Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1.1. Строение белков 9
1.2. Химическая денатурация глобулярных белков 12
1.3. Образование комплексов белок/полиэлектролит в растворе 18
1.4. Поверхностные свойства растворов белков 23
1.5. Кинетика адсорбции белков 26
I. 6. Дилатационная поверхностная вязкоупругость растворов высокомолекулярных соединений 31
1.7. Применение дилатационной поверхностной реологии к растворам белков и их смесей с денатурантами различной химической природы 38
1.8. Поверхностные свойства растворов смесей белков и полисахаридов 43
Методы измерений и исследуемые растворы 47
II. 1. Измерение поверхностного натяжения 47
П.2. Измерение динамической поверхностной упругости 47
П.З. Эллипсометрические измерения 51
П.4. Исследование морфологии поверхностных пленок 55
П.5. Определение размеров наночастиц в водном растворе 57
П.6. Используемые реактивы 58
Динамические поверхностные свойства растворов смесей Р-казеин-ПНИПАМ...60 IV. CLASS Динамические поверхностные свойства растворов комплексов глобулярных белков и полиэлектролитов 68 CLASS
IV. 1. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПДАДМАХ 68
IV.2. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПСС ...76
IV. 3. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов лизоцим/ПСС 84
IV. 4. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов лизоцим/ПДАДМАХ 90 V. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов глобулярный белок/полиэлектролит 97
VI. Кинетика адсорбции комплексов глобулярный белок/полиэлектролит 106
VII. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов фибриноген/полиэлектролит 109
VII. 1. Динамические поверхностные свойства фибриногена 109
VII.2. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов фибриноген/ПСС 111
VII.3. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов фибриноген/ПДАДМАХ 115
Выводы 123
Литература
- Образование комплексов белок/полиэлектролит в растворе
- Применение дилатационной поверхностной реологии к растворам белков и их смесей с денатурантами различной химической природы
- Определение размеров наночастиц в водном растворе
- Динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПСС
Введение к работе
Актуальность работы. Исследование взаимодействия белков и полиэлектролитов в растворах представляет важную задачу как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения. Подбирая компоненты и меняя их концентрации можно получить широкий набор систем с различными свойствами. Разнообразие комплексов белков и полиэлектролитов в растворе обуславливает широкий круг практических применений этих систем используемых в качестве биокатализаторов, бисенсоров, для разделения и очистки белков, направленной доставки лекарств. В большинстве работ по растворам комплексов белков и полиэлектролитов исследуются объемные фазы. Информация о поверхностных свойствах растворов смесей белок-полиэлектролит в литературе практически отсутствует. В то же время изучение конформационных переходов белковых глобул на границе раздела флюидных фаз в присутствии полиэлектролита представляется важным по нескольким причинам. Во-первых, при практическом применении смесей белков и полиэлектролитов обычно приходится сталкиваться с дисперсиями и тонкими пленками, устойчивость и динамика которых определяются поверхностными реологическими свойствами, и, следовательно, конформацией макромолекул у межфазной границы. Во-вторых, большинство биохимических процессов в клетке происходит у клеточных мембран. Поэтому особое значение приобретает изучение конформационных переходов белковых молекул в адсорбционных и нанесенных поверхностных пленках. Поскольку биологические функции белков во многом определяются их структурой, исследование химических взаимодействий и физико-химических процессов, приводящих к изменению вторичной и третичной структур белка у межфазной границы, представляет одну из важных задач современной коллоидной химии.
Цель работы состоит в определении механизма формирования адсорбционной пленки из растворов смеси белок - полиэлектролит на границе раствор - газ и оценки влияния на этот процесс денатурирующих агентов на основе данных дилатационной поверхностной реологии.
Для достижения этой цели в диссертации решались следующие основные задачи:
Исследование совместной адсорбции амфифильного неионного полимера и белка на границе жидкость - газ.
Определение морфологии адсорбционных слоев амфифильного неионного полимера и белка с помощью атомно-силовой микроскопии
Определение концентрационных и кинетических зависимостей комплексной динамической поверхностной упругости и поверхностного натяжения растворов смеси белков и полиэлектролитов методами осциллирующего барьера и осциллирующего кольца.
Определение кинетических зависимостей поверхностной концентрации растворов смеси глобулярных белков и полиэлектролитов с помощью эллипсометрии.
Определение морфологии адсорбционных слоев глобулярных белков в присутствии полиэлектролитов с помощью атомно-силовой микроскопии.
Определение влияния денатурантов на кинетические и концентрационные зависимости поверхностных свойств растворов смеси глобулярных белков и полиэлектролитов.
Сравнение результатов расчета кинетической зависимости поверхностной концентрации с экспериментальными данными для растворов комплексов белок/полиэлектролит и определение эффективного заряда комплекса.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние синтетических полиэлектролитов на третичную структуру белков в поверхностном слое и механизм формирования адсорбционного слоя комплексов белок/полиэлектролит на границе водный раствор - воздух. Обнаружено, что хотя комплексы могут образовываться в объеме раствора в случае одноименно заряженных компонентов, разрушение третичной структуры в поверхностном слое происходит только тогда, когда белок и полиэлектролит противоположно заряжены. Показано, что скорость адсорбции комплексов белок/полиэлектролит определяется их суммарным зарядом и зависит от образования мультимолекулярных агрегатов в растворе. Установлено, что различие в механизме денатурирующего действия между гидрохлоридом гуанидина (ГХГ) и мочевиной приводит к различным эффектам при взаимодействии этих веществ с комплексами лизоцим/полистиролсульфонат натрия (ПСС) в поверхностном слое, в частности, в первом случае возникает сильный синергетический эффект, отсутствующий при взаимодействии этих комплексов с мочевиной. Сравнение расчетных и экспериментальных кинетических зависимостей поверхностной концентрации избытка позволило оценить эффективную величину заряда адсорбирующегося глобулярного комплекса ПСС/бычий сывороточный альбумин (БСА).
Практическая значимость работы Информация о взаимодействии белков и полиэлектролитов в поверхностном слое, о структуре адсорбционной пленки белок/полиэлектролит должна способствовать пониманию функционирования белков в живых организмах, а также может быть использована при создании биосенсоров, для развития и оптимизации новых методов доставки лекарств в живом организме, методов разделения и очистки белков. Изменение внешних условий и подбор компонентов позволяет широко варьировать не только физико-химические свойства таких систем, но и влиять на вторичную и третичную структуры молекулы белка, изменяя ее биологическую активность, что может найти применение при создании новых биотехнологий. Данные по поверхностным реологическим свойствам позволяют найти оптимальные условия для стабилизации пен и эмульсий, содержащих белки и используемых в пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 10 тезисов докладов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде докладов на следующих научных мероприятиях: Всероссийском симпозиуме «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011), V Всероссийской конференции «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011), VI Всероссийской конференции «Менделеев 2012» (Санкт-Петербург, 2012), VII Всероссийской конференции «Менделеев - 2013» (Санкт-Петербург, 2013), 14th European Student Colloid Conference (Потсдам, 2013), XIX international conference on chemical thermodynamics in Russia (Москва, 2014), IV International Conference on colloid chemistry and physicochemical mechanics (Москва, 2013), VIII Всероссийской конференции «Менделеев -2014» (Санкт-Петербург,2014), 8th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, 2014), 20th International Symposium on Surfactants in Solution (Коимбра, 2014).
Положения и результаты, выносимые на защиту:
-
Обнаружение трех локальных максимумов на кинетической зависимости динамической поверхностной упругости растворов смеси поли(1М-изопропилакриламида) (ПНИПАМ) с Р-казеином и их интерпретация.
-
Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси белков с полистиролсульфонатом натрия (ПСС) и хлоридом полидиаллилдиметиламмония (ПДАДМАХ) при различных рН.
-
Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси белков с ПСС и ПДАДМАХ в присутствии денатурантов,
-
Синергетическое действие ПСС и ГХГ на динамические свойства адсорбционной пленки лизоцима.
-
Механизм формирования адсорбционных пленок в растворах смеси белков и полиэлектролитов в присутствии и отсутствии денатуранта.
-
Определение влияния структурной организации белка на механизм взаимодействия с полиэлектролитом в поверхностном слое.
Личный вклад автора. Авторский вклад состоит в постановке основных задач, непосредственном выполнении экспериментальных исследований, в обработке полученных результатов, анализе и обобщении полученных данных и формулировке выводов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа объемом 140 страниц машинописного текста состоит из введения, семи разделов, содержащих 64 рисунка и 1 таблицу, выводов и списка литературы, включающего 207 наименований.
Образование комплексов белок/полиэлектролит в растворе
Белки представляют один из важнейших классов природных высокомолекулярных соединений и имеют огромное значение для функционирования живых организмов. Белки участвуют в обменных процессах, являются строительным материалом живой клетки, играют роль биокатализаторов, выполняют сигнальную функцию, участвуют в формировании иммунного ответа.
Возможность реализации столь различных по своему характеру функций связана, прежде всего, с особенностями пространственного строения молекул белков, которое в зависимости от последовательности одних и тех же аминокислотных остатков может быть весьма разнообразным [42].
Молекулы белков состоят из одной или нескольких полипептидных цепей, построенных из аминокислотных остатков. Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепи называют первичной структурой.
На основе данных рентгеноструктурного анализа Полингом были определены наиболее устойчивые конформации полипептидной цепи - а-спирали и складчатые Р-слои [43]. Данные конформации полипептидной цепи представляют элементы вторичной структуры белка и стабилизируются за счет водородных связей. В а-спирали группа С=0- одной пептидной связи образует водородную связь с группой N-H- другой пептидной связи, отстоящей от первой на четыре аминокислотных остатка. В Р-листах полипептидная цепь находится в растянутом состоянии, а ее С=0- и N-H- группы связаны водородными связями с такими же группами соседней, параллельно ориентированной полипептидной цепи, а-спирали и Р-листы перемежаются неупорядоченными участками, в которых белковая цепь обладает значительной гибкостью [44].
Наличие гибких участков позволяет белковой Молекуле сворачиваться в глобулу, приобретая определенную пространственную третичную структуру. Именно эта структура оказывается биологически функциональной. Такая укладка полипептидной цепи стабилизируется как сильными взаимодействиями за счет образования дисульфидных мостиков между остатками цистеина, так и более слабыми взаимодействиями - электростатическими, ван-дер-ваальсовыми, водородными связями и, прежде всего, гидрофобными. Глобулярные белки функционируют в водном окружении, в большой степени влияющем на их конформацию. Среди аминокислотных остатков белка имеются как полярные, так и неполярные, как гидрофильные, так и гидрофобные. Поскольку белковая цепь обладает некоторой гибкостью, она может свернуться в глобулу таким образом, чтобы гидрофобные участки преимущественно контактировали друг с другом, а не с водой. Тогда центральная область глобулы оказывается гидрофобной, а внешняя поверхность гидрофильной [45].
В ряде случаев белок обладает четвертичной структурой - молекула белка или надмолекулярная белковая система состоит из некоторого числа глобул, соединенных нековалентными связями. Так лизоцим при высоких концентрациях ( 1 масс. %) существует в виде димеров или более крупных олигомеров [46].
В структуре белков, образованных несколькими полипептидными цепями зачастую можно выделить несколько относительно самостоятельных участков, сходных по своим свойствам с глобулярными белками, соединенными малоструктурированными полипептидными участками [47]. Такие независимые фрагменты называют доменами. Количество доменов в разных белках может заметно отличаться. Лизоцим и бычий сывороточный альбумин содержат два и три домена соответственно, в молекуле фибриногена внутри трех главных доменов можно выделить как минимум еще 12 компактных структур [48].
Характер структуры на каждом уровне организации определяется геометрическими свойствами структур предыдущего уровня, силами взаимодействия их элементов и взаимодействием с окружающей средой.
Исследованные в данной работе белки существенно отличаются по своему строению, структуре и стабильности. Лизоцим и БСА - типичные глобулярные белки. Лизоцим был обнаружен во многих тканях и жидкостях живых организмов, где он выполняет функции неспецифического антибактериального агента. Наиболее распространенным является лизоцим яичного белка. Его молекулярная масса 14300 а.е.м. Он состоит из 129 аминокислот, около 42% полипептидной цепи находится в форме а-спиралей . Третичная структура представляет собой плотно упакованную глобулу, форма которой близка к форме эллипсоида с тремя характеристическими длинами: 4,5 3 3 нм [49]. Жесткая трехмерная конформация поддерживается с помощью четырех дисульфидных связей и гидрофобных взаимодействий [50]. Изоэлектрическая точка лизоцима лежит в щелочной области (рІ 10.5-11), в водном растворе при рН=7 его заряд равен +8. Заряженные функциональные группы в основном изолированы друг от друга и неравномерно распределены по глобуле. Значительное их число расположено в районе щели - наиболее гидрофильной области молекулы. Наиболее гидрофобная область лежит на противоположной щели стороне глобулы. Белок обладает высокой стабильностью и может выдерживать кратковременное кипячение без необратимой денатурации [51].
БСА менее устойчив, чем лизоцимом, однако также может выдерживать довольно длительное нагревание - до 10 часов при температуре 60С [52]. БСА - один из самых распространенных белков крови и выполняет транспортную функцию. Глобула БСА имеет сердцевидную форму с размерами главных осей 1,7 4,2 нм при нейтральном рН и претерпевает несколько обратимых конформационных переходов с увеличением кислотности среды [53,54]. По сравнению с лизоцимом, БСА крупнее: молекула состоит из 580 аминокислотных остатков, молярная масса составляет 66700 а.е.м. Основными элементами вторичной структуры выступают а-спирали, стабилизированные 17 дисульфидными мостиками и содержащие 67% процентов аминокислотных остатков. В отличие от лизоцима, изоэлектрическая точка БСА лежит в кислой области (-4,8-5,4), и в растворе при нейтральном рН молекула имеет заряд -18 [52]. Заряженные участки распределены неравномерно вдоль поверхности глобулы: наибольшее количество отрицательно заряженных групп сосредоточено в домене, образованном N-терминальным концом молкулы, а положительных - в домене, образованном С-терминальным концом молекулы [52,55].
Также как и БСА, фибриноген - белок плазмы крови, участвующий в процессе ее сворачивания, однако его строение существенно отличается от строения БСА и лизоцима, рассмотренного выше. Фибриноген представляет сложный мультидоменный белок, в котором можно выделить три основных домена: центральный Е-домен и два боковых D-домена, соединенные а-спиральными участками. D и Е-домены образованы двумя наборами из трех полипептидных цепей (Аа, В3 и X), соединенных 29 дисульфидными мостиками. N-концы полипептидных цепей образуют Е-домен, в то время как С-концевые части Вр и X цепей образуют D-домены [48]. С-концевые участки Аа цепей образуют компактные аС-домены, соединенные с основной частью молекулы с помощью гибких а-спиральных участков [56]. Молекулярная масса фибриногена максимальна среди исследуемых в диссертационной работе белков (340 000 а.е.м) и размеры глобулы составляют 9 4,75 6 нм [57]. При нейтральном рН фибриноген заряжен отрицательно (суммарный заряд -10, р1 5-5.4), наибольшая доля отрицательного заряда сосредоточена на Е и D-доменах, в то время как аС-домены заряжены положительно. Было показано, что Е и D- домены являются более гидрофобными по сравнению с аС-доменами[58].
Р-казеин составляет основную долю белка в молоке. В отличие от рассмотренных ранее белков он не имеет третичной структуры, а его вторичная структура выражена очень слабо [59]. В водных растворах Р-казеин не образует компактных глобул и представляет гибкую неупорядоченную макромолекулу. Молекула Р-казеина состоит из 209 аминокислотных остатков, его молекулярная масса составляет 24000 а.е.м [60]. Также как БСА и фибриноген, Р-казеин при нейтральном рН заряжен отрицательно -общий заряд молекулы около -30, распределение заряда по цепочке неравномерно -большую часть отрицательного заряда (примерно -20) несут первые пятьдесят аминокислотных остатков [61].
Применение дилатационной поверхностной реологии к растворам белков и их смесей с денатурантами различной химической природы
В отличие от поверхностного натяжения реологические поверхностные свойства растворов неионных полимеров оказываются немонотонными функциями концентрации и возраста поверхности, а также зависят от молекулярной массы исследуемого полимера.
Появление локального максимума на концентрационных и кинетических зависимостях действительной части модуля поверхностной упругости можно связать с возникновением в адсорбционной полимерной плёнке нового механизма релаксации. В области низких концентраций макромолекулы принимают практически двумерную конформацию на поверхности. В этом случае поверхностная упругость растет по мере увеличения поверхностной концентрации. При достижении некоторой критической поверхностной концентрации начинает формироваться область петель и хвостов полимерных цепей, простирающихся вглубь объёмной фазы. Тогда релаксация поверхностных напряжений может происходить за счёт обмена сегментами между различными зонами поверхностного слоя, и поверхностная упругость начинает уменьшаться. Подобные локальные максимумы можно наблюдать на кинетических зависимостях поверхностной упругости растворов полимеров с достаточно высокой молекулярной массой [36,37,168]. Рассмотренный механизм адсорбции подтверждается кинетическими исследованиями толщины адсорбционной плёнки и величины адсорбции [168]. На первой стадии быстрый рост поверхностной концентрации протекает при постоянстве толщины пленки, что отвечает формированию ближней области поверхностного слоя, а более медленная стадия увеличения толщины плёнки при почти постоянной величине адсорбции соответствует образованию области петель и хвостов.
Поверхностная активность большинства исследованных полиэлектролитов проявляется только в области концентрированных растворов ( 1 % масс), когда увеличение ионной силы раствора приводит к экранированию сил электростатического отталкивания макромолекул от одноименно заряженной межфазной границы. В этом случае динамическая поверхностная упругость монотонно возрастает в ходе адсорбции, достигая высоких значений [177,178]. Монотонный характер кинетических зависимостей поверхностной упругости указывает на то, что образования дальней области поверхностного слоя не происходит. Это также подтверждается данными нейтронной рефлектометрии [179]. Однако при значительном увеличении ионной силы раствора в результате, например, добавления неорганической соли, влияние электростатических взаимодействий заметно снижается, и на кинетических зависимостях поверхностной упругости для растворов некоторых полиэлектролитов появляется локальный максимум [178]. Для растворов ПСС увеличение ионной силы не привело к изменению характера кинетической зависимости поверхностной упругости [177], хотя формирование дальней области поверхностного слоя было зафиксировано методом отражения нейтронов [179]. В этом случае сильное гидрофобное взаимодействие между полистирольными цепями на поверхности, по-видимому, приводит к образованию жёсткой гетерогенной двумерной структуры, препятствующей образованию обмену сегментами между различными зонами поверхностного слоя.
Применение дилатационной поверхностной реологии к растворам белков и их смесей с денатурантами различной химической природы
Среди растворов методы дилатационной поверхностной реологии, по-видимому, наиболее часто применялись к растворам Р-казеина [54,138,180-191]. Важной особенностью дилатационных свойств адсорбционных и нанесенных слоев Р-казеина оказывается немонотонная зависимость динамической поверхностной упругости от поверхностного давления и концентрации. Различные авторы обнаруживали один [182-184] или два [138,188,190] локальных максимума на соответствующих экспериментальных зависимостях.
Первый максимум поверхностной упругости при поверхностном давлении около 6 мН/м связывается большинством авторов с образованием петель и хвостов в поверхностном слое [41,138,181-186,188,192]. Объяснение второго максимума представляется более сложным. В работе [186] было выдвинуто предположение, что первый максимум соответствует вытеснению только хвостов, в то время как появление петель сопровождается появлением второго максимума. Однако эта гипотеза противоречит данным по рассеянию рентгеновских лучей, согласно которым образование петель предпочтительно даже при малых поверхностных давлениях [193]. Некоторые авторы также рассматривают возможность поверхностной агрегации и образования второго слоя белка в области поверхностных давлений, соответствующих второму максимуму [190].
В работе [194] впервые были представлены кинетические зависимости динамической поверхностной упругости растворов Р-казеина с двумя локальными максимумами. Авторы связали появление экстремумов на зависимости динамической поверхностной упругости от возраста поверхности с последовательными конформационными переходами в процессе адсорбции белка при постепенно увеличивающейся поверхностной концентрации. На основе сравнения с результатами для растворов диблок сополимеров был сделан вывод о том, что второй максимум поверхностной упругости вызван переходом в субфазу более гидрофобных частей молекул белка в виде хвостов и петель при превышении некоторого критического поверхностного давления. Исследование влияния малых добавок катионных и анионных ПАВ на величину и положение пиков на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости подтвердило этот вывод [160].
Кинетические зависимости поверхностной упругости растворов глобулярных белков сильно отличаются от результатов для растворов Р-казеина. Динамическая поверхностная упругость монотонно растет с увеличением возраста поверхности и достигает максимального значения между 60 и 80 мН/м вблизи равновесия. Результаты для растворов лизоцима обнаруживают индукционный [143].
Хорошо известно, что глобулярная структура может меняться и даже полностью разрушаться при сильных отклонениях рН от изоэлектрической точки [195]. Соответствующие конформационные переходы были подробно изучены для растворов БСА, для которого можно обнаружить как минимум пять конформеров при различных рН [54]. Было обнаружено, что динамическая поверхностная упругость растворов F (при рН около 4) и В (при рН около 7) конформеров заметно отличается от результатов для N-конформера (при рН около 5), что объяснялось различиями в жесткости конформеров БСА и в их упаковки в адсорбционном слое [54].
Определение размеров наночастиц в водном растворе
Несмотря на то, что кинетические зависимости динамических поверхностных свойств для различных концентраций полиэлектролита заметно отличаются друг от друга, зависимости поверхностной упругости от поверхностного давления близки. Это означает, что наблюдаемые различия носят, прежде всего, кинетический характер, и добавление полиэлектролита не влияет на структуру адсорбционного слоя вплоть до поверхностного давления 11 мН/м, то есть в области поверхностных давлений, соответствующих монотонным кинетическим зависимостям поверхностной упругости. Можно предположить, что первичный комплекс БСА/ПДАДМАХ состоит из относительно жесткой глобулы, окруженной гибкой и мягкой внешней оболочкой полиэлектролита. Последняя не влияет на зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления. Вероятно, полиэлектролит вытесняется из ближней области поверхностного слоя. Оболочка полиэлектролита деформируется в процессе адсорбции и не влияет на взаимодействия между глобулами в поверхностном слое, при условии, что поверхностное давление не превышает 11 мН/м (рис. 17).
Локальный максимум на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости растворов глобулярных белков ранее наблюдался в том случае, если к раствору белка был добавлен денатурант, и его содержание превышало некоторое критическое значение. Этот эффект объяснялся разрушением третичной структуры белка в поверхностном слое и образованием дальней области поверхностного слоя -области петель и хвостов [26,40,196].
Локальный максимум на рис. 14 и 16 указывает на начало разрушения третичной и возможно на частичное разрушение вторичной структуры БСА в результате взаимодействия с полиэлектролитом. Локальный максимум для смешанных растворов БСА/ПДАДМАХ появляется при увеличении поверхностного давления выше 12 мН/м (рис. 16). Данная величина является характеристическим значением для БСА и соответствует вытеснению некоторых частей развернутой молекулы из ближней области поверхностного слоя в дальнюю область поверхностного слоя в виде хвостов и петель в растворах денатурантов различной химической природы [26].
В то же время кинетические зависимости поверхностной упругости смешанных растворов БСА/ПДАДМАХ имеют некоторые отличия от соответствующих зависимостей для растворов смесей БСА с сильными денатурантами. Во-первых, максимум динамической поверхностной упругости (рис. 14, 16) не зависит в пределах погрешности от концентрации полиэлектролита. Во-вторых, появление максимума происходит даже при очень малых концентрациях ПДАДМАХ (вплоть до 2 10" мг/мл). В-третьих, динамическая поверхностная упругость в области после максимума все еще остается сравнительно высокой при приближении к равновесию (примерно 45 мН/м), в том числе при высоких концентрациях ПДАДМАХ (2 10" мг/мл). Эти отличия поверхностных свойств растворов БСА/ПДАДМАХ от свойств растворов БСА/ГХГ и БСА/мочевина свидетельствуют о том, что третичная структура белка разрушается в первом случае лишь частично и степень ее разрушения лишь слабо зависит от концентрации полиэлектролита.
Морфология пленок (рис.18), перенесенных с помощью метода Ленгмюра-Блоджет, с поверхности раствора на поверхность слюды, также указывает на разворачивание глобул БСА под действием полиэлектролита. На полученных АСМ изображениях видно, что добавление ПДАДМАХ приводит к тому, что размеры частиц в пленке увеличиваются и их границы становятся менее четкими. Можно предположить, что отдельные объекты, из которых состоит пленка, представляют частично развернутые глобулы БСА. IV.2. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПСС
Для исследования адсорбционных пленок смесей БСА и ПСС на водной поверхности были измерены поверхностное натяжение и поверхностная упругость растворов смеси как функции возраста поверхности и концентрации полиэлектролита при четырех различных рН = 2,3; 3,8; 7; 10,4 и одной концентрации белка 8 10" М. Поверхностные свойства растворов БСА без добавок полиэлектролита типичны для глобулярных белков: динамическая поверхностная упругость и поверхностное давление монотонно растут, достигая значений 80 мН/м и 12 мН/м, соответственно. ПСС в выбранном диапазоне концентраций не обладает собственной поверхностной активностью.
Кинетические зависимости поверхностных свойств при рН=7 и рН=10,4, а также при рН 2,3 и 3,8 очень близки. Поэтому ниже приведены экспериментальные результаты только при рН = 7 и рН = 3,8.
Динамическое поверхностное натяжение и динамическая поверхностная упругость растворов БСА/ПСС при рН 7 и при низких концентрациях ПСС ( 2 10"4 мг/мл) близки к результатам для растворов чистого белка (рис. 19, 20). С увеличением концентрации полиэлектролита, падение поверхностного натяжения замедляется и при концентрации ПСС 2 10" мг/мл составляет менее 2 мН/м за пять часов после образования новой поверхности. При этом монотонный рост динамической поверхностной упругости с возрастом поверхности также значительно уменьшается.
Если представить поверхностную упругость как функцию поверхностного давления (рис. 21), то все зависимости в пределах погрешности совпадают с зависимостью для растворов чистого белка. Этот факт позволяет предположить, что структура адсорбционной пленки не меняется при добавлении полиэлектролита при рН = 7 и 10,4. Вне зависимости от концентрации ПСС, поверхностные свойства определяются адсорбированными глобулами белка. Молекулы БСА на границе раствор-газ образуют прочную сеть межмолекулярных связей, в значительной степени сохраняя свою третичную структуру [54].
Динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПСС
При низких концентрациях фибриногена ( 2 10" М) на кинетических зависимостях поверхностных свойств наблюдается индукционный период. По-видимому, концентрация белка должна превысить некоторое критическое значение для того, чтобы вызвать изменение поверхностных свойств [145].
Если представить поверхностную упругость как функцию поверхностного давления, то все экспериментальные данные не ложатся на одну кривую, как для растворов других глобулярных белков (рис. 50). В интервале концентраций 1 10" -5 10" М характер зависимостей єк(л:) меняется и поверхностная упругость уменьшается при заданном поверхностном давлении. Обнаруженная особенность поверхностных свойств растворов фибриногена, а также более низкие значения динамической поверхностной упругости вблизи равновесия по сравнению с соответствующими данными для растворов других исследованных белков, по-видимому, связаны с более сложным строением молекулы фибриногена. Можно предположить, что при низких концентрациях вытянутые молекулы фибриногена располагаются параллельно поверхности. При увеличении концентрации происходит переориентация молекул, и структура адсорбционной пленки становится более рыхлой [145].
Динамическое поверхностное натяжение и динамическая поверхностная упругость растворов комплексов фибриноген/ПСС измерялась как функция концентрации полиэлектролита и времени жизни поверхности при рН = 3,8 и рН = 7.
При рН=7 компоненты одноименно заряжены, и, следовательно, можно ожидать, что фибриноген и ПСС слабо взаимодействуют друг с другом. Тем не менее, неоднородное распределение заряженных групп молекулы белка, высокая гибкость ПСС и возможность гидрофобных взаимодействий между компонентами приводит к образованию комплексов белок/полиэлектролит. В результате динамические поверхностные свойства растворов смеси отличаются от свойств растворов чистого белка (рис. 51, 52). С увеличением концентрации ПСС рост динамической поверхностной упругости и поверхностного давления замедляется. При этом зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления (рис. 53) близки к соответствующим зависимостям для чистого белка. Это указывает на то, что структура поверхностного слоя почти не меняется и адсорбционная пленка состоит в основном из молекул белка. Изменение кинетических зависимостей при увеличении концентрации полиэлектролита можно объяснить увеличением заряда адсорбирующегося комплекса. Несмотря на различия в строении молекулы фибриногена и типичных глобулярных белков, характер изменения кинетических зависимостей поверхностных свойств растворов фибриноген/ПСС при увеличении концентрации полиэлектролита близок к соответствующим результатам для растворов БСА/ПСС и лизоцим/ПДАДМАХ при рН=7, когда компоненты одноименно заряжены.
При рН=3,8 заряд фибриногена противоположен по знаку заряду ПСС. Уже при концентрации ПСС 5 10" мг/мл динамическая поверхностная упругость растет медленнее с возрастом поверхности, чем для растворов чистого белка, и на кинетической зависимости возникает заметный индукционный период (рис. 54). При дальнейшем увеличении концентрации полиэлектролита скорость изменения поверхностных свойств резко падает и уже при концентрации 2 10" мг/мл поверхностные свойства раствора фибриноген/ПСС близки к поверхностным свойствам воды в течение пяти часов (рис. 54, 55). Если представить динамическую поверхностную упругость как функцию давления, то все экспериментальные данные ложатся на одну кривую (рис. 56). Похожие изменения монотонных кинетических зависимостей поверхностных свойств наблюдаются для растворов смесей одноименно заряженных белков и полиэлектролитов при увеличении концентрации полиэлектролита и объясняются увеличением электростатического барьера адсорбции (параграфы IV. 2. и IV.4.). Однако в случае растворов фибриноген/ПСС результаты эллипсометрических измерений и данные по агрегации в объеме раствора указывают на другую причину наблюдаемых эффектов.
Кинетические зависимости эллипсометрического угла Asurf (рис. 57), показывают, что с ростом концентрации полиэлектролита поверхностная концентрация сильно уменьшается. Для растворов БСА/ПСС при рН = 7 и лизопим/ПДАДМАХ при рН=7 также наблюдалось, что поверхностная концентрация растворов комплексов меньше значений для растворов чистого белка, но влияние полиэлектролита было значительно слабее.
Данные динамического рассеяния света указывают на образование мезоскопических агрегатов в объеме раствора (рис. 58). Агрегаты с диаметром в диапазоне 100 - 500 нм начинают образовываться уже при концентрации ПСС 2 10" мг/мл, когда наряду с крупными агрегатами в растворе находятся отдельные молекулы фибриногена. С ростом концентрации полиэлектролита доля агрегатов растет и при концентрации ПСС выше 2 10" мг/мл молекулы несвязанного белка уже не могут быть обнаружены. Сильное взаимодействие между компонентами в объеме раствора наблюдается также для системы лизопим/ПСС при рН=7 (параграф IV.3.).