Введение к работе
Актуальность проблемы. Методы культивирования изолированных нейронов, начиная со времени разработки первых из них (Hintzsche,1954; Nakai,1956), широко используются в нейробиологии для решения самых разнообразных фундаментальных и прикладных задач. Особое место в этих исследованиях занимает изучение механизмов и регуляции роста нервных отростков, а также образования специфических синаптических связей между нейронами, то есть процессов, лежащих в основе формирования специфических нервных сетей. Интерес к рассмотрению этих вопросов в культуре объясняется тем, что полученные результаты могут быть использованы для раскрытия механизмов формирования нервной системы in vivo - в эмбриогенезе и при ее регенерации после повреждения, Несмотря на большое количество работ и этой области, другие клеточные процессы и общие закономерности морфогенеза нервных сплетений, образуемых нейронами в различных культурах, остаются недостаточно изученными.
Хорошо известно, что нейротрофические факторы, нейротрансмиттеры и субстрат селективно модулируют интенсивность, характер и направление роста отростков. Но также известно, что не меньшую роль в регулировании нейритного роста и формировании нервных сетей в культуре , играют контактные реакции нервных клеток. Однако в исследованиях взаимодействия нейронов внимание уделяется преимущественно еннаптогеиезу и контактному торможению роста нервных отростков . Другие контактные реакции изучены слабо. И сегодня сохраняется точка зрения, что нервные отростки ш vitro проявляют две модели поведения: фасцикуляторное, когда нейриты объединяются в пучки, и нефасцикуляторное, проявляющееся контактным торможением роста отростков (Dunn, 1971; Trinkaus, 1985). Вопрос о разнообразии и селективности контактных реакций между нейронами в культуре, поднятый Sh.Nakajima (1965), остался открытым. В биологии развития постепенно накапливаются данные о том, что межклеточные контакты способны инициировать реакции специфической клеточной дифференцировки в одной пли обеих контактирующих клетках (Гилберт,1995). В последнее время в работах на культурах нервных клеток появляются отдельные находки н других селективных клеточных реакций на контакт (Kapiliammer et al.,1986; Cooper et al.,1992; Femandez-de-Miguel,Vargas,1997). Однако остается неясна возможная роль этих процессов в морфогенезе нервных сетей как in vitro, так и in vivo.
В культуре нейронов взрослых моллюсков методом цейтраферной микрокиносъемки была показана способность клеточных тел нейронов к направленному и избирательному движению (Костенко,Третьяк,!978; Архнпов.Костенко, 1981; Костенко, 1985). Было обнаружено, что перемещение
клеточных тел нейронов происходит внутри собственных отростков (Сотников,1985). Аналогичные процессы миграции нейронов очевидно имеют место и в агрегационных культурах (Maar et al.,1997). Однако такой способ движения остается не только неисследованным, но, по-видимому, и мало известным. Тем не менее он играет существенную роль в структурной лерестройке, идущей внутри сплетений, и, таким образом, является частью процесса формирования систем нейронов в культуре. Что вызывает такую перестройку и какие закономерности сії присущи остается неизвестным.
Существует точка зрения, что нейротаксис в эмбриогенезе не является специфичным (Trinkaus,l985). В то же время исследования в культуре изолированных нейронов показали, что конусы роста нейритов способны селекгивно реагировать на пейротрансмиттеры, выделяемые соседними нейронами (McCobb et al.,1988) или вводимые с помощью микропипетки в среду (Zheng et al.,1994). В связи с наличием в литературе таких разноречивых мнений и фактов вопрос О специфичности нейротаксиса в культуре и его вкладе в морфогенез нервных сплетений становится мало понятным и требует дальнейшего изучения.
Вне поле зрения остаются обычно и вопросы, касающиеся способов образования нервных отростков н первичных пучков нейритов, а также особенности созревания и способы элиминации отростков.
Длительное наблюдение за поведением изолированных нейронов, формирующих нервные сети а культуре, вероятно, позволит глубже понять клеточные механизмы, лежащие в основе образования таких сетей. Изолированные нейроны моллюсков являются хороню изученным и удобным объектом для подобных исследований. Модель локальных сплетений является, по нашему мнению, наиболее подходящей для исследования морфогенеза нервных сетей в культуре, так как позволяет наблюдать отдельное сплетение целиком.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось изучение общих закономерностей и клеточных механизмов Агорфогенеза нервных сплетений в культуре изолированных нейронов моллюсков. Были поставлены следующие задачи:
-
Изучить морфологическое строение и поведение нейронов непосредственно после изоляции их из мозга.
-
Исследовать формирование первичных сплетений нейронов.
-
Проанализировать пронесем структурной перестройки н первичных сплетениях нейронов.
-
Исследовать деструкцию нервных сплетений.
Научная новизна. В проведенном исследовании с использованием фазовоконтрастной микроскопии и серийной микрофотосъемки впервые подробно изучен процесс формирования целого нервного сплетення в культуре изолированных нейронов. Выявлено два этапа в морфогенезе
сплетений: этап формирования первичного нервного сплетения и этап структурной перестройки первичнообразованного сплетения. Показано, что формирование нервных сетей в культуре основано на нейротаксисе и контактных реакциях нейронов друг с другом. Нейротаксические влияния являются неспецифическими и обусловливают рост нейригов, как правило, к ближайшей мишени. На начальных стадиях образования оіростков признаки нейротаксиса могут отсутствовать. Некоторая упорядоченность, свойственная процессам, происходящим на обоих этапах морфогенеза сплетении, определяется контактными реакциями нервных клеток.
В работе подробно описаны типы контактных взаимоотношений между нейронами. Сформулировано положение о том, что в морфогенезе нервных сплетений в культуре нейронов существенную роль играет инициация образующимися межнейропными контактами разнообразных клеточных процессов (перемещение клеточных тел нейронов, элиминация нейритов и др.), определяющих последующий вид сплетения.
Выявлено два этапа в формировании отростков и морфологического типа нейронов. Предложена классификация формирующихся в культуре отростков на первичные и вторичные, в основу которой положены способы образования отростков и их морфологическая зрелость. Показаны различные способы образования отростков, в частности, такие, как вычленение отростков из первичных ламелл, содержащих оптически плотные тяжи, и формирование шлейфного отростка. Описан феномен мультипликации оптически плотных тяжей внутри первичных ламелл.
Показано три способа элиминации нервных отростков: ретракция (втягивание в тело клетки), тотальное истончение и фрагментация. Обнаружено формирование колб рефакции на обоих концах полностью изолированного фрагмента нейрита. Детально рассмотрен процесс формирования цитосомы, как вариант фрагментации отростков. Показано, что цитосомы являются жизнеспособными и автономными образованиями, которые могут формировать небольшие нейриты.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы имеют главным образом теоретическое значение. Полученные данные представляются важными для раскрытия клеточных механизмов формирования нервных сетей в культуре изолированных нейронов, а также могут быть использованы при исследовании механизмов формирования нервной системы в эмбриогенезе.
Результаты и выводы исследований имеют и некоторое практическое значение, так как возможно их применение при изучении репаративных процессов в нервной системе. Кроме того они могут быть включены в учебные курсы по неііробнолопін.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: XL конференции студентов и аспирантов морфологических кафедр и
лабораторий Санкт-Петербургских вузов и НИИ, посвященной 125-летию со дня рождения академика В.Н. Шевкуненко (С.-Петербург, 1997); Научном совещании, посвященном 100-летию со дня рождения Н.Г.Хлошша (С.-Петербург, 1997); Международном симпозиуме, посвященном памяти академика В.Н. Черниговского (С.-Петербург, 1997); объединенном заседании трех обществ - СПб общества анатомов, гистологов и эмбриологов, СПб общества естествоиспытателей и СПб общества физиологов, биохимиков и фармакологов им. И.М. Сеченова (С.-Петербург, 1998); Научной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения профессора Е.А.Дыскина (С.-Петербург, 1998); 11 Международном симпозиуме «Структурам функции вегетативной нервной системе» (Воронеж, 1998); XVII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания метода и объекта исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 214 источников. Работа иллюстрирована 61 рисунком и 3 таблицами.