Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Оптические свойства плазмонных материалов 12
1.1.1. Явление поверхностного плазмонного резонанса 12
1.1.2. Явление гигантского комбинационного рассеяния 19
1.1.3. Люминесцентные свойства 24
1.2. Методы синтеза плазмонных наноматериалов 27
1.2.1. Химические методы синтеза металлических наноструктур 28
1.2.2. Получение наночастиц с узким распределением по форме и размерам 34
1.2.3. Методы получения наноструктурированных плазмонных материалов на твердых подложках 40
1.3. Перспективные области применения плазмонных наноструктур в нефтегазовой отрасли и экологическом мониторинге 48
1.3.1. Диагностика конструкционных материалов 50
1.3.2. Обнаружение и идентификация микробиологических объектов 51
Выводы по главе 1 56
Глава 2. Экспериментальная часть. Объекты и методы исследования . 60
2.1. Синтез и изучение металлических наноструктурированных материалов 60
2.1.1. Синтез наночастиц золота многостадийным методом 60
2.1.2. Синтез наночастиц типа золотоеядро – серебряная оболочка 62
2.1.3. Синтез наночастиц в среде гуммиарабика 63
2.1.4. Синтез нанозвезд 64
2.1.5. Синтез наностержней золота 64
2.1.6. Синтез биметаллических наночастиц (для SERS) 65
2.1.7. Синтез ГКР субстрата на основе галлуазата 65
2.1.8. Методы изучения синтезированных наноструктур 66
2.2. Применение фтолюминесцентных наночастиц для селективного по размеру контратсирования субмикронных поверхностных дефектов 67
2.3. Исследование электрокинетических свойств металлических наночастиц методом горизонтального гель-электрофореза 70
2.4. Методы исследования спектров гигантского комбинационного рассеяния 72
Глава 3. Результаты и обсуждение экспериментальных исследований поверхностных дефектов методом лазерной сканирующей микроскопии с применением фотолюминесцентных наночастиц 76
3.1. Синтез фотолюминесцентных наночастиц 76
3.2. Селективное по размеру контрастирование дефектов фотлюминесцентными наночастицами 83
Выводы по главе 3 87
Глава 4. Результаты и обсуждение экспериментальных исследований ГКР активности наноструктурированных материалов 89
4.1. Выбор материала подложки для регистрации ГКР спектров 89
4.2. Создание твердых ГКР субстратов с использованием галлуазитной матрицы 91
4.3. Влияние морфологических особенностей плазмонных наночастиц на эффективность ГКР спектроскопии 94
4.4. Применение ГКР спектроскопии для идентификации топлив 100
Выводы по главе 4 102
Глава 5. Исследование электрокинетических свойств металлических наночастиц методом горизонтального гель-электрофореза 103
5.1. Метод горизонтального гель-электрофореза с расположением образцов наночастиц в виде двумерной матрицы 103
5.2. Расчет -потенциала и плотности прививки молекул модификатора 109
5.3. Спектральная регистрация электрофоретического разделения 114
Выводы по главе 5 116
Глава 6. Применение плазмонных наночастиц для ГКР спектроскопии микробиологических объектов 117
6.1. Определение условий регистрации спектров ГКР микробиологических объектов 117
6.2. Экспресс-спектроскопия ГКР бактерий 119
6.3. Комбинированный металл-керамический субстрат для ГКР
спектроскопии микробиологических объектов 121
Выводы по главе 6 126
Заключение 128
Список сокращений 130
Список использованной литературы 131
- Люминесцентные свойства
- Синтез наночастиц типа золотоеядро – серебряная оболочка
- Селективное по размеру контрастирование дефектов фотлюминесцентными наночастицами
- Влияние морфологических особенностей плазмонных наночастиц на эффективность ГКР спектроскопии
Люминесцентные свойства
Явление поверхностного плазмонного резонанса представляет собой возбуждение поверхностного плазмона на его резонансной частоте внешней электромагнитной волной. Плазмоны – это псевдочастицы, представляющие собой кванты колебаний электронного газа в проводящем материале. Электрическое поле электромагнитной световой волны смещает облако свободных электронов и создает нескомпенсированные заряды около поверхности частицы и соответствующие возвращающие силы, в результате чего электроны совершают когерентные колебания в осциллирующем внешнем поле, называемые поверхностным плазмоном (рисунок 1) [1]. В отличие от объемных плазмонов (колебания электронов проводимости внутри ионной решетки кристалла) поверхностные плазмоны представляют собой поверхностные электромагнитные волны, которые распространяются в направлении, параллельном границе раздела металл – диэлектрик (металл – вакуум), и сильно локализованы у границы раздела сред. В результате такие волны оказываются весьма чувствительными к любым изменениям граничных условий, например, к адсорбции молекул на поверхности металла. Это свойство поверхностных плазмонов позволяет использовать их для детектирования сверхмалых концентраций различных биохимических соединений [2].
Резонансное поглощение энергии света электронными колебаниями возникает при условии равенства вектора импульса поверхностного плазмона и проекции вектора импульса фотона на границу раздела сред [3]. Параметры первого из этих векторов зависят от свойств проводника и показателей преломления граничащих с ним сред, а второго – от частоты и угла падения света. Если выполняются условия резонанса, то интенсивность отраженного света резко уменьшается вследствие перехода части энергии световой волны в энергию плазмона. Еще одно условие эффективного возбуждения плазмона связано с поляризацией возбуждающего света. Колебания электронов в основном возбуждаются под действием электрической составляющей электромагнитной волны. Поэтому сильнее всего с электронами в проводящей пленке взаимодействует плоскополяризованная волна, у которой вектор электрического поля лежит в плоскости падения. Вектор магнитного поля в этом случае колеблется параллельно границе раздела. Такую волну называют p-поляризованной, -поляризованной, волной H-типа, TM-волной (Transverse Magnetic) [4, 5].
Взаимодействие электромагнитного излучения с металлическими частицами (размер частиц много меньше длины волны падающего излучения) [6]: а – сферическая частица, b – цилиндрическая частица. Первая количественная теория явления поверхностного плазмонного резонанса была описана Ми в статье 1908 года [7], которая объясняла красный цвет растворов золотых наночастиц. Теория основана на точном решении уравнений Максвелла для плоской световой электромагнитной волны, взаимодействующей с небольшой сферой, имеющей такую же макроскопическую зависящую от частоты диэлектрическую константу, как и у металла. Решение этой электродинамической проблемы с граничными условиями для сферы приводит к серии мультипольных колебаний для сечения экстинкции наночастиц. Используя разложение поля по парциальным волнам, можно получить известные выражения Ми для сечения поглощения и сечения рассеяния, которые применимы не только для сферических наночастиц размером гораздо меньше длины волны света (d ) , н о и д л я с ф е р произвольных размеров. Однако данная теория не описывает эффекты, связанные с несферической формой металлических наночастиц, таких как наносфероиды и наностержни. Оптические свойства таких наночастиц имеют более сложную природу, т.к. восстанавливающая сила, действующая на электроны проводимости, очень чувствительна к кривизне поверхности наночастицы. В результате, частота поверхностных плазмонов наночастиц сильно сдвигается с изменением формы наночастицы, делая форму наиболее важным фактором в определении длины волны спектральной линии плазмонного резонанса. Решение для несферических частиц, которое можно считать продолжением теории Ми, было предложено Уотерманом и называется методом Т-матрицы [8]. В случае сферических частиц все выражения метода Т-матрицы переходят в соответствующие выражения теории Ми.
Для эффективного возбуждения поверхностного плазмона частота света должна быть ниже собственной частоты колебаний электронов (плазмонной частоты), поскольку частота поверхностного плазмона примерно в 2 раз меньше, чем частота объемного плазмона, а частота локализованного поверхностного плазмона в 3 раз меньше частоты объемного плазмона [9, 10]. Плазмонная частота большинства металлов находится в ультрафиолетовой области, поэтому для возбуждения ППР в металлических наноматериалах используется свет с частотой видимого и ближнего инфракрасного диапазона спектра. В случае возникновения условий оптического резонанса поверхностных плазмонов и внешнего электромагнитного излучения в спектрах рассеяния и поглощения таких материалов появляется один или несколько пиков в видимой и ближней ИК областях.
Положение и количество пиков в спектрах плазмонных материалов зависят от природы металла, диэлектрических свойств среды, размеров и форм наноструктурированных материалов, что позволяет варьировать положение полосы ППР в широких пределах от видимой до ближней инфракрасной области путем изменения морфологии и размера частиц, создания их агрегатов и более сложных наноструктур, изменения диэлектрической проницаемости окружающей их среды [11]. Зависимость спектральных свойств от размера частиц проявляется в возрастании интенсивности полосы ППР с увеличением радиуса частицы. Наряду с усилением поглощения при увеличении размера плазмонных наночастиц наблюдается увеличение ширины и сдвиг максимума полосы ППР в длинноволновую область [12, 13].
Количество пиков в спектрах металлических наночастиц связано с характером систем разделенных зарядов при возбуждении плазмонов. В случае небольших сферических частиц падающая электромагнитная волна индуцирует образование диполя. Чем больше размер частицы, тем выше вероятность образования систем разделенных зарядов более высокого порядка — квадруполей и мультиполей. При этом в спектре возникают соответствующие дополнительные полосы ППР. Например, вклад квадруполей в суммарное поглощение света делается заметным, если размер частицы серебра превышает 50 нм, а при размере частицы 75 нм вклады дипольного и квадрупольного резонансов становятся равны. В спектре поглощения цилиндрических наночастиц присутствуют две полосы ППР, относящиеся к диполям, которые колеблются вдоль и поперек оси цилиндра, что соответствует продольному и поперечному плазмонам, соответственно (рисунок 1б).
Синтез наночастиц типа золотоеядро – серебряная оболочка
Для проведения реакции поверхностного модифицирования наночастиц отбирали в пробирки эппендорф по 1 мл раствора наночастиц золота в форме стержней, диспергированных в 0,1 M CTAB, центрифугировали 10 мин при 10000g, отбирали супернатант, добавляли 1 мл модифицирующего реагента и 0,1 мл универсальной буферной смеси с различным pH. Ресуспендировали наночастицы в полученном растворе и оставляли на 2 часа для завершения реакции. После этого осаждали наночастицы (10 мин при 10000 g), ресуспендировали в трис-боратном буферном растворе и вновь осаждали. К полученной пеллете добавляли 20 мкл глицерина и перемешивали. Схема эксперимента приведена на рисунке 10.
Аликвоты наночастиц золота после реакции поверхностного модифицирования концентрировали центрифугированием и смешивали с раствором ведущего электролита и глицерином для придания молекулам на поверхности наночастиц одинаковой конформации. Препарат наночастиц объемом 20 мкл загружали в лунки 1.0 % агарозного геля в ячейке для электрофореза. Образцы для удобства регистрации и интерпретации данных упорядочены таким образом, что в одной линии находятся наночастицы, модифицированные одним реагентом при различных pH, тогда как разные ряды содержат разные модификаторы. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 7.4 В/см в 2,5 мМ Трис-боратном электролитном буфере в течение 30 мин. Результаты эксперимента фиксировались в виде цифровой фотографии и обрабатывались алгоритмами программного обеспечения NIH ImageJ.
Спектры комбинационного рассеяния изучались с помощью спектрометра комбинационного рассеяния BWS415 (BWTEC, Германия). Образец размещался на позиционирующем XYZ-столике Thorlabs (США), регулировка положения фокуса лазера контролировалась с помощью USB-микроскопа Mikmed-2000R (Микромед, Санкт-Петербург, Россия). Диаметр лазерного пучка в точке фокусировки был минимизирован и составлял около 0,4 мм. Все измерения проводились в специально затемненной оптической лаборатории при отсутствии посторонних источников излучения (рисунок 11).
Спектры ГКР обрабатывались автоматически с помощью программного обеспечения Matlab (MathWorks Inc., USA). Спектры импортировались из программного обеспечения спетрометра в виде файлов с расширением .txt, в ПО Matlab вычитался фон флуоресценции, отфильтровывался высокочастотный шум, при помощи разработанных фильтров извлекались списки наиболее интенсивных сигналов и экспортировались обработанные данные в файлы Excel для визуализации и интерпретации. Конструкция фильтра была выполнена с использованием функции designfilt набора инструментальных средств цифровой обработки сигналов Matlab.
Исследования ГКР активности синтезированных наночастиц осуществляли путем сравнение классических спектров КР и ГКР спектров родамина 6Ж - флуоресцентного красителя, широко использующегося в исследованиях ГКР. Для регистрации ГКР спектра родамина 6Ж, аликвоту раствора красителя с концентрацией 10-5М и л и 1 0 -6М объемом 5 мкл помещали с помощью автоматического пипет-дозатора на алюминиевую фольгу и добавляли 5 мкл суспензии соответствующих наночастиц. При необходимости добавляли коагулирующий агент (0,1 М водный р-р HCl или 1 M водный р-р MgSO4). После смешения аналита и золя наночастиц перемещали объект на позиционирующий столик, фокусировали лазерное излучение на дне капли или в толще образца и регистрировали спектр.
Для создания ГКР-активных подложек, имитирующих бактериальные фильтры, алюминиевая фольга была покрыта суспензией галлуазита и высушена при 80С в течение трех часов, давая однородный слой галлуазита. Одну каплю 5 мкл бактериальной суспензии помещали на сформированный галлуазитный слой, таким образом имитируя фильтрацию бактериальной пробы. Подложку сушили на горячей плите 80С в течение 10 секунд, после чего 5 мкл дисперсии золотых нанозвезд помещали на слой бактериальных клеток или спор. Возбуждающее лазерное излучение было сфокусировано на дне капели, после чего регистрировались спектры КГР.
Селективное по размеру контрастирование дефектов фотлюминесцентными наночастицами
Как и следовало ожидать, при использовании субстратов без напыления и с платиновым покрытием не удалось зарегистрировать спектр ГКР. Концентрация свежеприготовленного водного раствора ПМБК была выбрана на уровне 10-5 М для прямого сравнения интенсивности ГКР сигналов от всех трех активных субстратов, как показано на рисунке 21. Факторы усиления для подложек с напылением золота, серебра и меди были 1.4107, 3.5106 и 3.5105, соответственно. В отличие от металлических наночастиц, факторы усиления ГКР субстратов уменьшаются в ряду Au Ag Cu, что может быть объяснено окислением поверхности серебра и меди. Металлические наночастицы синтезируются, как правило, путем восстановления солей металлов в растворе в присутствии стабилизатора, тогда как осажденная методом вакуумного напыления пленка металла не стабилизирована восстановителем или поверхностно-активными веществами и склонна к окислению на воздухе в случае серебра и, особенно, в случае меди.
К достоинствам твердых субстратов относится простота их использования и долгое время хранения. В отличие от коллоидных субстратов, изменяющих свойства уже через один-два месяца хранения при 4 С, активность твердых ГКР подложек сохраняется на протяжении более одного года. Кроме того, разработанные субстраты пригодны для исследования неводных систем, что характеризуется определенными затруднениями в случае классических водных суспензий наночастиц.
Достаточно высокие показатели усиления сигнала ГКР в совокупности с доступностью материалов и простотой изготовления определяют перспективность использования субстратов для регистрации ГКР-спектров различных аналитов. Однако стоит отметить, что данные субстраты по эффективности все же не могут сравниться с наиболее прогрессивными образцами ГКР-субстратов, описанными в литературе. Другой немаловажный аспект применения предложенного субстрата заключается в регистрации спектров непосредственно на границе контакта аналита и металлической пленки. В случае небольших молекул такой подход не создает принципиальных ограничения, тогда как при анализе крупных аналитов, например биомолекул или клеток, возможно проявление дискриминации определенных колебаний или полное экранирование сигнала. Таким образом, предложенный субстрат перспективен для обнаружения и исследования органических компонентов в достаточно низких концентрациях, что может найти применение в экологическом мониторинге, например, обнаружение некоторых экотоксикантов, таких как полициклические ароматические соединения и др.
Наиболее простым, но в то же время гибким и эффективным подходом для изучения спектров ГКР является применение суспензий наночастиц золота и серебра. Классические методы получения ГКР-активных субстратов заключаются в получении случайным образом восстановленных золей серебра или сферических наночастиц золота. Несмотря на относительно низкую воспроизводимость, наночастицы металлов активно используются ввиду высокой интенсивности получаемых спектров и относительной простоты их получения. Изменяя размеры и форму частиц, можно варьировать частоту и величину максимального усиления поля. При этом наночастицы металлов применимы для исследования как небольших органических молекул, так и микробиологических объектов.
Для сравнения эффективности усиления сигнала ГКР в зависимости от формы наночастиц были синтезированы наночастицы золота в форме сфер, стержней и звезд, а также предложен метод получения малоразмерных ГКР-активных биметаллических наночастиц золота и серебра с инициированием зародышеобразования in situ путем добавления боргидрида натрия.
Усиление сигнала КР изучалось по отношению к наиболее часто используемому модельному аналиту родамину 6Ж. Расчет факторов усиления ГКР осуществлялся по интенсивности пика деформационных колебаний ОН группы 1650 см"1 (рисунок 22д) по уравнению: i-Г ( SERS, 1650 R6G, твердый ) \-4SIR, 1650 R6G, растворе? где EF - кажущийся фактор усиление КР, ISERS, i65o - интенсивность полосы 1650 см"1 в спектре ГКР, CR6G, твердый - молярная концентрация родамина 6Ж в твердом состоянии (2,63 М), INR, i65o - интенсивность 1650 см"1 полосы в обычном спектре КР родамина 6Ж твердого и CшЖ, раствор - молярная концентрация родамина 6Ж в растворе в ходе эксперимента ГКР (2,3 10"5 М). Полученные факторы усиления сигнала ГКР были нормализованы к интенсивности поглощения возбуждающего излучения наночастицами. Синтезированные наночастицы имеют различные спектры в видимой-БИК областях, как показано на рисунке 22г: золотые наносферы и золотые наностержни имеют узкие пики экстинкции при длине волны 530 нм и 786 нм, соответственно, в то время как золотые нанозвезды имеют широкий пик при 635 нм. На длине волны 785 нм оптическая плотность синтезированных золотых наносфер, наностержней и нанозвезд составила 0,091, 2,703 и 0,840, соответственно. Рассчитанные коэффициенты кажущегося фактора усиления ГКР были разделены на значение поглощения наночастиц при длине волны 785 нм. Полученные факторы усиления (рисунке 22е) отражают доступность металлической поверхности наночастиц: молекулы ЦТАБ адсорбируются на поверхности наностержней, предотвращая адсорбцию родамина 6Ж и, таким образом, препятствуя усилению комбинационного рассеяния.
Принято считать, что ГКР активность наночастиц металлов связана с активными центрами - локальными максимумами электромагнитного поля вблизи изогнутой металлической поверхности или в области контактов частиц. В соответствии с этим, чем более анизотропны наночастицы, тем большую они должны иметь ГКР активность. Тем не менее, эта тенденция может быть нарушена отсутствием анализируемых компонентов в активных центрах, что зависит от природы молекул, уже адсорбированных на поверхности наночастиц. Золотые наносферы были стабилизированы избытком анионов цитрата и их побочных продуктов окисления (дикарбоксиацетон), в случае наностержней золота – молекулами ЦТАБ, в случае нанозвезд золота – продуктами окисления аскорбата. Кривизна поверхности наносфер золота мала, как можно видеть на рисунке 22a, так что основной вклад в их ГКР активность происходит от активных центров между частицами. Золотые наностержни и золотые нанозвезды имеют гораздо более острые участки поверхности стержневых или лучевых наконечников (рисунок 22б,в), из чего можно сделать предположение об их более высокой активности ГКР. Однако поверхность цитрат- и аскорбат-стабилизированных наночастиц является более доступной для адсорбции красителя, чем поверхность наностержней золота, покрытая двойным слоем молекул ЦТАБ, что отражается в значительно меньшем коэффициенте усиления КР при использовании наностержней
Влияние морфологических особенностей плазмонных наночастиц на эффективность ГКР спектроскопии
Бактерии представляют собой очень сложный объект для исследований методом спектроскопии ГКР, так как они характеризуются слабым сигналом комбинационного рассеивания. Для их детектирования без комбинационного микроскопа необходимо значительное увеличение плотности полезного сигнала с участка образца, экспонируемого лазерным излучением. При этом недопустимо существенно увеличивать плотность мощности лазерного излучения, поскольку бактерии, как и многие другие биологические объекты, могут легко подвергаться фотоинициированной деструкции. Для реализации подобного метода было предложено применение наиболее активных ГКР субстратов в сочетании с возможностью концентрирования биоаналита непосредственно на подложке для исследования спектров ГКР. Используемые ГКР субстраты должны обеспечивать максимально возможные значения усиления сигнала КР при выбранной длине волны лазерного излучения для обеспечения надежного обнаружения бактерий без дорогостоящих методов иммунохимического анализа при сохранении мощности возбуждения на низком уровне. Этот субстрат должен обладать высокой ГКР активностью с известной морфологией, позволяя проводить рутинные анализы по контролю качества с достаточной воспроизводимостью факторов усиления.
Так как биологические объекты в целом и бактерии в частности способны к автофлуоресценции, спектральные исследования микроорганизмов целесообразно проводить при возбуждении спектров в ближнем инфракрасном диапазоне, например, с помощью лазера с длиной волны 785 нм. Как уже отмечалось, для получения сигнала ГКР используемый наноматериал должен обладать поверхностным плазмонным резонансом, пик которого охватывает как длину волны возбуждения (785 нм), так и длины волн, на которых генерируется сигнал. В случае анализа биологических объектов наиболее информативной является область комбинационных сдвигов 400–2000 см-1. Таким образом, разрабатываемый наноматериал должен обладать поверхностным плазмонным резонансом в диапазоне длин волн от 785 нм до 932 нм.
Поскольку бактерии могут подвергаться фотоинициированной деструкции во время регистрации спектров комбинационного рассеяния, были изучены предельно возможные мощности лазерного излучения, не вызывающие деструкции аналита. Было обнаружено, что спектры ГКР E. coli начинают изменяться при плотности мощности приблизительно 300 мВт / мм2, поэтому плотность мощности лазера была снижена до 255 мВт / мм2 для всех дальнейших экспериментов. Регистрация спектров ГКР объектов с малым сечением комбинационного рассеяния, таких как бактериальные клетки и споры, при низкой плотности мощности возбуждающего излучения требует эффективной концентрации анализируемого вещества и наночастиц в точке фокуса лазерного пучка.
Исследование эффективности усиления сигнала КР различными коллоидными субстратами представлено в предыдущих главах. Для исследований были использованы нанозвезды золота с более доступной поверхностью и большим количеством активных центров. Дополнительно изменять спектральные свойства наночастиц, как уже отмечалось в главе 4, возможно с помощью их коагуляции, которая приводит не только к образованию активных центров, но и существенно изменяет спектры оптической плотности наночастиц.
Для регистрации спектров ГКР бактерий и спор с использованием портативного спектрометра комбинационного рассеяния были исследованы следующие подходы: 1) смешивание суспензии клеток и дисперсии наночастиц в капле с фокусировкой лазерного излучения в центре капли; 2) смешивание суспензии клеток и дисперсии наночастиц в капле, а затем сушка и фокусировка лазерного излучения на краю высушенной капли; 3) высушивание наночастиц с последующим нанесением на них капли бактериальной суспензии с фокусировкой лазерного излучения в нижней части капли; 4) высушивание бактерий с последующим нанесением на них капли дисперсии наночастиц с фокусировкой лазерного излучения в нижней части капли (рисунок 31). Все эти подходы не дали положительных результатов для наностержней золота. Наилучшие результаты были получены для золотых наносфер со вторым подходом, а также для золотых нанозвезд с последним подходом. Это различие может быть связано с концентрированием агрегатов бактерий и золотых наносфер на краю капли при высушивании за счет так называемого кольцевого эффекта (coffee-ring effect), в то время как более крупные золотые нанозвезды, содержащие агрегаты, выпадают в осадок быстрее, чем испаряется растворитель. Концентрирование биологического аналита за счет кольцевого эффекта считается перспективным для микроскопии биологических образцов из-за разделения частиц различного размера вблизи края испарения капли. Тем не менее, использование этого эффекта требует точной фокусировки на краю высушенной капли, что делает этот подход непригодным для быстрого автоматического обнаружения без микроскопа. В последствии регистрация ГКР спектров бактерий проводилась с использованием золотых нанозвезд в сочетании с последним подходом, менее требовательным в точности фокусирования.