Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 12
1.1. Биоапатит в кальцинированных тканях живых организмов 12
1.2. Структура и свойства гидроксиапатита как химического аналога биоапатита 14
1.3. Сравнительные коллоидно-химические свойства микро-, субмикрокристаллического и нанокристаллического гидроксиапатита 16
1.4. Требования к синтетическому гидроксиапатиту с точки зрения основных практических приложений
1.4.1. Применение гидроксиапатита как имплантата в различных областях медицины 18
1.4.2. Влияние коллоидно-химических характеристик гидроксиапатита на биорезорбируемость как важное требование к биоматериалам 20
1.4.3. Химическое модифицирование силикат-ионами как эффективный способ повышения биорезорбируемости гидроксиапатита 22
1.5. Коллоидно-химические аспекты синтеза нанокристаллического
гидроксиапатита, модифицированного силикат-ионами 24
1.5.1. Квопросу синтеза Si-ГАП 24
1.5.2. Коллоидно-химические особенности формирования Si-ГАП при осаждении из водных растворов 27
1.6. Особенности адсорбции белков на гидроксиапатитовых материалах 33
Выводы по литературному обзору 37
Глава 2. Методики синтеза и экспериментальные методы 39
2.1. Синтез нанокристаллического гидроксиапатита методом осаждения из
растворов 39
2.2. Рентгенофазовый анализ (РФА) 40
2.3. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) 41
2.4. Растровая электронная микроскопия (РЭМ) 41
2.5. Инфракрасная спектроскопия (ПК) 41
2.6. рН-метрия и кондуктометия растворов з
2.7. Определение величины дзета-потенциала 42
2.8. Определение распределения частиц по размерам 42
2.9. Определение удельной поверхности и пористости образцов методом БЭТ 2.10. Количественное определение кальция комплексонометрическим методом 43
2.11. Количественное определение фосфора спектрофотометрическим методом 43
2.12. Количественное определение кремния спектрофотометрическим методом 44
2.13. Количественное определение меди спектрофотометрическим методом... 44
2.14. Количественное определение альбумина биуретовым методом 45
2.15. Определение биорезорбируемости в различных модельных средах 45
2.16. Оценка биосовместимости исследуемых образцов «in vivo» 46
2.17. Определение сорбционных свойств образцов по отношению к меди 47
2.18. Определение сорбционных свойств образцов по отношению к альбумину
Глава 3. Результаты работы и их обсуждение 49
3.1. Теоретическое обоснование новых подходов к синтезу Si-ГАП 49
3.2. Исследование коллоидно-химических процессов, протекающих при формировании фазы Si-ГАП 52
3.3. Влияние параметров синтеза на структурно-морфологические коллоидно химические характеристики нанокристаллического Si-ГАП 62
3.4. Исследование коллоидно-химических свойств нанокристаллического Si ГАП 82
3.4.1. Определение гранулометрического состава образцов Si-ГАП 82
3.4.2. Особенности адсорбции белков на поверхности образцов Si-ГАП 84
3.4.3. Сорбционная способность Si-ГАП по отношению к тяжелым металлам на примере меди 91
3.5. Исследование медико-биологических свойств нанокристаллического Si ГАП 96
3.5.1. Определение биорезорбируемости образцов в модельных биологических средах 96
3.5.2. Оценка биосовместимости нанокристаллического Si-ГАП «in vivo»... 100 Выводы по главе 103
Глава 4. Производственная апробация нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита 108
4.1. Технологическая схема производства нанокристалличекого Si-ГАП 108
4.2. Выпуск и испытание опытно-промышленной партии продукции нанокристаллического Si-ГАП 113
4.3. Технико-экономические показатели новой продукции 118
Выводы по главе 121
Обшие выводы 122
Список литературы
- Сравнительные коллоидно-химические свойства микро-, субмикрокристаллического и нанокристаллического гидроксиапатита
- Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
- Исследование коллоидно-химических процессов, протекающих при формировании фазы Si-ГАП
- Технико-экономические показатели новой продукции
Введение к работе
Актуальность исследования. Одним из актуальных направлений научных исследований коллоидной химии является разработка коллоидно-химических принципов создания наноструктурированных систем и наноразмерных биоматериалов медицинского назначения.
Синтетический нанокристаллический гидроксиапатит (ГАП-
Саю(Р04)б(ОН)2) является кристалл охимическим аналогом минеральной составляющей костных тканей животных и людей. В силу сходства химического состава материалы на его основе находят широчайшее применение в различных областях медицины (стоматологии, ортопедии и хирургии) в виде керамики, цементов, композитов, имплантатов и т.д. Однако, последние результаты клинической апробации биоматериалов, полученных с использованием ГАП, показывают, что такие материалы, наряду с явными преимуществами обладают рядом недостатков: недостаточной скоростью биорезорбции in vivo, слабым стимулирующим воздействием на рост новой костной ткани (скорость остеоиндукции).
Одним из перспективных способов повышения биорезорбируемости и остеоиндукции биоматермалов на основе ГАП является химическое модифицирование гидроксиапатита биогенными элементами. Известно, что силикат-ионы являются естественной компонентой межтканевой жидкости. Кремний это жизненно важный микроэлемент для формирования кости и поддержания нормальной ее структуры, также он необходим для процесса минерализации костной ткани. Было установлено, что синтетические кальций-фосфатные биоматериалы, содержащие кремний в своих структурах, обладают повышенной биологической активностью по сравнению с незамещенным ГАП, способствуют улучшению пролиферации остеобластов, росту внеклеточного матрикса, а также ускорению минерализации костной ткани. В связи с этим, получение гидроксиапатита, модифицированного силикат-анионами, входит в научный круг интересов многих исследователей.
Управляемый синтез модифицированных гидроксиапатитов, в том числе и нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита (Si-ГАП) представляет собой сложную физико-химическую задачу. Считается, что не только химический состав, но и морфология, поверхностные особенности синтетических кристаллов гидроксиапатитов являются важными характеристиками, определяющими отклик организма на имплантируемые материалы. Кристаллическая структура, морфология и биорезорбируемость, а также коллоидно-химические свойства этих материалов в значительной степени зависят от метода получения. Однако большинство существующих методов синтеза не позволяет получить стабильный монофазный нанокристаллический кремнийсодержащий гидроксиапатит с заданными свойствами. Поэтому разработка коллоидно-химических основ получения монофазного нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита с регулируемой морфологией, стабильными коллоидно-химическими свойствами и биорезорбируемостью в настоящее время является актуальным направлением исследования.
Работа выполнена в рамках договора об условиях предоставления и использования субсидии на реализацию комплексного проекта по созданию высокотехнологичного производства, выполняемого с участием российского высшего учебного заведения № 13.G25.31.0006 от 07.09.2010г. «Биосовместимые композиционные и кальцийсо держащие остеопластические и лечебно-профилактические материалы для медицины».
Целью настоящего исследования является разработка коллоидно-химических основ получения нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита с заданным химическим составом и структурой, а также комплексное исследование коллоидно-химических свойств, обеспечивающих его применение как эффективного биоматериала медицинского назначения.
Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:
-разработать новый способ синтеза нанокристаллического
кремнийсодержащего гидроксиапатита с требуемыми структурно-морфологическими и коллоидно-химическими характеристиками;
установить влияние параметров синтеза на структурно-морфологические и коллоидно-химические характеристики Si-ГАП;
исследовать коллоидно-химические свойства продукта;
тестировать медико-биологические свойства продукта;
разработать технологию производства нанокристалического Si-ГАП;
- провести опытно-промышленную апробацию Si-ГАП.
Научная новизна работы:
Выявлены коллоидно-химические закономерности гомогенного осаждения нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита из водных растворов, а также описан механизм формирования фазы Si-ГАП, заключающийся в гидролизе тетраэтоксисилана, образовании промежуточных продуктов, таких как силикат кальция, фосфат кальция, гидроксиапатит и превращении их в фазу Si-ГАП;
Получены математические модели, позволяющие систематизировать влияние параметров синтеза на структурно-морфологические и коллоидно-химические характеристики нанокристаллического Si-ГАП;
Рассчитана кажущаяся энергия активации процесса роста кристаллов Si-ГАП, отмечено изменение формы кристаллов из игольчатой в сфероидальную при увеличении температуры синтеза от 60 С до 80 С;
Определена закономерность возрастания сорбционной активности Si-ГАП по отношению к меди (II) и альбумину при увеличении степени замещения фосфат-ионов силикат-ионами;
Разработана и апробирована новая методика определения биорезорбируемости, позволяющая достоверно моделировать процессы регенерации костной ткани в живом организме и корректно оценивать эффективность разрабатываемых кальций-фосфатных биоматериалов. Определено влияние степени замещения фосфат-ионов силикат-ионами на характер биорезорбируемости Si-ГАП.
Практическая значимость работы. Разработан и запатентован способ получения моно фазного нанокристаллического кремнийсодержащего
гидроксиапатита. Получены математические модели, позволяющие выбрать
параметры растворного синтеза и проводить направленно получение
высокодисперсных порошков Si-ГАП с кристаллами требуемого размера, формы
и химического состава. Предложенная методика определения
биорезорбируемости может быть рекомендована как адекватный прием
предварительного тестирования биоматериалов in vitro. Разработан
технологический регламент и организовано опытно-промышленное производство
нанокристаллического Si-ГАП с улучшенными физико-химическими
характеристиками. Результаты исследования биосовместимости,
биорезорбируемости и сорбционных свойств Si-ГАП подтверждают возможность использования их в качестве биоматериалов медицинского назначения.
Значимость результатов диссертации подтверждается внедрением технологии получения нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита как компонента остеопластических материалов для восстановления дефектов костных тканей на основе минерального сырья, профилактических биоматериалов и эндодонтических материалов для стоматологии на ЗАО «ОЭЗ «ВладМиВа», а также использованием их в учебном процессе НИУ «БелГУ» на кафедре общей химии при преподавании дисциплины «Общая, неорганическая и аналитическая химия» для студентов, обучающихся по направлению подготовки «Биохимия».
Методы исследований. В работе использованы современные физико-
химические методы исследований: рентгенофазовый и
микрорентгеноспектральный анализы, сканирующая и просвечивающая
электронная микроскопия, инфракрасная спектроскопия, лазерный анализ размера
частиц, низкотемпературная адсорбция азота (БЭТ), электрофорез,
спектрофотометрический метод и методы статистической обработки информации.
Основные положения работы, выносимые на защиту:
способ получения нанокристаллического кремнийсодержащего
гидроксиапатита;
результаты исследования коллоидно-химических процессов, протекающих при формировании фазы Si-ГАП методом осаждения из водных растворов;
выявленные закономерности влияния параметров синтеза на структурно-морфологические и коллоидно-химические характеристики нанокристаллического Si-ГАП;
методика определения биорезорбируемости;
зависимость резорбируемости и сорбционной способности образцов Si-ГАП от степени замещения фосфат-ионов силикат-ионами;
- технология производства нанокристаллического Si-ГАП медицинского
назначения.
Апробация результатов работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных всероссийских научно-практических конференциях «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов» (Томск, 2011, 2012, 2013, 2014); IV Международной научно-практической конференции «Экология - образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2011); Международной научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2012), III Международной научно-
практической конференции «Новые технологии создания и применения биокерамики в восстановительной медицине» (Томск, 2013), VII Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием по химии и нанотехнологиям «Менделеев-2013. Нанохимия и наноматериалы» (Санкт Петербург, 2013), Международной научно-технической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Высокие технологии в современной науке и технике» (Томск, 2014), Всероссийской научной конференции с международным участием «Сорбционные и ионообменные процессы в нано- и супрамолекулярной химии» (Белгород, 2014), а также представлены на Петербургской технической ярмарке и получена золотая медаль в номинации «Лучший инновационный проект в области индустрии наносистем» (Санкт-Петербург, 2012).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в
19 работах, в том числе 5 статей опубликованы в журналах, рекомендованных
ВАК РФ, 2 статьи в международных журналах, индексируемых в SCOPUS,
2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК Украины и Казахстана, 10 статей в сборниках трудов конференций и всероссийских журналах. Получен 1 патент.
Личный вклад автора. Автором проведен анализ литературных данных, определены цель и основные задачи работы. Все результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автором осуществлено обоснование методов и реализовано получение представленных в работе материалов, обоснованы и проведены экспериментальные методики по исследованию полученных образцов. Совместно с научным руководителем проведен анализ и интерпретация полученных результатов, сформулированы основные выводы и научные положения, выносимые на защиту.
Достоверность результатов работы основана на практическом внедрении в производство и учебный процесс, использовании современных экспериментальных методов исследования в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Диагностика структуры и свойств наноматериалов» (НИУ «БелГУ») и программного обеспечения при анализе полученных результатов, получении результатов, не противоречащих современным научным представлениям и закономерностям.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы из 179 наименований и 8 приложений. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включающего
20 таблиц, 49 рисунков.
Сравнительные коллоидно-химические свойства микро-, субмикрокристаллического и нанокристаллического гидроксиапатита
Кристаллическая структура ГАП принадлежит к кристаллографической группе Р6з/т гексагональной системы. Размеры элементарной ячейки ГАП по данным ICDD (International Centre for Diffraction Data) № 09-0432 составляют: a = b = 0,9418 им, с = 0,6884 нм. Однако эти параметры решетки изменяются при различных типах замещения. Например, замещение карбонатным ионом гидроксила в гидроксиапатите А-типа приводит к расширению элементарной ячейки вдоль оси а и небольшому сжатию вдоль оси с, в то время при замещении Б-типа наблюдается противоположный эффект [28, 29]. Изменения параметров кристаллической решетки часто приводят к изменению степени кристалличности, термической стабильности, морфологии, растворимости, и следовательно, влияют на коллоидно-химические и биологические свойства материала [30].
Важной характеристикой ГАП является стехиометрия его состава, которую принято выражать отношением Са/Р. Для объяснения отклонений от идеальной стехиометрии Са/Р = 1,67 состав ГАП записывают формулой Саю-х(НР04)х(Р04)б-х(ОН)2-х (1,5 Са/Р 1,67, т.е. 0 х 1). Переменный состав соединения вызван тем, что при синтезе ГАП в растворе присутствуют ионы НзО+ и НРО42", которые могут замещать соответственно ионы Са2+ и РО43" в кристаллической структуре гидроксилапатита. Наличие ионов гидроксония на месте гидроксильных групп в нестехиометрическом ГАП, так же, как и замещение гидрофосфат-ионами фосфатных групп, можно объяснить присутствием протона в положении Call [31]. Таким образом, важной с технологической точки зрения особенностью ГАП является подвижность химического состава и возможные отклонения от стехиометрии при сохранении кристаллической решетки и характерных химических свойств. Эта особенность ГАП лежит сегодня в основе современных методов модифицирования и широко используется при изготовлении порошков, композиционных и керамических материалов на его основе. Как правило, в качестве модифицирующих добавок выбирают соединения, содержащие элементы, входящие в состав естественной кости. Естественный ГАП содержит в своем составе К+, Na+, Mg2+, Zn2+, СО32", F", СГ, SCV", SiCV", поэтому в качестве модификаторов микроструктуры используют вещества, содержащие эти катионы и анионы.
Гидроксиапатит с частичным замещением ионов Са2+ катионами К+, Na+ и Mg2+ интенсивно исследуется, так как именно эти катионные замещения характерны для биоапатита костей и зубов [32-34].
Анионно-замещёнными апатитами, получившими сегодня наибольшее распространение в медицинской практике являются нанокристаллические гидроксиапатиты, модифицированные силикат- и карбонат-анионами [35].
Сравнительные коллоидно-химические свойства микро-, субмикрокристаллического и нанокристаллического гидроксиапатита
Несмотря на то, нанокристаллические структуры природных ортофосфатов кальция в костях и зубах были известны достаточно давно [6, 36-38], систематические исследования в этой области начались только в 90-е годы прошлого века.
Результаты исследований последних лет [39-40] показали, что нанокристаллический гидроксиапатит (НГАП) обладает уникальными коллоидно-химическими свойствами по сравнению с гидроксиапатитами микро- и субмикронного размера. Было установлено, что НГАП имеет более высокую шероховатость поверхности по сравнению с субмикрокристаллическим ГАП. Диаметр пор в наноразмерных компактах ГАП ( 6,6 А) в несколько раз меньше, чем в компактах из частиц ГАП субмикронного размера (-19,8 - 31,0 А) [41]. Шероховатость поверхности известна как важная характеристика, обеспечивающая эффективность остеобластов, в то время как пористая структура улучшает остеоиндукцию [42]. Было изучено межфазное взаимодействие между наноразмерными кристаллами ГАП и различными субстратами. Как оказалось прочность скрепления зависит не только от природы функциональных групп на подложке, но и от соотношения шероховатости поверхности между наноразмерными кристаллами и подложкой [43-44]. Сообщалось, что биокерамические материалы на основе ГАП микронного размера плохо спекаются в основном из-за малой удельной поверхности (обычно 2-5 м2/г), в то время как удельная поверхность нанокристаллических ГАП превышает 100 м2/г. Кроме того, было отмечено, что резорбция синтетических ГАП микронного размера существенно ниже, чем у биоапатита кости [45]. В сравнительном исследовании о влиянии включения частиц микроразмерных и наноразмерных частиц ГАП в поли-Ь-лактидную матрицу, показано, что добавление наноразмерного ГАП в большей степени оказывает влияние на термические, динамические и механические свойства [46]. Таким образом, наноструктурные биоматериалы превосходят по своим характеристикам микроразмерные, благодаря их чрезвычайно высокой удельной поверхности и специфическим химическим синергетическим эффектам.
Наноразмерные кристаллы ГАП должны также иметь улучшенную биологическую активность по сравнению с крупными кристаллами [47, 48]. Согласно многочисленным сообщениям частицы биоапатита в кальцинированных тканях имеют размеры в диапазоне от 2-5 до 200-600 нм, образуя строительные блоки нанометрового размера [6, 8, 9, 49]. Десятки и сотни кристаллов ГАП нанометровых размеров в коллагеновой матрице естественным путем объединяются в самоорганизующиеся структуры в процессе формирования костей и зубов, благодаря их лучшей способности специфически взаимодействовать с белками. Kim и соавторы показали, что остеобласты в НГАП/желатиновых биокомпозитах значительно более эффективны, чем в аналогичных биокомпозитах микрометрового размера [50].
По результатам гистологического анализа выявлена превосходная биосовместимость и остеоинтеграция костнозамещающего трансплантата в случае использования в биокомпозитах нанокристаллических ГАП [51-53]. Очевидно, что увеличение объемной доли межфазных границ частиц в случае НГАП приводит к улучшению адгезии остеобластов, пролиферации и минерализации.
Таким образом, биоматериалы из НГАП эмулируют иерархическую организацию кости, инициируют рост слоя апатита и создают условия для клеточной и тканевой реакции в процессе костного ремоделирования. Поэтому получение синтетического нанокристаллического гидроксиапатита в настоящее время является задачей востребованной с научной и практической точки зрения.
Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
Содержание фосфора в порошках гидроксиапатитов определяли спектрофотометрическим методом, который основан на взаимодействии фосфат-ионов в кислой среде с молибдат-ионом М0О42" и ванадат-ионом УОз" с образованием смешанной молибденованадофосфорной гетерополикислоты составом H4PVM011O40] оранжевого цвета [142]. Высушенную навеску 0,05г исследуемого образца, помещали в стакан вместимостью 50 см3. Добавляли в этот стакан 30 см3 дистиллированной воды и нагревали до 50-60 С. Затем прибавляли по капли концентрированного раствора HNO3 и перемешивали до полного растворения. Количество растворенного исследуемого образца переносили в мерную колбу на 50 см3, доводили до метки водой. Аликвоту 3 см3 исследуемого раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляли 20 см3 дистиллированной воды, 1 см3 концентрированной азотной кислоты, 5 см3 молибденованадиевого реагента, выдерживали 3—5 мин, разбавляли водой до метки и перемешивали. На спектрофотометре LEKI SS1104 (Финляндия) измеряли оптическую плотность при 420 нм в кювете толщиной 1 см относительно раствора холостого опыта, который готовили по той же методике, но без добавления раствора фосфора. Содержание фосфора рассчитали по градуировочному графику.
Спектрофотометрический метод определения кремния основан на образовании желтого кремнемолибденого комплекса, с последующим восстановлением этого соединения аскорбиновой кислоты до кремнемолибденовой сини и измерении оптической плотности окрашенного раствора [143]. Мешающее влияние фосфорномолибденового комплекса устранялось добавлением щавелевой кислоты. Измерение оптической плотности проб проводили на спектрофотометре LEKI SSI 104 (Финляндия) при длине волны 830 нм в кювете толщиной 1 см. По найденным значениям оптической плотности исследуемого раствора с учетом поправки контрольного опыта находили содержание кремния по градуировочному графику.
Метод основан на взаимодействии ионов двухвалентной меди с аммиаком в водном растворе с образованием аммиачного комплекса меди, окрашенного в сине-фиолетовый цвет [144]. Измерение оптической плотности проводилось на спектрофотометре LEKI SSI 104 (Финляндия) при длине волны 610 нм в кювете толщиной 1 см. По найденным значениям оптической плотности исследуемого раствора находили содержание меди по градуировочному графику. 2.14. Количественное определение альбумина биуретовым методом
Биуретовый метод определения белков - наиболее широко применяемый в настоящее время, основан на способности белков давать с раствором сульфата меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде [145]. Образовавшийся комплекс характеризуется высокой стабильностью. Для построения градуировочного графика из стандартного раствора альбумина готовили растворы белка, содержащие от 2 до 10 мг альбумина в 1 см3. В каждую пробирку, содержащую 1 см3 раствора белка соответствующего разведения, добавляли 4 см3 биуретового реактива, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 30 мин, после чего фотометрировали на спектрофотометре LEKI SS1104 при длине волны 540 нм в 1 см кювете. По полученным результатам строили градуировочный график зависимости оптической плотности растворов от концентрации белка. Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывали по градуировочному графику.
Биорезорбируемость исследуемых образцов оценивали по выходу кальция в модельный раствор через фиксированное время экспозиции. Выход кальция рассчитывали как отношение массы Са2+ в растворе к исходной массе кальция, содержащейся в исследуемом образце.
Оценка биорезорбируемости гидроксиапатитов была проведена в различных модельных средах: 1) в слабокислой среде (рН = 5,5; ацетатный буфер), для моделирования активной фазы резорбции материала остеокластами; 2) в растворе SBF [146] (Simulated Body Fluid) (рН = 7,4), для моделирования пассивной фазы резорбции материала в организме; 3) в растворе SBF, содержащем ЭДТА для моделирования процессов резорбции материала и образования новой кости.
Образцы массой 0,2 г помещали в ряд химических стаканов, содержащих по 50 см3 модельных растворов, и выдерживали 7-20 суток при 37 С в термостате ТСО-200. Через заданные промежутки времени определяли концентрацию кальция. В случае ацетатного буфера и раствора SBF (модельные растворы №1 и №2) концентрацию кальция в растворе определяли ионометрическим методом на иономере ИПЛ-113 при использовании кальций-селективного электрода «ЭКОНИКС Са» и хлорсеребряного электрода сравнения. В случае раствора SBF, содержащего ЭДТА, применяли метод обратного комплексонометрического титрования с помощью стандартных растворов ЭДТА и сульфата магния MgSC 4.
Для оценки биосовместимости исследуемых порошков ГАП использовали метод «Подкожной инокуляции» согласно требованиям ГОСТа Р ИСО 10993-6-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации». Опыты проводили на 18-ти беспородных лабораторных белых мышах (12 животных -опытные группы и 6 животных- ложно оперированные).
Материалы инокулировали под кожу в прослойку соединительной ткани, расположенную на спине подопытного животного. Перед инокуляцией материалов проводили следующие действия: животных наркотизировали парами эфира, область для имплантации обрабатывали антисептическим раствором, далее разрезали кожу подопытного животного, тупым рассечением делали один карман шириной 2 мм и глубиной 4 мм. В карман помещали один из образцов стоматологического материала, рану обрабатывали клеем «БФ-6». Животным контрольной группы оперативное вмешательство и все манипуляции осуществляли по схеме, используемой в работе с опытными группами, без внедрения образцов. Реакцию окружающих тканей на инокуляцию материалов оценивали через 7 дней после операции.
Гистологические препараты соединительных тканей зоны дефекта готовили общепринятыми методами. Оценивали следующие параметры: степень фиброза и воспаления; дегенерацию окружающих тканей; наличие некроза; степень интеграции материала имплантата с соединительной тканью инокуляционной зоны. Объем регенераторного процесса (в %) определяли при помощи сетки со 100 точками (81 квадрат = 100%), вставленной в окуляр стереомикроскопа Leica EZ4D. При помощи аппаратно - программного комплекса Видео-Тест-Размер (микроскоп Axioplan plus фирмы Zeiss) изучали гистологические препараты, окрашенные гематоксилинэозином.
Исследования проводились в научной исследовательской лаборатории «Физиология адаптационных процессов» НИУ "БелГУ" под руководством доктора биологических наук проф. Федоровой М.З.
Способность исследуемых образцов поглощать катионы меди (II) определяли путем построения изотерм сорбции методом переменных концентраций в статических условиях. Для этого готовили серию модельных растворов сульфата меди (II) с концентрациями от 0,01 - 0,08 моль/дм3. С целью предотвращения гидролиза модельные растворы подкисляли раствором серной кислоты. Навески образца массой 0,3 г заливали 25 см3 модельных растворов. Продолжительность экспозиции составляла 60 мин при периодическом перемешивании. По окончании процесса суспензии фильтровали. Остаточную концентрацию катионов меди в растворе определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 610 нм с использованием спектрофотометра LEKI SS1104 (Финляндия). Все эксперименты проводили при комнатной температуре (25 ± 2 С).
Исследование коллоидно-химических процессов, протекающих при формировании фазы Si-ГАП
В табл. 13 представлены значения предельной адсорбции Гмах и константы адсорбционного равновесия К получили из линеаризованного уравнения адсорбции Ленгмюра, описывающего зависимости С/Г от С. Коэффициенты корреляции (R2) при преобразовании изотерм сорбции в линейную форму составляют от 0,9994 до 0,9998, что указывает на хорошую линейную зависимость С/Г от С. Следовательно, адсорбция альбумина на ГАП и Si-ГАП хорошо описывается уравнением Ленгмюра. Таким образом, в рассмотренном интервале концентраций образуется монослой макромолекул альбумина на поверхности гидроксиапатитов. Белковый слой, образующийся на поверхности имплантата, играет исключительную роль в процессах, связанных с адгезией клеток. В частности, это касается тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов, остеобластов или остеокластов и микроорганизмов, от которых, зависит качество работы имплантируемого устройства [123].
Предельная адсорбция образцов составила от 119 мг/г до 167 мг/г. Причём, у кремнийсодержащих гидроксиапатитов эта величина выше, чем у немодифицированного ГАП. С ростом степени замещения фосфат-ионов силикат-ионами повышается адсорбционная способность порошков Si-ГАП по отношению к альбумину. Полученные данные хорошо коррелируют с величиной удельной поверхности, степенью кристалличности и пористостью образцов. Чем выше значения удельной поверхности и объема пор, тем лучше адсорбционные свойства данных образцов. Чем ниже степень кристалличности гидроксиапатитов, тем выше их скорости растворения, что приводит к значительному увеличению ионной силы раствора. Наши результаты хорошо согласуются с сообщением [168], где указывается, что более высокая ионная сила вызывает конформационные изменения в макромолекулах белков. Это, в свою очередь, увеличивает полярность их поверхности, что приводит к повышению скорости адсорбции белков на поверхности материалов. -Є—ГАП
Кинетика десорбции альбумина с поверхности образцов Si-ГАП На рис. 3.26 показан процесс десобрции альбумина с поверхности образцов ГАП и Si-ГАП в физрастворе (рН = 7,4). Отмечено, что в первые 24 ч инкубации 8 -15 % альбумина десорбировалось с порошков гидроксиапатитов. Но на вторые сутки наблюдали обратную сорбцию альбумина. В последующие сутки десорбция альбумина увеличилась и достигла стабильности на пятые сутки. После 10 суток наблюдали 35 - 50% десорбированного из инкубационных образцов альбумина. На образцах Si-ГАП скорость десорбции альбумина выше чем, на образцах ГАП. Скорость десорбции альбумина может быть прямо пропорциональна скорости резорбции образцов гидроксиапатитов, которая зависит от значения удельной поверхности.
Благодаря высокой сорбционной способности к белкам, помимо традиционных предложений в медицинской практике, Si-ГАП может успешно применяться в качестве хроматографических сорбентов для разделения белков и ДНК [169, 170]. 3.4.3. Сорбционная способность Si-ГАП по отношению к тяжелым металлам на примере меди
В силу сходства химического состава с костной тканью и высокой биосовместимостью, материалы на основе синтетических гидроксиапатитов в основном используют в биомедицинских областях для замены поврежденных твердых тканей. Однако в последние годы применение ГАП уже выходит за рамки биомедицины. В связи с высокой способностью к изоморфному замещению и сорбционной активностью в отношении тяжелых металлов и радионуклидов в последние годы ведутся интенсивные исследования по использованию синтетических гидроксиапатитов в качестве сорбентов для решения экологических проблем при очистке сточных вод, содержащих фториды и тяжелые металлы, для восстановления загрязненных почв [171].
Кроме того, согласно [172] широко используемый перорально сорбент на основе гидроксида алюминия для сорбции аллергенов из желудочно-кишечного тракта может быть успешно заменен на гидроксиапатиты как вещество, обладающее лучшей биосовместимосью с тканями организма. Перспективным представляется использование ГАП в качестве сорбента для выведения ионов тяжелых металлов из организма человека [173].
Известно, что некоторые тяжелые металлы (например, медь, селен, цинк), как микроэлементы, необходимы для поддержания процесса обмена веществ в человеческом организме. Тем не менее, при значительных концентрациях, они могут оказывать токсичное воздействие. Медь является веществом незаменимым в организме человека. Она участвует в создании многих важных для человека ферментов и белков, берет непосредственное участие в развитии клеток и тканей и т.д. Однако в больших дозах медь может вызвать анемию, повреждения печени и почек, и раздражения желудочно-кишечного тракта [174].
В связи с этим было проведено изучение новых возможностей применения нанокристаллического кремнийсодержащего гидроксиапатита в качестве сорбента для удаления тяжелых металлов, в частности меди.
Установление кинетики процесса является важным при изучении сорбционных характеристик материалов. Эксперимент проводили в статических условиях при температуре 25 ± 2 С. Продолжительность изотермической стадии составляла каждые 30 мин. в течение 3 часов. Полученные кинетические кривые представлены на рис. 3.27. Исходная концентрация раствора C11SO4 указанных экспериментах составляла 0,02 моль/дм3.
Полученные кинетические кривые сорбции ионов Си для немодифицированного ГАП и образцов Si-ГАП имеют практически идентичный вид. К шестидесятой минуте эксперимента наблюдается выход кинетических кривых на плато, что свидетельствует о достижении сорбционного равновесия. В дальнейшем сорбцию проводили на протяжении 60 мин.
Методом переменных концентраций получены изотермы сорбции меди на поверхности ГАП и Si-ГАП (рис. 3.28а), которые позволяют определить величины полной сорбционной емкости образцов по отношению к ионам меди с помощью уравнения Ленгмюра (3.9) и его линеаризованной формы (3.10):
Как видно из табл. 14 величины полной сорбционной емкости исследуемых образцов составляли от 28 мг/г до 81 мг/г. Сорбционная способность синтезированных порошков по отношению к меди (II) увеличивается с ростом степени замещения фосфат-ионов силикат-ионами. При этом наибольшую сорбционную активность проявляет Si2,o-rAIi, примерно в 2,5 раз выше, чем у немодифицированного гидроксиапатита. Образцы Sio,5An и Si oAII обладают практически одинаковой способностью поглощать ионы Си2+и уступают сорбционной способности образца Sii -rAII в -1,2 раза. Следует отметить, что коэффициенты корреляции (R2) при преобразовании сорбционных кривых в линейную форму составили 0,9936 - 0,9988, что указывает на хорошую линейную зависимость С/Г от С, следовательно, данный процесс сорбции успешно описывается уравнением Ленгмюра.
Механизмы сорбции тяжелых металлов гидроксиапатитами разнообразны и в основном представляют: катионообменный процесс; растворение поверхностного гидроксиапатита и образование новой фазы солей фосфатов; образование на поверхности ГАП комплексов; изоморфное замещение ионов кальция на ионы тяжелых металлов в структуре гидроксиапатита [175]. Предпосылкой возможности реализации механизмов катионного обмена и изоморфного замещения является то, что ионы кальция в кристаллической решетке Si-ГАП могут быть замещены на катионы двухвалентные металлов близкого радиуса, радиус иона Са2+ и Си2+ составляет 0,09 нм и 0,07 нм, соответственно [176]. В ходе исследования сорбции наблюдали, что по мере увеличения концентрации ионов меди количество ионов кальция, выделявшихся в раствор линейно возрастает (рис. 3. 29).
Технико-экономические показатели новой продукции
Заполнение реактора насыщенным раствором гидроксида кальция до заданного уровня производят с помощью самовсасывающего универсального насоса. После заполнения реактора насыщенным раствором гидроксида кальция включают верхнеприводную лопастную мешалку со скоростью вращения 50 об/мин. После чего начинают подачу ТЭОС в реактор при непрерывной работе верхнеприводной мешалки в течение 15-20 минут. Затем добавляют 20 % раствора ортофосфорной кислоты по каплям в реактор при непрерывном перемешивании со скоростью 2-4 мл/мин. После добавления всего количества раствора ортофосфорной кислоты рН должен находиться в пределах 11,0±0,5. При этом блокируется подача ортофосфорной кислоты, а работа перемешивающего устройства продолжается в течение 10-15 мин.
Для объемного дозирования раствора ортофосфорной кислоты и ТЭОС используется градуированная мерная емкость (дозатор). Объем градуированной мерной емкости - 1 л. Точность дозирования - 0,5 мл. Скорость подачи реагентов регулируется как в ручном режиме с помощью градуированной шкалы дозатора и крана, так и в режиме автоматического объемного дозирования.
Контроль за процессом синтеза осуществляется автоматически путем непрерывной регистрации значений рН в реакционном объеме. Для измерения рН используют стационарный промышленный рН-метром с погружными электродами.
При скорости подачи ортофосфорной кислоты 2-4 мл/мин и объеме раствора гидроксида кальция 50 л процесс синтеза длится 1-1,5 часа.
Водная дисперсия Si-ГАП, полученная в результате синтеза, транспортируется (переливается) в емкости для отстаивания через нижний разгрузочный патрубок сразу после завершения режима перемешивания. Продолжительность отстаивания - 24 часа.
После завершения отстаивания надосадочный водный слой сливается через боковой патрубок в канализацию. Верхний водный слой имеет рН 7,2-7,6, электропроводность не более 50 мкСм/см, что намного ниже предельно допустимого значения удельной электропроводности для дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72, т.е. сливные воды не требуют специальной утилизации.
Через нижний разгрузочный патрубок 1,5-2%-ная водная суспензия Si-ГАП общим объемом 10 л транспортируется (переливается) в приемную емкость.
Далее 1,5-2%-ная водная суспензия Si-ГАП направляется - а) на центрифугирование (концентрирование) для получения конечного продукта в форме водной суспензии 20 %-ной концентрации; - б) на высушивание в распылительной сушилке для получения продукта в форме дисперсного порошка.
Концентрирование продукта осуществляют методом центрифугирования в центрифуге ЦР 6-04 - «БФЛ». Для получения концентрированного водной суспензии исходный 2,0 % -ный водный Si-ГАП после созревания и отстаивания вручную помещают в пластиковые контейнеры емкостью 750 мл и устанавливают в ротор центрифуги. После чего закрывают крышку ротора, на пульте управления задают частоту вращения и продолжительность процесса.
После завершения процесса центрифугирования извлекают контейнеры и сливают надосадочную жидкость. Полученный водная суспензия Si-ГАП 20% -ой концентрации далее поступает на участок розлива во флаконы, водная суспензия Si-ГАП 5%-ой концентрации используется для получения дисперсного порошка.
Для получения дисперсного порошка Si-ГАП используется распылительная сушилка SD 1000 (EYELA Япония), которая одновременно высушивает и фракционирует продукт.
Водную суспензию Si-ГАП помещают в верхней части сушилки, на встроенной магнитной мешалке. Перемешивание водной суспензии позволяет твердым частичкам находиться в объёме жидкости. Водная суспензия Si-ГАП в систему подается по шлангам с помощью встроенного насоса. Параллельно с раствором Si-ГАП по параллельному каналу в рабочую камеру подается сжатым воздухом. В камере происходит распыление раствора через два сопла диаметром 0,7 мм. Время сушки составляет 15-20 мин во избежание воздействия высокой температуры на продукт. Готовый порошок Si-ГАП поступает в приемную емкость объемом 600 мл.
Наполнение флаконов дисперсным порошком Si-ГАП осуществляют с использованием ручного весового дозатора. Дисперсный порошок Si-ГАП при помощи весов делят на дозы. Кассету с флаконами устанавливают на стол ламинарного бокса и начинают наполнение флаконов, внося дозирующую насадку дозатора поочередно в каждый флакон. Каждый наполненный флакон вручную укупоривают резиновой пробкой. В каждую кассету вкладывают этикетку с указанием наименования препарата, номера серии, даты наполнения и передают на операцию закатки алюминиевыми колпачками. По окончании наполнения ручной весовой дозатор и все коммуникации промывают водой очищенной, дезинфицирующими растворами, ополаскивают водой очищенной и сушат спиртом этиловым 96 %.
В период с 27 октября 2014 г. по 14 ноября 2014 г. совместно с ЗАО «Опытно-экспериментальный завод «ВладМиВа», г. Белгород, были проведены работы по разработке опытно-промышленного регламента получения нанокристаллического кремнийсо держащего гидроксиапатита и выпуску опытно-промышленной партии продукции нанокристаллического Si-ГАП в форме геля (ЮООг) и в форме порошка (100г).
Образцы опытно-промышленной партии Si-ГАП были испытаны для проверки соответствия продукции техническим требованиям по ТУ 2148-002-02079230-2011. Испытание было проведено на технологической базе ЗАО «ОЭЗ «ВладМиВа» и в Центре коллективного пользования «Диагностика структуры и свойств наноматериалов» НИУ «БелГУ». Методики проведения испытания описаны в ТУ 2148-002-02079230-2011 (Приложение 8).