Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы ,,, 10
1.1. Неалкогольная жировая болезнь печени ,, 10
1.1.1. Патогенез неалкогольной жировой болезни печени ,, 10
1.1.2. Гистоморфологические изменения печени при неалкогольной жировой болезни печени 14
1.2. Регенерационные механизмы печени 15
1.3. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний печени
1.3.1. Патологическая роль апоптоза в печени 18
1.3.2. Апоптоз и воспаление 19
1.3.3. Апоптоз и фиброз 21
1.3.4. Апоптоз при неалкогольной жировой болезни печени
1.4. Гемоксигеназная система в патогенезе заболеваний печени 24
1.5. Моделирование неалкогольной жировой болезни печени у животных 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 33
2.2. Материал исследования 36
2.3. Методы исследования 36
ГЛАВА 3. Гистоморфологическое строение печени крыс при формировании неалкогольной жировой болезни печени
3.1. Гистоструктура печени крыс в динамике формирования неалкогольной жировой болезни печени 41
3.2. Активность процессов апоптоза и некроза гепатоцитов печени крыс в динамике формирования неалкогольной жировой болезни печени и в период самовосстановления 59
ГЛАВА 4. Регенерационная активность печени крыс при формировании неалкогольной жировой болезни печени 62
4.1. Плоидометрический и пролиферативный статус печени крыс при стеатозе и в период самовосстановления з
4.2. Плоидометрический и пролиферативный статус печени крыс со стеатогепатитом и в период самовосстановления 66
4.3. Плоидометрический и пролиферативный статус печени крыс с фиброзом и в период самовосстановления 70
ГЛАВА 5. Активность гемоксигеназной системы при формировании неалкогольной жировой болезни печени 74
5.1. Гемоксигеназная активность в печени крыс в динамике формирования неалкогольной жировой болезни печени 74
5.2. Гемоксигеназная активность в печени крыс с неалкогольной жировой болезнью печени в период самовосстановления 81
5.3. Взаимосвязь активности гемоксигеназной системы с интенсивностью регенерационных, апоптотических и некротических процессов в печени крыс при формировании неалкогольной жировой болезни печени 85
ГЛАВА 6. Заключение 89
Выводы 103
Список сокращений 105
Список литературы
- Регенерационные механизмы печени
- Материал исследования
- Активность процессов апоптоза и некроза гепатоцитов печени крыс в динамике формирования неалкогольной жировой болезни печени и в период самовосстановления
- Плоидометрический и пролиферативный статус печени крыс с фиброзом и в период самовосстановления
Введение к работе
Актуальность исследования. Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) – диагноз, прочно занявший место в ряду основных причин поражения гепатобилиарной системы. В силу сглаженности характерных клинических проявлений ожирения печени многие врачи склонны недооценивать значение НАЖБП. Однако многочисленными клиническими наблюдениями и экспериментальными исследованиями доказана возможность эволюции длительно существующего стеатоза печени в цирроз. До 25% криптогенных циррозов печени являются следствием НАЖБП (Корнеева О.Н., 2005; Мамаев С.Н., 2007; Тарасова Л.В., 2013; Kojima H., 2006).
Факторами риска ожирения печени являются избыточное потребление жиров, окислительный стресс, инсулинорезистентность, гиперцитокинемия (Корнеева О.Н., 2005; Мамаев С.Н., 2007; Kojima H., 2006). Известно, что на фоне снижения физической активности структура питания большинства населения характеризуется избыточным потреблением жиров животного происхождения и продуктов, богатых холестерином.
Несбалансированный рацион богатый жирами способствует развитию
дисметаболических изменений в печени, где происходят ключевые процессы
мобилизации, переработки и биосинтеза липидов. Формирующиеся при этом
структурно-функциональные нарушения становятся независимыми
патогенетическими звеньями в общей цепочке механизмов формирования НАЖБП (Зайченко О.Е., 2014; Яковенко Э.П. и др., 2005, Fan J.G., 2003; Dabhi A. et al., 2008). Вместе с тем многие вопросы патогенеза НАЖБП остаются не до конца ясными, в частности механизмы повреждения гепатоцитов, процессов регенерации и фиброгенеза.
В последнее время интерес направлен на изучение особой сигнальной системы – гемоксигеназной, способной активировать как защитно-адаптационные механизмы, так и деструктивно-патологические. Показано, что эта система играет ведущую роль в поддержании функционального и структурного гомеостаза печени (Sacerdoti D., 2004; Wang X.H. et al., 2005; Volti G.L. et al., 2008). Нарушение функционирования систем сигнальной трансдук-ции может явиться решающим фактором в развитии заболеваний печени, в том числе и НАЖБП. Большинство исследований гемоксигеназной системы концентрируется на способности гемоксигеназ синтезировать билирубин. Установлен факт влияния билирубина на снижение выработки проколлагена клетками Ито, ингибирование апоптоза гепатоцитов (Schuett H. et al., 2007; , 2007; Volti G.L. et al., 2008; Nader G., 2008). Вместе с тем показано, что продукт деградации гема монооксид углерода (СО) участвует в механизмах пролиферации и апоптоза, проявляет вазодилатационные свойства.
Таким образом, исследование механизмов, лежащих в основе структурно-функциональной реорганизации печени при развитии НАЖБП, является актуальным направлением, которое позволит дополнить патогенетическую картину заболеваний печени.
Это определило основную цель работы: установить стадийные закономерности морфофункциональной реорганизации печени и механизмы ее регуляции при диет-индуцированной НАЖБП.
Для реализации цели последовательно решались следующие задачи:
-
Изучить гистоструктуру ткани печени и морфометрические параметры гепатоцитов крыс в динамике формирования диет-индуцированной НАЖБП и в период самовосстановления.
-
Исследовать уровень апоптоза и некроза гепатоцитов крыс в динамике формирования диет-индуцированной НАЖБП и в период самовосстановления.
-
Изучить плоидность гепатоцитов и установить механизмы регенерации печени крыс при диет-индуцированной НАЖБП.
-
Изучить активность гемоксигеназной системы по уровню экспрессии гемоксигеназы-1 (НО-1) в ткани печени и количеству СО в сыворотке крови у крыс, установить ее роль в механизмах формирования диет-индуцированной НАЖБП.
-
Установить роль клеточной регенерации, апоптоза клеток и активности гемоксигеназы в механизмах развития диет-индуцированной неалкогольной жировой болезни печени у крыс.
Научная новизна работы. Впервые установлены стадийные и реверси-онные закономерности изменения гистоструктуры печени в динамике формирования диет-индуцированной НАЖБП у крыс. Прогрессирование морфологических нарушений печени при НАЖБП сопровождается воспалительной инфильтрацией паренхимы, увеличением площади некротизированных участков и количества апоптотических гепатоцитов, формированием начальной стадии септального фиброза. Впервые на модели диет-индуцированной жировой болезни печени у крыс получены новые знания об изменении пло-идности ядер гепатоцитов, их пролиферативной активности в зависимости от степени структурных нарушений ткани печени. Установлены приоритетные механизмы регенерации ткани печени для каждой стадии развития НАЖБП, компенсирующие патологическую реорганизацию органа. Впервые методом иммуногистохимического анализа обнаружено, что увеличение активности гемоксигеназной системы в печени крыс при стеатозе и фиброзе происходит за счет увеличения площади экспрессии гемоксигеназы-1, при стеатогепатите – повышения интенсивности синтеза фермента отдельными гепатоцитами.
Установленная взаимосвязь гемоксигеназной системы с ключевыми патофизиологическими процессами в печени (апоптоз, некроз, регенерация) свидетельствует о важной роли гемоксигеназы-1 в механизмах структурной реорганизации ткани печени при НАЖБП.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Установленные новые данные расширяют представления о механизмах патогенеза НАЖБП, способствуют пониманию роли клеточной регенерации, апоптоза клеток и активности гемоксигеназы в процессах структурной реорганизации печени при НАЖБП, что может быть использовано для разработки профилактических и лечебных технологий, препятствующих развитию алиментарно-зависимых заболеваний гепатобилиарной системы.
Разработан способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени у крыс (Патент РФ № 2394281), который может быть использован для исследования механизмов развития, прогрессирования и терапии заболеваний печени неинфекционного генеза. Полученные результаты исследования целесообразно использовать как модель создания диагностических критериев морфофункционального состояния печени крыс при НАЖБП.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Стадийные изменения морфофункционального состояния ткани печени в динамике формирования НАЖБП имеют качественные и количественные различия апоптотической, некротической, регенерационной активности.
-
Патологическая структурно-функциональная реорганизация печени в условиях формирования НАЖБП компенсируется запуском регенерацион-ных механизмов: при стеатозе печени репарация осуществляется за счет гипертрофии, при стеатогепатите – полиплоидизации, при формировании фиброза – пролиферации паренхимных клеток.
-
Динамика развития НАЖБП сопровождается увеличением активности гемоксигеназной системы и ее взаимосвязи с ключевыми патофизиологическими процессами (апоптоз, некроз, регенерация), что свидетельствует о важной роли НО-1 в регуляции морфофункциональной реорганизации печени.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на 20 конференциях, из которых 7 – международного уровня (XIV, XV Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилита-ции, Дубай, 2009, 2010; Х, XII Тихоокеанская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины», Владивосток, 2009, 2012; II Международная студенческая научная конференция «Клинические и теоретические аспекты современной медици-
ны», Москва, 2010 г; Международная конференция «Перспективные направ
ления развития биомедицинских технологий», Владивосток, 2012; XVI Меж
дународная научная конференция «Здоровье семьи», Будапешт, 2012); 10 –
всероссийского уровня (III, IV, V, VI Всероссийская научно-практическая
конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-
приспособительных процессов», Новосибирск, 2007, 2009, 2011, 2013; Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 55-летию образования ЧГМА, Чита, 2008; XIV, XVII Российская гастроэнтерологическая неделя, Москва, 2008, 2012; 14-я, 15-я Российская конференция «Гепатология сегодня», Москва, 2009, 2010; Юбилейная научно-практическая конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты медико-биологических исследований», Владивосток, 2009); 3 – регионального уровня (VII, VIII Дальневосточный региональный конгресс «Человек и лекарство», Владивосток, 2011, 2012; Научно-практическая конференция «Фундаментальная наука – медицине», Владивосток, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ, из них 2 монографии, 14 статей (8 в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора наук, 3 в переводных журналах, 3 публикации в иных изданиях), 19 тезисов докладов в материалах научных конференций, 2 свидетельства об официальной регистрации баз данных, 2 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 214 источников, из них 90 отечественных и 124 иностранных авторов, иллюстрирована 30 рисунками и содержит 5 таблиц.
Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены автором лично и совместно с сотрудниками лаборатории биомедицинских исследований Владивостокского филиала «ДНЦ ФПД» – НИИ МКВЛ. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Диссертационная работа выполнялась в рамках плановой НИР института, № госрегистрации 0120.0408169.
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. Ю.К. Денисенко, а также д.б.н., профессору Т.П. Новгородцевой, д.м.н. Т.А. Гвозденко, д.б.н. Т.И. Виткиной и всему коллективу лаборатории биомедицинских исследований Владивостокского филиала «ДНЦ ФПД» – НИИ МКВЛ за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы.
Регенерационные механизмы печени
Наличие и выраженность неалкогольной жировой болезни печени тесно связаны с факторами риска развития резистентности к инсулину и метаболического синдрома. Взаимосвязь между инсулинорезистентностью (ИР) и НАЖБП является комплексной (многосоставной), и патогенетические механизмы, участвующие в опосредованном повреждении печени в этих условиях, все еще не полностью изучены. Согласно предложенной С.П. Дей и соавт. гипотезе генеза НАЖБП предполагается, что формирование и прогрессирование заболевания является двухступенчатым процессом [112, 173, 161, 156].
Первый этап включает в себя накопление жира в гепатоцитах. В литературе описано четыре механизма накопления жира в печени: увеличение поступления жира и свободных жирных кислот (СЖК) с пищей и захват их печенью из кровотока; усиление синтеза жирных кислот или угнетение процессов окисления СЖК в митохондриях гепатоцитов, что способствует повышенному образованию триглицеридов (ТГ); нарушение выведения ТГ из гепатоцитов; углеводы, поступающие в печень из кровотока в избыточном количестве, также могут преобразовываться в жирные кислоты. Данные нарушения тесно связаны с метаболическими расстройствами, с центральным ожирением и инсулинорезистентностью. Инсулинорезистентность – одна из главных составляющих МС. Именно она приводит к компенсаторной гиперинсулинемии, которая стимулирует печеночный липогенез, глюконеогенез, ингибирует липолиз в печени и приводит к накоплению жира гепатоцитами в результате влияния адипокинов (цитокинов, вырабатываемых жировой тканью). Одновременно увеличивается липолиз висцерального жира с высвобождением огромного количества СЖК [25].
Существует и обратная связь между НАЖБП и ИР. Накопление свободных жирных кислот снижает связывание инсулина рецепторами гепатоцитов, что формирует и усиливает ИР на уровне печени. Стимулируется глюконеогенез и возрастает продукция глюкозы печенью. Жировая дистрофия печени может служить предвестником нарушений углеводного обмена, с последующим диагностированием нарушения толерантности к глюкозе и сахарного диабета 2-го типа [29]. Первый этап завершается формированием стеатоза – накоплением в гепатоцитах СЖК, замедлением их окисления, а также замедлением элиминации ТГ [92, 164].
Механизмы, участвующие в прогрессии стеатоза и приводящие к более серьезным поражениям печени (стеатогепатит, фиброз), являются сложными и на данный момент не раскрыты полностью. Не установлено, почему в некоторых случаях происходит прогрессирование стеатоза до статогепатита и фиброза, а в других случаях может существовать длительно текущий стеатоз. Предполагается несколько версий, в число которых входит генетическая теория, влияние сопутствующих заболеваний, а также новые исследования о воздействии повышенного уровня гемоглобина на возможность прогрессирования НАЖБП. Так повышение уровня гемоглобина уменьшает приток крови к печени, что может вызвать гипоксию печени и стимулировать воспалительный и профибротический ответы [74, 191, 148, 202, 211, 212]. Предположительно, существуют три пути, по которым реализуется механизм прогрессирования заболевания. Окислительный стресс является одним из ключевых механизмов развития и прогрессирования НАЖБП. Его действие опосредуется усилением свободно-радикальных реакций и повышением выработки цитокинов (TNF- (фактор некроза опухоли), интерлейкин-8, FAS-лиганды). Факторы, способствующие перекисному окислению липидов и окислительному стрессу, включают в себя индукцию цитохрома р-450 2E1 в печени и митохондриальную дисфункцию, которая приводит к образованию активных форм кислорода (АФК) [112]. В результате перекисного окисления липидов образуются малондиальдегид и 4 гидроксиноненал, которые индуцируют воспаление, снижают антиоксидантную активность глутатиона, активируют звездчатые клетки, являющиеся основными продуцентами коллагена. Наконец, лептин, эндотоксины и перегрузка железом завершают формирование неалкогольного стеатогепатита [159].
На современном этапе внимание ученых многих стран приковано к гормоноподобным веществам – адипокинам (лептин, адипонектин). Известно, что у лиц с неалкогольным стеатогепатитом при биопсии наблюдается значительное уменьшение внутрипеченочной экспрессии адипонектина и его рецепторов в сравнении с показателями при простом стеатозе. Как известно, адипонектин проявляет противовоспалительные свойства и продуцируется в печени в основном эндотелиальными клетками, в то время как его рецепторы экспрессируются на гепатоцитах. Возможно, именно данные гормоноподобные вещества станут недостающим звеном в цепи патогенеза нарушений углеводного и липидного обменов, которые, в свою очередь, приводят к прогрессированию НАЖБП [25, 121, 140, 177, 189].
Взаимодействие между стеатозированными гепатоцитами, клетками Купфера, воспалительными клетками и звездчатыми клетками печени играет важную роль в последующем развитии фиброза и цирроза печени. Факторы, регулирующие этот процесс, включают активацию профибриногенных цитокинов, таких как интерлейкин-10 и трансформирующий фактор роста-, которые в свою очередь, регулируются другими факторами, в том числе лептином и нейромедиаторами – такими как норадреналин. Высвобождение липидов из поврежденных гепатоцитов может также приводить к механической и/или воспалительно-клеточной окклюзии печеночной венулы, способствуя паренхимальному разрушению и фиброзу [112, 193, 199].
Следует отметить, что на данном этапе научных исследований патогенеза НАЖБП формируется альтернативная ветвь по изучению генетического аспекта развития данного заболевания. Установлено, что существует генетическая предрасположенность к развитию и прогрессированию НАЖБП, однако доля данного фактора в сравнении с социальным (нарушение культуры питания) не столь высока. Тем не менее генетические исследования могут быть полезны в разработке новых стратегий лечения заболевания на основе генотипа [132, 200].
Учитывая, что НАЖБП является мультифакторным заболеванием, в патогенезе которого принимают участие как генетические, так и иммунометаболические механизмы, трудно установить единую теорию развития данной патологии печени. Таким образом, установление общих неспецифических детерминант, запускающих формирование НАЖБП, и выявление механизмов их регуляции является актуальной проблемой современной гепатологии.
Материал исследования
При отмене высококалорийной нагрузки сроком 30 суток у крыс со стеатогепатитом в печени оставались выраженные явления жировой дистрофии, сохранялись участки некроза, деструкция печеночных балок и гепатоцитов, тромбоз венул. В препортальных участках ткани печени обнаруживались гепатоциты с баллонной дистрофией, расширенными синусоидами (рис. 8а). Отмечалась центролобулярная крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов, незначительное увеличение соединительнотканных тяжей в портальных зонах печени. Воспалительный инфильтрат и коллагеновые волокна не выходили за пределы пограничной терминальной пластинки (рис. 8 б). Размеры клеток после периода самовосстановления были увеличены на 9,92% (р 0,01), ядра не имели достоверных различий с размерами ядер опытной группы 2. Индекс Я/Ц, соответственно, уменьшился.
Данная картина свидетельствует, что отмена высококалорийной нагрузки сроком 30 суток способствует нарастанию жировой дистрофии, сохранению признаков некроза в паренхиме печени.
Реверс 2а. Через 60 суток периода самовосстановления после формирования стеатогепатита у крыс наблюдалось восстановление структуры печеночных долек и нормализация размеров гепатоцитов, уменьшение степени жировой дистрофии. В препортальной зоне сохранялись участки с воспалительной инфильтрацией, некроз гепатоцитов не выявлялся (рис 9).
Таким образом, период самовосстановления у животных с опытной группы 2 приводит к постепенному улучшению гистоструктуры ткани печени лишь после 60 суток восстановительного периода. а)
Гистологическое строение печени крысы группы реверса 2а. Жировая дистрофия слабовыражена. Расширение и кровенаполнение вены, незначительная препортальная инфильтрация. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. х150 Опытная группа 3. На 180 сутки формирования НАЖБП гистоструктура печени крыс подверглась значительным деструктивно-дистрофическим изменениям, выразившимся в увеличении площади некротизированных участков. Гепатоциты не образовывали трабекул, располагались беспорядочно, синусоиды были резко сужены. Деструктивные изменения гепатоцитов сопровождались усилением мезенхимально-клеточной реакции, особенно заметной в зонах портальных трактов, где обнаруживалась круглоклеточная инфильтрация. Выявлялись триады крупных и мелких размеров. Местами было отмечено расширение портальных трактов за счет разрастания стромы и воспалительной инфильтрации. В некоторых портальных трактах наблюдались некротические изменения сосудов. Стенки таких сосудов были слабо различимы. Выявлялась деструкция желчных протоков. Центральные вены были расширены с небольшим количеством эритроцитов в просвете. Паренхима печени крыс изменена по типу жировой дистрофии (рис. 10а, б). В центральных зонах долек печени обнаруживались участки гепатоцитов с кариолизисом, что является признаком колликвационного некроза клеток (рис. 11а) [40].
На гистологических срезах ткани печени крыс наблюдалось разрастание новых мелких триад в паренхиме печеночных долек (рис. 11г). Вокруг таких триад имелись небольшие очаги воспалительной инфильтрации. Наличие мелких триад без значительных нарушений и инфильтраций указывает на прорастание желчных протоков в паренхиме печени в ответ на нарушение структуры и функции уже имеющихся портальных трактов. Это свидетельствует о процессе регенерации как одном из проявлений компенсаторной реакции для сохранения функциональной активности печени на фоне структурной трансформации в условиях формирования НАЖБП. Помимо этого, в паренхиме печени формировались ложные дольки с появлением пролиферирующих гепатоцитов, окруженных соединительнотканной капсулой (рис. 8д).
На 180 сутки эксперимента гепатоциты печени крыс имели крупные размеры, мелкоячеистую просветленную цитоплазму, ядра были смещены к периферии клеток. Площадь гепатоцитов крыс опытной группы 3 достигала 498,5 (475,8; 521,2) мкм2, при этом размеры ядер снижались до 41,1 (40,0; 42,3) мкм2. Ядра гепатоцитов большей частью были мелкими и гетерохромными, смещенными к периферии клеток. На препаратах, окрашенных по Ван-Гизону, обнаруживалось увеличение количества коллагеновых волокон. Они распространялись из портальных трактов, образуя картину портального и начальной стадии септального фиброза печени (рис 12а, б).
Активность процессов апоптоза и некроза гепатоцитов печени крыс в динамике формирования неалкогольной жировой болезни печени и в период самовосстановления
Большой интерес представляют исследования гемоксигеназной системы и установление ее роли в физиологических и патологических процессах. Основная функция гемоксигеназы заключается в катаболизме гема с образованием биливердина, свободного железа и монооксида углерода [36, 92]. В связи с тем, что гемоксигеназа оказывает существенное влияние на многие биологические механизмы, в настоящее время внимание исследователей привлекает проблема установления роли гемоксигеназ в развитии различных заболеваний [42, 92, 136, 140, 157, 183]. Изучение активности гемоксигеназной системы в динамике формирования НАЖБП, а также в периоды самовосстановления является актуальной научной задачей [129, 144, 145]. Активность гемоксигеназной системы была исследована определением площади и интенсивности экспрессии фермента гемоксигеназа-1 в ткани печени экспериментальных животных, а также по уровню монооксида углерода в крови.
Контрольная группа. Иммуногистохимическое исследование ткани печени крыс контрольной группы выявило умеренную активность экспрессии гемоксигеназы-1. У животных групп контроля экспрессия фермента определялась в клетках Купфера и клетках желчных протоков, в незначительном количестве – в гепатоцитах (рис. 24). Относительная площадь гепатоцитов, экспрессирующих фермент, в среднем составляла 1,83 (1,75; 1,91)% от общей площади исследуемых клеток печени. Оптическая плотность иммунного окрашивания гемоксигеназы-1 в печени крыс контрольной группы соответствовала 0,406 (0,402; 0,410) е.я.
Содержание монооксида углерода (СО) в крови животных контрольных групп в среднем равнялось 0,32 (0,29; 0,35) мг/л (табл. 4).
Опытная группа 1. При формировании стеатоза печени экспрессия гемоксигеназы-1 отмечалась в единичных гепатоцитах, преимущественно в портальных зонах долек печени (рис. 25). Оценка активности экспрессии гемоксигеназы-1 у крыс опытной группы 1 выявила увеличение площади экспрессии, в 1,5 раза (р 0,01) относительно группы контроля, при этом оптическая плотность не изменялась. Уровень монооксида углерода в крови животных со стеатозом печени был выше в два раза по сравнению с контрольными животными (р 0,01).
Опытная группа 2. Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии гемоксигеназы-1 в ткани печени крыс, находившихся на экспериментальном рационе в течение 90 суток, показало увеличение количества гепатоцитов с иммунной меткой вокруг портальных трактов (рис. 26). Фотометрия иммунопозитивных структур позволила установить увеличение площади экспрессии гемоксигеназы-1 в печени крыс опытной группы 2 в 1,9 раз (р 0,01) в сравнении с опытной группой 1. Интенсивность экспрессии фермента на 90 сутки эксперимента увеличилась на 3,8% (р 0,01) относительно показателей опытной группы 1 и составила 0,432 (0,429; 0,435) е.я.
При развитии НАЖБП сроком 90 суток уровень СO в крови возрос в 3,5 раза по сравнению с группой контроля (р 0,001).
Опытная группа 3. К 180 суткам формирования НАЖБП в паренхиме печени выявлялись скопления иммуноокрашенных гепатоцитов вокруг очагов некроза (рис. 27, 28). Количественное измерение активности гемоксигеназы-1 в печени крыс опытной группы 3 показало увеличение площади экспрессии фермента в 3,3 раза (р 0,001) по сравнению со значениями опытной группы 2. Оптическая плотность иммуноокрашенных структур печени крыс опытной группы 3 снизилась на 4,6% (р 0,01) относительно показателей опытной группы 2.
Анализ уровня метаболитов монооксида углерода в крови выявил восьмикратное повышение его концентрации (р 0,001). Результаты исследования показали, что активность экспрессии гемоксигеназы-1 при формировании неалкогольной жировой болезни печени возрастает по мере усиления структурных нарушений. Увеличение активности гемоксигеназной системы в печени в условиях формирования НАЖБП, возможно, является сдерживающим фактором развития структурно-функциональных нарушений органа и прогрессирования заболевания. Известно, что высокая активность гемоксигеназы-1 в ткани печени способствует снижению гипоксии за счет вазодилатационных свойств СО и остальных метаболитов фермента [108, 135]. Гиперактивация гемоксигеназы-1 повышает резистентность клеток к апоптическим и некротическим изменениям, снижает воспалительную реакцию, угнетает фиброгенную активность звездчатых клеток печени [105, 110, 143, 151]. Повышение экспрессии гемоксигеназы-1, возможно, является одним из механизмов сохранения структурно-функциональной целостности органа.
Несмотря на то, что повышение уровня СО и увеличение количества гепатоцитов, синтезирующих гемоксигеназу-1, отмечалось на всех этапах развития НАЖБП, интенсивность экспрессии фермента отдельными клетками при формировании фиброза печени снижалась. Данная картина характеризует истощение функциональных возможностей гепатоцитов синтезировать гемоксигеназу-1 при формировании обширных некротических изменений и фиброзной трансформации печени.
Плоидометрический и пролиферативный статус печени крыс с фиброзом и в период самовосстановления
Результаты исследования различных зон печени показали, что в портальной зоне дольки печени у крыс опытной группы 2 показатели плоидности смещены в сторону увеличения высокоплоидных (4с) гепатоцитов в основном за счет двуядерных клеток (2с х 2), что свидетельствует о более активных регенерационных процессах, происходящих в этой зоне по сравнению с центральной зоной дольки печени (рис. 18а, б). На это же указывает и повышенное количество ядер гепатоцитов промежуточных форм в переходах между классами плоидности 2с4с, предполагающее более высокую активность синтеза генетического материала в клетках портальной зоны печени. Следовательно, за механизмы репарации и регенерации печени в большей степени отвечает портальная зона дольки печени.
Таким образом, значительное увеличение очагов некроза в печени при стеатогепатите стимулирует регенерационные процессы посредством повышения количества полиплоидных гепатоцитов, что необходимо для сохранения энергетического и пластического резерва клеток.
Группа реверса 2а. В 60-суточный период реверсии наблюдалось восстановление гистоструктуры печени и снижение средней плоидности гепатоцитов. Распределение по классам плоидности показало, что в группе животных с периодом самовосстановления 60 суток в 2,31 раза увеличилось (р 0,001) относительно группы реверса 2 количество клеток с диплоидными ядрами и закономерно произошло снижение количества высокоплоидных клеток (рис. 20). Число двуядерных гепатоцитов относительно общего количества клеток снизилось до 24,4 (23,3; 25,4)%. Рис. 19. Распределение ядер по классам плоидности гепатоцитов у крысы группы реверса 2.
Таким образом, перевод животных на стандартный рацион в течение 30 суток после развития неалкогольного стеатогепатита стимулирует процессы полиплоидизации гепатоцитов, что является важным механизмом восстановления структуры и функции печени. Снижение среднего значения плоидности гепатоцитов и уменьшение количества двуядерных клеток до контрольных значений на 60-е сутки восстановительного периода указывает на улучшение структурно-функциональных характеристик печени. 4.3. Плоидометрический и пролиферативный статус печени крыс с фиброзом и в период самовосстановления
Опытная группа 3. Изучение распределения ядер по классам плоидности в печени крыс при формировании НАЖБП в течение 180 суток показало, что число гепатоцитов с диплоидным ядром составляет 26,6 (25,4; 27,8)%. Это в 2,4 (р 0,001) раза больше, чем у крыс группы с НАЖБП сроком 90 суток. Доля 4с-клеток у крыс группы с НАЖБП сроком 180 суток соответствует 70,0 (68,8; 71,2)%. Число двуядерных гепатоцитов больше на 42,1% (р 0,001), чем в группе контроля. Изучение плоидности в центральных и портальных зонах долек не выявило достоверных различий между данными участками ткани печени (рис. 21). Вместе с тем в тетраплоидных ядрах у крыс опытной группы 3, также как и в центральной зоне дольки печени у животных опытной группы 2, наблюдается уменьшение оптической плотности, что, возможно, связано с лизисом или пикнозом ядер, либо повреждением ДНК. Также установлено, что число ядер с содержанием ДНК 1,5с у крыс опытной группы 3 значительно превышает аналогичные показатели опытных групп 1 и 2. В то же время увеличение числа диплоидных клеток может быть результатом усиления регенеративной способности печени за счет резервного пула собственных стволовых клеток либо за счет поступивших из красного костного мозга гемопоэтических стволовых клеток, способных трансформироваться в гепатоциты [48, 56, 61]. Полученные данные показали, что на 180-е сутки формирования НАЖБП из-за обширного структурного повреждения печени и перерождения паренхиматозной ткани в соединительную ткань происходит активное включение программы регенерации. С одной стороны, это – один из защитных механизмов, способствующих поддержанию нормального функционирования печени. С другой стороны, привлечение для регенерации печени пула менее зрелых форм клеток является крайней мерой применяющейся тогда, когда печень подвергается уже достаточно серьезному тканевому перерождению [201].
Группа реверса 3. Плоидометрия гепатоцитов крыс с НАЖБП сроком 180 суток после периода самовосстановления в течение 30 суток выявила повышение количества диплоидных ядер как относительно опытной группы 3 (на 22,9%, (р 0,001)), так и в сравнении с контролем (на 16,4%, (р 0,001)) (рис. 22). Процентное содержание гепатоцитов содержащих тетраплоидные ядра снизилось относительно показателей опытной группы 3 (р 0,01). Относительное количество двуядерных гепатоцитов уменьшилось и составляло 22,9 (22,6; 23,3)% от общего числа исследуемых клеток. Таким образом, отмена высококалорийного рациона у крыс со сформированным фиброзом способствует еще большему снижению количества полиплоидных гепатоцитов печени. Данная картина может быть объяснена как гибелью более специализированных полиплоидных клеток вследствие функциональных и структурных нарушений в ткани печени, так и активной пролиферацией менее зрелых форм гепатоцитов.