосфорилированных пептидов характеризуются низким уровнем сродства к аддуктам пептидов с фосфо-рорганическими веществами (ФОВ) и высоким уровнем неспецифичной сорбции, что заметно снижает чувствительность анализа. Высокочувствительные сорбенты на основе антител отличаются чрезвычайно высокой стоимостью и не всегда доступны.
Разработка вещества, способного обратимо специфически адсорбировать продукты воздействия боевых ФОВ на организм человека – одна из актуальных задач ретроспективного анализа для установления факта отравления ФОВ и определения типа отравляющего вещества.
Цель работы – разработка и характеризация новых металл-аффинных сорбентов, содержащих лантан, для применения в фосфопротеомном анализе.
Задачи исследования:
Разработка и получение двух типов новых металл-аффинных сорбентов, содержащих ионы лантана.
Определение физико-химических и поверхностных свойств полученных сорбентов.
Определение сорбционных свойств полученных сорбентов.
- Исследование возможности их использования в фосфопротеомном анализе.
Научная новизна. Разработаны два новых сорбента, содержащих в составе
ионы лантана (III), определены их физико-химические свойства, показана их специфическая сорбционная способность по отношению к фосфорилированным пептидам: дисперсные частицы хромита лантана, полученные методом золь-гель синтеза, индуцированного микроволновым излучением; и коллапсированные монослои ди-стеарата лантана с одной лабильной валентностью (далее: монослой стеарата лантана). Для коллапсированных монослоев стеарата лантана разработана методика обогащения фосфонилированных пептидов: проведена оптимизация условий металл-аффинной хроматографии, исследована устойчивость сорбента, селективность адсорбции. Показана возможность селективного обогащения аддуктов зарина с сывороточным альбумином человека на коллапсированных монослоях стеарата лантана.
Реализация работы: Работа выполнена при поддержке проекта СПбГУ № 0.37.179.2014 и гранта президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ № НШ-2744.2014.3 Исследования проводились с использованием оборудования РЦ “Геомодель”, РЦ “Инновационные технологии композитных наномате-риалов”, РЦ “Рентген-дифракционные методы исследования” Научного парка СПбГУ.
Практическая значимость. Созданные металл-аффинные сорбенты могут быть использованы для решения задач фосфопротеомики в медицине, аналитической химии, биохимии и токсикологии.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 3 статьи в научных рецензируемых журналах и одни тезисы по материалам научно-практических конференций в рецензируемом сборнике тезисов.
Апробация работы. Результаты, полученные в ходе подготовки диссертационной работы докладывались и обсуждались на: всероссийской конференции с международным участием молодых ученых по химии «Менделеев-2014» (Санкт-Петербург, 2014); международной конференции «State-of-the-art Trends of Scientific Research of Artificial and Natural Nanoobjects» (Санкт-Петербург, 2016)
Положения, выносимые на защиту:
-
Регулярная мультимолекулярная структура на основе стеарата лантана, полученная по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующим коллапсированием без переноса на твердую подложку может быть использована в качестве металл-аффинного сорбента.
-
Золь-гель метод с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением, позволяет получать дисперсные частицы хромита лантана размером 80-100 нм и пористые агрегаты на их основе, которые могут быть использованы в качестве металл-аффинного сорбента.
-
Результаты исследования физико-химических свойств полученных сорбентов.
-
Методика элюирования 0,5% водный пиперидин с 0.015% добавкой ПФОСК позволяет значительно повысить извлечение фосфорилированных пептидов, сорбированных на коллапсированных монослоях на основе стеарата лантана, по сравнению с элюентами на основе, аммиака и ацетонитрила.
-
Результаты исследования процесса сорбции фосфорилированных пептидов и белка на полученных сорбентах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех разделов, заключения, списка литературы и приложения. Она изложена на 123 страницах и включает 44 рисунка, 5 таблиц, 107 наименований списка литературы и 1 приложение.
Аналитические методы определения ФОВ и продуктов воздействия ФОВ на организм
Наиболее ярко выраженным воздействием фосфорорганических веществ (ФОВ) на человеческий организм является ингибирование холинэстеразы - вещества, расщепляющего нейромедиатор ацетилхолин (АХ), передающий нервные импульсы в организме. К фосфорорганическим веществам с выраженным антихолинэстеразным эффектом относят боевые ФОВ, также называемые нервно-паралитическими газами, фосфорорганические пестициды и некоторое количество фосфорорганических лекарственных препаратов, обладающих обратимым эффектом. Боевые ФОВ в этом ряду являются наболее сильными токсикантами и могут воздействовать на человека практически при любой форме контакта: ингаляционно, перорально, через кожу. Некоторые ФОВ являются фосфорфторорганическими и тиофосфорорганическими веществами, однако качественно антихолинэстеразное воздействие обусловлено именно реакцией фосфорилирования, токсическое воздействие и общие способы лечения в случае отравления ФОВ одинаковы и эти вещества могут рассматриваться в общем контексте [18].
Нервно-паралитические отравляющие вещества – это жидкости при нормальных условиях. Высокая летучесть и хорошая растворимость в воде ФОВ серии G (табун, зарин, зоман) обеспечивает возможность военного применения при условии эффективного распыления. Серия V менее летуча и хуже растворима и может применяться для заражения почвы. VX и RVX обладают высокой липофильностью и легко проникает в организм через кожу [19]. Повышенной токсичностью боевые ФОВ обязаны связи углерод-фосфор, которой нет в фосфорорганических пестицидах [20]. Атом фосфора нервно-паралитических отравляющих веществ находится в оптически-активной позиции, различные энантиомеры имеют различную токсичность в зависимости от целевых ингибируемых энзимов [21].
ФОВ активно исследовались в Германии в 1930е годы концерном И. Г. Фарбер с целью использования в качестве пестицидов. Первым синтезированным соединением, обладающим мощным ярко выраженным нервно-паралитическим действием стал GA (табун), синтезированный Герхардом Шредером в 1936 году в процессе исследования диэтилфторфосфата. Табун – тривиальное название для этилового эфира диметиламида цианофосфорной кислоты. Внимание исследователей к этому классу ФОВ объясняется наличием у фосфора легко уходящей группы (-F, -CN). Как показали дальнейшие исследования, эта уходящая группа в организме человека ковалентно связывается с серином ацетилхолинэстеразы (АХЭ).
К концу второй мировой войны запасами боевых ФОВ обладали США и СССР, но первое применение в качестве отравляющего вещества произошло лишь во время военного конфликта 1988 года между Ираном и Ираком [18]. Синтез табуна проще, чем остальных боевых ФОВ, но и токсичность этого вещества много ниже, чем у иных нервно-паралитических отравляющих веществ, меньшее давление насыщенного пара и меньший период разложения под воздействием влаги из воздуха. Схожими характеристиками обладает диизопропилфторфосфат (DFP).
Разработанные позднее вещества GB (зарин), GD (зоман), GF (циклозарин), VX и RVX требуют значительно более сложного синтеза, но при этом значительно опаснее GA благодаря более высокой токсичности, химической устойчивости и, за исключением VX и RVX, более высокой летучести. Особенность зомана блокировать реактивацию АХЭ сделала это вещество основным боевым отравляющим веществом в СССР и США. Разработка отравляющих агентов VX и RVX обусловлена тем, что при ингибировании АХЭ в организме млекопитающего образуется избыток ацетилхолина, и для повышения сродства АХЭ к молекуле ФОВ был добавлен структурный элемент, схожий с нейротрансмиттером ацетилхолином. В США и СССР были независимо разработаны схожие по свойствам и структуре ФОВ VX и RVX соответственно. Существуют сведения, что на этом разработка боевых ФОВ не остановилась, и в недавнем прошлом были созданы новые вещества – фосфорорганические ингибиторы холинэстеразы, обладающие новыми, неизвестными особенностями [20].
Все рассматриваемые ФОВ являются антихолинэстеразами (АХЭ) и стимулируют накопление нейротрансмиттера ацетилхолина (АХ) в нервных синапсах путем фосфорилирования АХЭ и вызывают поражение как центральной, так и периферической нервной системы. В крови они необратимо присоединяются к АХЭ красных кровяных телец, а также к бутирилхолинэстеразе плазмы. Кровь и плазма зачастую являются буфером, который защищает органы и ткани организма от воздействия ФОВ. Реакция АХЭ с ФОВ эффективно препятствует реакции расщепления АХ, катализируемой АХЭ, состоящей во взаимодействии триптофана и глутамата АХЭ с четвертичным атомом азота АХ при одновременном взаимодействии аминокислот АХЭ на сложноэфирную группу АХ (рис 2) [22].
Исследование структурного звена монослоя стеарата лантана
Основные оксидные сорбенты для белков в настоящее время – это оксиды переходных металлов, алюминия, циркония, галлия. Наиболее широко исследованным из них является диоксид титана. Предложены способы его применения в гель-хроматографии [55], аффинной хроматографии в спиновых колонках [56] и даже непосредственное обогащение пептидов на мишени [57]. Однако, несмотря на широкую изученность, титан обладает рядом недостатков, которые требуют поиска более специфичных сорбентов, к которым можно отнести ионы лантаноидов.
К сожалению, чистый оксид лантана в качестве сорбента использоваться не может по причине быстрого гидролиза. Использование лантаноидов в качестве легирующих добавок в оксидные сорбенты усложняет как синтез, так и описание свойств, однако раскрывает огромные возможности для получения многофункциональных сорбентов. Одним из способов получения устойчивого к воздействию воды сорбента является синтез смешанных оксидов редкоземельных элементов с переходными металлами. В литературе описаны устойчивые ферраты, хромиты, манганиты лантаноидов [58], [59]. В случае легирования лантаном магнитных частиц оксида железа появляется возможность сорбции в объеме жидкости с последующим магнитным выделением сорбента с целевым веществом [60]. Кроме того, появляется возможность для разработки популярного в настоящее время метода целевой доставки адсорбированных лекарств методом ведения магнитным полем.
Однако, не только оксид железа может быть использован в качестве материала с высокой магнитной восприимчивостью, но и соединения на основе марганца, неодима и гадолиния. Перовскитоподобные редкоземельные манганиты обладают аномальными магнитными характеристиками [61] и при этом могут проявлять специфическую сорбцию к ФОВ ввиду наличия в структуре редкоземельных элементов.
Проблемой таких многокомпонентных соединений является вклад неспецифической сорбции, обусловленной ионами переходных металлов. Синтез core-shell частиц позволяет создать изолированное суперпарамагнитное ядро из Fe3O4 и покрыть поверхность таких частиц целевым соединением. В частности, описана структура, состоящая из магнитного ядра и аморфного слоя LaxSiyO5 на поверхности [62]. Ввиду физических ограничений решения для использования таких частиц, они должны обладать достаточно большим диаметром и малой пористостью, что понижает площадь поверхности, доступной для адсорбции.
Другими популярными матрицами для металл-оксидных сорбентов являются оксид алюминия и диоксид кремния. Инновационные синтетические подходы позволяют синтезировать мезопористые частицы, обладающие колоссальной удельной поверхностью. Если в случае с трехвалентным ионом алюминия замещение на трехвалентный ион редкоземельного элемента происходит изоструктурно, то сорбенты с диоксидом кремния создают в многостадийном процессе. Первой фазой синтеза является получение наночастиц-носителей из мезопористого кремния методом гидролиза тетраэтоксисилана. Процесс чувствителен ко многим факторам, таким как температура, давление, pH, состав растворителя, перемешивание. В синтезе используется поверхностно-активное вещество в концентрации, при которой в заданных условиях должны образовываться двумерные трубчатые мицеллы. Второй стадией является длительный отжиг, при котором удаляются стабилизатор и остатки тетраэтоксисилана. Затем методом реактивного осаждения из нитратов при высокой температуре на поверхность мезопористого кремнезема наносится слой целевого металл-аффинного сорбента. Этот процесс позволяет получить сорбент с большой площадью активной поверхности, однородно покрытой целевыми ионами [63, 64].
Оксидные соединения, содержащие лантан, могут быть получены и более простыми способами. Самый распространенный метод для твердых оксидных соединений – керамический синтез или спекание при высоких температурах в кислородной атмосфере. Этот способ позволяет получить поликристаллические образцы с размерами зерна от микрометра и выше. Для получения частиц меньшего размера используют методы осаждения из раствора, золь-гель синтез и метод микроволнового синтеза. Метод соосаждения, наиболее широко распространенный способ получения наночастиц, состоит в том, что при изменении pH или полярности растворителя начинается химическая реакция, которая приводит к образованию частиц и выпадению их в осадок. Так, в работах [65], [66] получен ряд сорбентов на основе оксида алюминия, не проявляющего специфической сорбции, содержащих ионы металлов Ti, Zr, Ce, La и позволяющие проводить анализ фосфонилированных пептидов методом МАЛДИ МС. В другой работе [67] показана возможность создания сорбентов на основе алюминия с ионами лантаноидов.
Использование золь-гель метода для соединений редкоземельных элементов в литературе описано, но ни одного упоминания о применении этого метода синтеза для получения сорбентов не отмечено. Метод заключается в том, что молекулы реагентов из жидкой фазы встраиваются в трехмерную органическую сетку, а затем, при отжиге, образуют связи между собой. Затем, при повышении температуры остается только целевое вещество. Получаемые таким способом частицы обладают огромной удельной поверхностью в сотни квадратных метров на грамм вещества, однако при термическом отжиге частицы укрупняются и площадь поверхности падает [68].
Качественный масс-спектрометрический анализ сорбционной способности стеарата лантана методом МАЛДИ МС
Было сделано предположение, что в присутствии полярного растворителя коллапсированные полислои могут расправляться и, соответственно, увеличивать эффективную поверхность, доступную для сорбции. Для проверки этого утверждения монослои на подложке обрабатывали ацетонитрилом и, для сравнения, гексаном. На рисунке 21 представлены результаты достаточно длительной обработки. При обработке гексаном структура поверхности практически не изменяется (рис. 21, а), остаются участки “рваных краев” (рис. 21, в), монослой не изменяется. В случае обработки ацетонитрилом края монослоев оплывают (рис. 21, б), на поверхности подложки возникают легкоплавкие структуры значительной толщины (рис. 21, г), на основании чего можно сделать вывод, что неполярные растворители практически не влияют на структуру, а полярные при длительной обработке приводят к её разрушению, что несколько ограничивает область применения сорбента на основе стеарата лантана.
Для всех исследованных образцов были записаны элементные спектры. Во всех случаях соотношение атомных количеств лантана и хлора составило 1:1, что служит еще одним доказательством существования лантана в виде дистеарата с одной лабильной валентностью.
Для синтеза хромита лантана был использован двухстадийный подход, в котором на первой стадии образуется аморфный золь, в котором равномерно распределены реагенты, а на второй стадии происходит самораспространяющаяся реакция, продуктом которой является искомое оксидное соединение. Тот факт, что реакция начинается в растворе, гарантирует равномерное распределение ионов хрома и лантана в промежуточном золе. Высокая скорость самораспространяющейся реакции разложения нитратов, как и большой объем выделяющегося газа, обеспечивает получение дисперсного пористого продукта и препятствуют росту кристаллов.
Синтез проводился из водных нитратов хрома и лантана. По уравнению были рассчитаны необходимые количества реактивов (пункт 2.2.9) Cr(NO3)3 9H2O + La(NO3)3 6H2O + 3(NH2)2CO LaCrO3 + 21H2O + 6N2O + 3CO2
Мощный локальный микроволновый нагрев реактора обеспечивает быстрое образование огромного количества зародышей и равномерное распределение оксидов металлов в них. Высокая скорость синтеза не допускает роста наночастиц до значительных размеров [106]. Однако, в результате сильного экзотермического эффекта дисперсные частицы спекаются в крупные агрегаты. Кроме того, неравномерный микроволновый нагрев приводит к тому, что у стенок реакционной ёмкости образуются области перегрева, приводящие к повышению степени окисления хрома. Побочный продукт легко удаляется при промывке. Эти агрегаты разрушали путем обработки полученного порошка ультразвуком. Площадь поверхности, измеренная по методике, описанной в пункте 2.2.12, составляет 15,5 м2/г, что немногим больше, чем для пленочного стеарата лантана.
Фазовый состав хромита лантана определен путем рентгенофазового анализа. Порошкограммы снимались на дифрактометре Bruker “D2 Phaser” (CuK, =1,5414). Определение фаз проведено с использованием базы дифракционных данных “Powder Diffraction File” (PDF). Дифрактограмма синтезированного порошка (рис. 22) однозначно соответствует
гексагональной фазе LaCrO3 и не содержит отражений примесей или непрореагировавших солей.
Объемное (а) и количественное (б) распределения по размерам: 1 - для агрегированных частиц; 2 - для частиц после обработки ультразвуком в течение 2 минут, 40 кГц, 40 кВ. По результатам измерений построены распределения частиц по размерам. Объемное распределение (рис. 23, а) нечувствительно в области малых значений, поскольку даже малое число больших частиц занимает большую долю общего объема образца. Наличие в распределении частиц размером в несколько сот микрон говорит, что в образце частицы слипаются. Тот же вывод можно сделать на основании резкого падения максимального значения размера на объемном распределении при разрушении агрегатов ультразвуком.
Количественное распределение (рис. 23, б) дает намного меньшее среднее значение и более узкие пики. На количественном распределении мало сказывается ультразвуковая обработка, из чего можно сделать вывод, что лишь небольшая часть частиц подверглась агрегированию при перегреве в ходе экзотермической последней стадии синтеза.
Средний размер частиц, полученных в ходе синтеза, взят из максимума количественного распределения. В качестве ориентировочного значения взяли максимум распределения после обработки ультразвуком 310 нм, так как в этом распределении значительно снижена доля агрегатов.
Сканирующая электронная микроскопия хромита лантана Метод лазерной дифракции дает распределение частиц по размерам, однако сами частицы в ходе синтеза могут принимать самые разные формы. Знание формы частиц необходимо в частности для того, чтобы подтвердить данные дифракции и показать справедливость применения теории Ми. Кроме того, были получены энергодисперсионные элементные спектры порошков.
Исследование возможности выделения методом металл-аффинной хроматографии аддуктов холинэстеразы с ФОВ
Как было показано на предыдущей стадии эксперимента с использованием метода АСМ (п. 2.3.3), сорбция и десорбция бычьего казеина при использовании в качестве сорбента монослоев стеарата лантана проходит в условиях классической металл-аффинной хроматографии. Однако, бутирилхолинэстераза, модифицированная ФОВ, по своей структуре отличается от казеина: во-первых, казеин имеет в своем составе значительное количество остатков фосфорной кислоты, в то время как информации о фосфорилировании бутирилхолинэстеразы нет, только в случае модификации остатком ФОВ появляется сайт фосфонилирования; во-вторых, в глобулах казеина фосфорные группы находятся на поверхности, а активный центр бутирилхолинэстеразы – в центре молекулы (в кармане). Поэтому, представлялось немаловажным исследовать возможность взаимодействия полноразмерной бутирилхолинэстеразы с сорбентом. Для исследования в качестве контроля использовали образец, содержащий бутирилхолинэстеразу лошади в нативной форме. Эксперимент провели по методике, описанной в п. 2.3.3, результаты представлены на рисунке 41, а, б. На микрофотографиях показано, что в условиях классической металл-аффинной хроматографии бутирилхолинэстераза успешно сорбируется и десорбируется с монослоев стеарата лантана. По всей видимости, в данном случае взаимодействие белка с металлом сорбента проходит через многочисленные кислороды серинов и тирозинов, содержащихся в молекуле белка. При использовании в качестве образца бутирилхолинэстеразы, модифицированной остатком RVx, десорбция в растворе аммиака не происходит (рис. 41, в, г). Особенно наглядно это показано в эксперименте с разрушением крупных агломератов белка путем инкубирования образца в додецилсульфате натрия/SDS (рис. 41, д, е).
Микрофотографии до десорбции и после практически идентичны. На основании проведенного эксперимента можно сделать вывод, что монослои стеарата лантана могут быть использованы для выделения полноразмерной бутирилхолинэстеразы из биологических образцов различной природы.
Исследование возможности выделения методом металл-аффинной хроматографии аддуктов холинэстераз с ФОВ проводили на примере триптического гидролизата бутирилхолинэстеразы лошади, модифицированной зоманом, с помощью разработанного сорбента на основе стеарата лантана. Выбор объекта исследования был обусловлен тем, что нонапептид бутирилхолинэстеразы человека, содержащий сайт фосфонилирования и образующийся в процессе пепсинолиза не дает сигнала при анализе методом МАЛДИ-МС, а триптический пептид – имеет слишком большую массу.
В то же время, триптический пептид бутирилхолинэстеразы лошади, содержащий серин-198, способный присоединять остаток зомана, имеет МН+ 2199.17 Да, что делает его удобным объектом исследования.
Полученный из НИИ ГПЭЧ ФМБА России образец триптического гидролизата бутирилхолинэстеразы лошади был проанализирован методом МАЛДИ-МС для поиска и идентификации аддуктов белка с зоманом. Стоит отметить, что концентрация бутирилхолинэстеразы составляла 0,1 мг/мл в пересчете на белок, что в 10 раз ниже, чем концентрация белка в экспериментах с сывороточным альбумином человека. Результаты представлены на рисунке 42. Как показано на рисунке, в масс-спектре наблюдаются сигналы соответствующие: 1 – нативному пептиду, содержащему серин-198 SVTLFGESAGAASVSLHLLSPR; 2 – пептиду, содержащему остаток зомана и имеющему разницу в массах с нативным в 162 Да SVTLFGESHPinacolylMPAAGAASVSLHLLSPR, где "PinacolylMPA" соответствует обозначению "GD"; 3 – пептиду, содержащему остаток метилфосфоновой кислоты (продукт старения остатка зомана) и имеющему разницу в массах с нативным в 78 Да SVTLFGESMPAAGAASVSLHLLSPR.
Для идентификации аддуктов был проведен МАЛДИ-МС-МС анализ. По отщеплению нейтральной частицы зомана (пинаколил) с получением состарившейся формы аддукта было полностью доказано наличие соответствующих модификаций у пептидов (рис. 43).
Так как в масс-спектре были обнаружены сигналы, соответствующие как состарившейся, так и несостарившейся формам аддуктов, было сделано предположение, что пептид, модифицированный остатком метилфосфоновой кислоты, может проявлять свойства, подобные фосфорилированным пептидам. Поэтому была добавлена стадия элюирования 0,5% водным пиперидином и лишь затем сорбент обрабатывали 70% водным ацетонитрилом с 0,1% ТФУ. После проведения металл-аффинной хроматографии элюаты анализировали методом МАЛДИ-МС, результаты представлены на рисунке 44.