Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Гаплоидные формы растений в селекционно-генетических исследованиях. Пырей сизый Agropyron glaucum - значение и использование в селекции (Обзор литературы) 10
1.1. Гаплоидия и ее использование в селекции 10
1.1.1. Методы получения гаплоидов 12
1.1.2. Результаты и перспективы использования гаплоидов в генетике и селекции ...29
1.2. Краткая характеристика вида Agropyron glaucum 39
1.2.1. Практическое использование пырея сизого 43
1.2.2. Попытки получения гомозиготных линий пырея 48
Глава II. Материал и методы 50
Глава III. Результаты и обсуждение. закономерности гаплопродукции в культуре пыльников пырея сизого agropyron glaucum (DESF.) .59
3.1. Выбор питательной среды для индукции андрогенеза 59
3.2. Сравнительный анализ способности к гаплопродукции в кроссбредной и инбредной выборках пырея сизого 62
3.3. Изучение закономерностей гаплопродукции у пырея сизого на питательных ( средах с различными сахарами и фитогормонами 70
3.4. Изучение корреляции некоторых признаков пырея сизого со способностью к гаплопродукции в культуре пыльников 82
3.5. Обоснование введения некоторых параметров андрогенеза в качестве тестерных характеристик исходных генотипов Л. glaucum 83
3.6. Изучение влияния продолжительности холодовой обработки на стимуляцию андрогенеза у пырея сизого на разных средах
3.7. Подтверждение применимости вводимых параметров андрогенеза в опытах по отдаленной гибридизации пырея сизого с озимой пшеницей 90
3.8. Получение гаплоидных и гомодиплоидных андрогенных растений A. glaucum 92
3.9. Изучение способности к андрогенезу у гомодиплоидов, растений первого семенного поколения гомодиплоидов и родительских растений A. glaucum 99
3.10. Создание коллекции гаплоидных растений Л. glaucum 105
Заключение 109
Ф Выводы 114
Список литературы
- Результаты и перспективы использования гаплоидов в генетике и селекции
- Сравнительный анализ способности к гаплопродукции в кроссбредной и инбредной выборках пырея сизого
- Обоснование введения некоторых параметров андрогенеза в качестве тестерных характеристик исходных генотипов Л. glaucum
- Получение гаплоидных и гомодиплоидных андрогенных растений A. glaucum
Введение к работе
Актуальность проблемы. Использование методов культуры клеток и тканей для ускорения селекционного процесса и обогащения генофонда зерновых злаков приобретает в современных условиях особое значение. Уникальная способность молодых микроспор воспроизводить в условиях in vitro целостный организм открывает большие возможности экспериментального получения гаплоидных растений в культуре пыльников и обеспечивает быстрое получение гомозиготных линий из гетерогенных гибридных популяций. Методы экспериментальной гаплоидии перспективны в генетических исследованиях: геномном анализе, получении анеуплоидов, изучении действия генов на клеточном уровне. Гаплоиды являются уникальным обектом для клеточной селекции и генетической инженерии растений.
Для зерновых злаков разработано несколько методов получения гаплоидов среди которых более эффективным для массового получения растений-регенерантов является метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Этой проблеме посвящено множество экспериментальных работ и обзорных статей и монографий (Бутенко, 1975; Хохлов и др., 1976; Суханов, 1983; Дьячук, Дьячук, 1989; Picard et al., 1990). Однако, несмотря на перспективы метода культуры пыльников, использование его на многих культурах, ограничено. Так, не разработана эффективная система получения гаплоидов при культивировании пыльников различных генотипов зерновых культур (Heberle-Bors, 1998; Foroughi-Wehr, 1979). Не решены проблемы регенерации и альбинизма. Остаются неясными механизмы, обусловливающие смену программы развития микроспор с нормального пути созревания на вегетативный путь развития, через эмбриоидо- и каллюсогенез - в гаплоидное растение.
Особую трудность представляет применение гаплоидной технологии к перекрестноопыляющимся культурам, в частности, к многолетним травам. Так, попытки получения гаплоидов в культуре пыльников у растений 5 видов рода Agropyron (пырей) не привели к успеху, -' у одного из видов A. repens, было индуцировано развитие многоклеточных структур внутри микроспор, но дальнейшего развития не происходило (Zenkteler et al., 1978); у видов A. desertorum и A. eristatum удалось получить андрогенные каллюсы, которые не регенерировали (Marburger and Wang, 1988); у пырея удлиненного A. elongatum были получены альбиносные гаплоиды, но не было ни одного случая регенерации зеленых растений (Размахнин и др., 1989).
Большое селекционное значение такой культуры, как пырей обусловлена тем, что представители этого рода обладают многими ценными свойствами: высокой морозостойкостью, засухо- и солеустойчивостью, высоким содержанием белка в зерне, устойчивостью к вредителям и болезням, которые желательно было бы передать культурным злакам. Из многочисленных видов пырея, наибольшее применение в селекции нашли два: пырей удлиненный A. elongatum и, особенно, пырей сизый A. glaucum (Цицин, 1954; Синеговец, Лапченко, 1975: Li & Sun, 1980).
Пырей - перекрестноопыляющаяся культура, обладающая высокой гетерозиготностью и гетерогенностью, которые усложняют процесс расщепления гибридных форм, а также выделение форм, сочетающих нужные признаки. Отсюда вытекает необходимость использования в скрещиваниях с пшеницей, растений пырея, гомозиготных по хозяйственно-полезным признакам. Очевидно, что создание гомозиготных линий пырея позволило бы осуществить контролируемое введение
, РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ]
БИБЛИОТЕКА і
нищ і і mOmtrnf
чужеродной генетической информации в геномы культурных злаков и расширить набор методов, применяемых в селекции данной культуры в кормовом направлении. Цель и задачи исследования: Целью диссертационной работы является изучение закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре пыльников пырея сизого, разработка гаплоидной биотехнологии этой культуры. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: I. Изучить влияние компонентов питательных сред, условий культивирования и некоторых признаков донорных растений на процесс гаплопродукции в культуре пыльников пырея сизого.
Сравнить способность к гаплопродукции у кроссбредных и инбредных растений пырея.
Разработать и усовершенствовать гаплоидную биотехнологию в культуре пыльников пырея для получения морфогенных эмбриоидов, каллюсов и растений-регенерантов.
4. Использовать усовершенствованную методику андрогенеза in vitro для
тестирования генотипов пырея по гаплопродуктивным параметрам.
Создать линии андрогенных гаплоидов, удвоенных гаплоидов и родительских растений пырея сизого и изучить их скрещиваемость с пшеницей и морозостойкость.
Внедрить полученные линии в селекционные программы по созданию ценных морозостойких форм пшенично-пырейных гибридов и сортов пырея.
Новизна исследования. В популяции пырея сизого впервые обнаружены несколько генотипов (1 % от исследованных) с высокой способностью к гаплопродукции в культуре пыльников зеленых андрогенных растений хорошего качества; 10 % генотипов продуцировали альбиносы и единичные зеленые растения; 39 % генотипов продуцировали только альбиносы. Разработаны составы питательных сред, существенно увеличивающие выход андрогенеза. Показано, что применение комплексного набора сред - более предпочтительно для получения гаплоидов из большой выборки генотипов пырея, ввиду специфичности требований отдельных генотипов к средовому составу. На основе разработанной гаплоидной биотехнологии впервые получены андрогенные гаплоиды и удвоенные гаплоиды пырея сизого. Создана генетическая коллекция (более 500 растений и семенной материал) андрогенных линий пырея.
Введение новых числовых параметров андрогенеза, таких как морфогенность пыльцы М, регенерантность андрогенных структур R, средняя оценка гаплоидов Е и синтетического параметра "гаплопродуктивное качество пыльцы" Q позволило более полно характеризовать генотипы пырея по способности к андрогенезу.
Установлено, что по сравнению с кроссбредными генотипами дикого типа, в выборке инбредных генотипов пырея сизого средние числовые параметры андрогенеза в несколько раз ниже. Выдвинуто предположение, что гаплоидный геном пыльцы инбредных растений имеет в среднем более серьезные нарушения, по сравнению с кроссбредными растениями. Таким образом, для получения андрогенных линий пырея сизого предпочтительно выбирать в качестве доноров кроссбредные растения или растения с неглубоким инбридингом.
Впервые показана возможность применения метода андрогенеза в качестве теста на селекционную ценность генотипов пырея при отдаленной гибридизации с пшеницей. Генотипы пырея сизого с высоким "гаплопродуктивным качеством пыльцы" имели повышенную гибридизационную способность (больший процент завязываемости и прорастаемость гибридных зерен).
Практическая значимость. Разработаны метод создания андрогенных
гомозиготных линий и метод тестирования растений пырея сизого по
характеристикам андрогенеза. Создана коллекция линий андрогенных гаплоидов,
удвоенных гаплоидов и родительских растений пырея сизого с высокими
гаплопродуктивными параметрами. Разработана методика тестирования растений по
морозостойкости. Показано, что большая часть полученных линий обладает высокой
и сверхвысокой морозостойкостью по сравнению с лучшими образцами озимой
пшеницы. Это, в сочетании с высокой скрещиваемостью с пшеницей, позволяет с
высокой долей уверенности рекомендовать полученный коллекционный материал
* для использования в селекционно-генетических исследованиях и в селекционных
программах по созданию зимостойких форм озимой пшеницы и других культур,
скрещивающихся с пыреем, а также для создания зимостойких кормовых сортов
пырея.
* Вклад автора. Оновная часть работы сделана автором. Эксперименты по
отдаленной гибридизации проводились совметно 9 к.б.н. В.Е. Козловым.
Апробация работы. Результаты исследований по диссертационной работе
доложены на: I Всесоюзной конференции по онтогенетике высших растений
(Кишинев, 1989); Всесоюзной конференции по биотехнологии (Целиноград, 1990);
Втором Российском симпозиуме по биотехнологии (Пущине, 1993); Международной
конференции молодых ученых и специалистов "Новые методы интенсификации
сельского хозяйства" (Шортанды, 1995); XVIII Международном генетическом
конгрессе (Пекин, 1998); Международной конференции по гаплоидам кукурузы
(Краснодар, 2000); Международной научно-практической конференции "Зеленая
революция Лукьяненко" (Краснодар, 2001); 17-ой Международной конференции по
регуляторам роста растений (Брно 2001); 28-ой ежегодной конференции
американского общества регуляции роста растений (2001); б-ой Международной
конференции "Регуляторы роста и развития в биотехнологиях (Москва, 2001); VIII
генетико-селекционной школе (Новосибирск, 2001); I Международном
био технологическом конгрессе (Москва, 2002), 2-ой конференции Московского общества генетиков. и селекционеров (Москва, 2003), I Цетрально-Азиатской конференции по пшенице (Алматы, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, вхлючающего 332 работы. Содержит 24 рисунка и 15 таблиц.
Благодарности. Считаю своим долгом выразить искреннюю признательноть моему научному руководителю к.б.н. В.М. Чекурову за внимательную и потоянную поддержку исследований и консультации, всему коллективу лаборатории экспериментального мутагенеза Института цитологии и генетики СО РАН за техничекую помощь и совместное обсуждение результатов.
Результаты и перспективы использования гаплоидов в генетике и селекции
В последние десятилетия внимание ученых все более привлекает явление гаплоидии у растений, так как исследование этого явления позволяет по-новому осветить ряд теоретических проблем генетики и селекции, а также дает возможность обогатить селекцию новыми эффективными методами.
Впервые гаплоиды привлекли большой интерес генетиков, физиологов, эмбриологов растений и селекционеров после первого сообщения о получении гаплоидного растения Datura stramonium (Blakeslee et al., 1922). По данным Блэксли и Беллинга, гомозиготные диплоиды, или гомодиплоиды, можно получать из моноплоидов путем удвоения хромосом; поколения инбридинга, которые необходимы при использовании других методов, в этом случае исключаются. Равным образом это справедливо и для гомополиплоидов, хотя здесь может возникнуть необходимость в инбридинге. Авторы указали на значение гаплоидов и удвоенных гаплоидов и предложили использовать такие растения в селекции.
Наиболее полное определение понятия "гаплоид" дал С.С. Хохлов (Хохлов и др., 1976). Гаплоидами нужно считать растения, возникшие из неоплодотворенных яйцеклеток или других клеток зародышевого мешка диплоидов или функционально диплоидных полиплоидов. К гаплоидам должны быть отнесены растения с редуцированным числом хромосом, возникшим в результате соматической редукции или замещении ядра яйцеклетки ядром спермия, а также гаплоидные особи, полученные в культуре клеток и тканей.
Кроме обычно подразумеваемого получения полностью гомозиготных линий растений, гаплоиды могут быть с успехом использованы в следующих целях:
1. Гаплоиды являются подходящим исходным материалом для создания серий моносомиков, которые успешно применяются в цитогенетике и селекции растений (Zolotova, Kruglova, 2001).
2. Андрогенные гаплоиды дают возможность включать ядра в чужеродную цитоплазму (Лукьянюк, Игнатова, 1986, Миронов и др., 1994).
3. Поскольку у гаплоидов отсутствует явление доминантности, их можно использовать в мутационной селекции (Абрамов, 2000).
4. Генетическое расщепление у гаплоидов менее сложно, и для выделения определенной комбинации генов нужна сравнительно малочисленная популяция (Millonig,1976).
5. Гаплоидная фаза с последующим удвоением хромосом позволяет достичь хромосомной гомологии у аллополиплоидов; это открывает возможность получения аллозамещенных гибридов (Sathish, et al., 1995).
6. Гаплоиды можно использовать для передачи генов от полиплоидных видов диплоидным (Hause et al., 1993).
7. Особую важность имеет получение гомозиготных линий в селекции зерновых культур непосредственно из Fi, что упрощает поиск практичеси ценных рекомбинантных генотипов (Харченко, Шкловский, 1982).
8. У самоопыляющихся видов, имеющих малое число семян, таких, как пшеница или ячмень, где один гомозиготный генотип формирует основу нового сортового источника, каждый гаплоид может потенциально стать новым сортом. Для сортового статуса самоопыляющихся видов гомозиготность, с присущим ей свойством фенотипической однородности, особенно важна и для достижения ее в комбинационной селекции требуется много поколений самоопыления. Поэтому у злаков тестирование урожая обычно проводят не ранее F5f а при использовании удвоенных гаплоидов этот период сокращается до 2 лет (Simpson, Snape, 1981). Если при осуществлении некоторых из выше приведенных положений требуется одно или несколько гаплоидных растений, то в других случаях, особенно связанных с рекомбинациями, необходимо достаточно большое их число. Для селекционных целей гаплоиды должны быть генетически разноообразными, чтобы обеспечить достаточную генетическую изменчивость (Ницше, Венцель, 1980, с.9).
По способу получения все гаплоиды можно разделить на пять групп: 1) возникшие спонтанно; 2) отобранные из близнецовых растений многозародышевых семян; 3) полученные в потомстве от внутри- и межвидовых скрещиваний; 4) полученные при экспериментальном воздействии на цветок и его части или на растения и семена; 5) полученные с помощью культуры органов, тканей и клеток in vitro. Спонтанное возникновение гаплоидных растений. Спонтанное возникновение гаплоидов у растений наблюдают при естественном внутри- и межвидовом переопылении, резких перепадах температуры, фоновом облучении или под влиянием каких-либо экспериментальных факторов.
Спонтанные гаплоиды зарегестрированы у 171 вида растений, относящихся к 33 семейсвам покрытосеменных (Хохлов и др., 1976). Причины и частота возникновения гаплоидов в этих случаях неизвестны. Одна из гипотез связывает возникновение гаплоидов со стимулирующим влиянием плазмы пыльцевых трубок. Чейз (Chase, 1969) высказал предположение, что гаплоиды в природных условиях возникают вследствие преждевременного деления яйцеклетки (до оплодотворения или на начальных стадиях оплодотворения) после инактивации ингибирующего это деление вещества, которое может поступать из пыльцевых трубок.
Сравнительный анализ способности к гаплопродукции в кроссбредной и инбредной выборках пырея сизого
У перекрестноопыляющихся видов линии из гаплоидов применяются в качестве родительских компонентов простых или двойных гибридов. В селекции перекрестников, в частности кукурузы, удвоенные гаплоиды могут иметь большое значение и даже при 10% диплоидизации дают основание для развития этой техники (Chase, 1974). Ценность гаплоидии состоит в том, что в гаплоидном состоянии происходит потеря генотипов, несущих летали и удвоенные гаплоиды в результате имеют повышеную комбинационную ценность. Выявлено, что некоторые из них отличались высокой комбинационной способностью при хорошей семенной продуктивности (Головин, 1981). Коэффициент варьирования продуктивности, высоты растений и прикрепления початка у дигаплоидов выше, чем у аналогичных линий от самоопыления. Применение удвоенных гаплоидов у кукурузы не только ускоряет улучшение популяции относительно рекуррентной селекции, но и эквивалентно S- селекции, считающейся наиболее эффективным внутрипопуляционным методом улучшения (Choo & Kannenberg, 1978; Choo et al., 1982, 1985).
Китайскими исследователями проведены специальные исследования по возможности использования гаплоидов в селекции. При культивировании пыльников пшеницы в течение 8 дней при 33, а затем при 24 не только повышалась частота каллюсообразования, но и частота образования зеленых растений. Выдерживание пыльников при 1-4 первые 48 ч также повышало частоту каллюсообразования. При культивировании пыльников растений F1 получено значительное разнообразие фенотипов. Подтверждена высокая частота рецессивных признаков у андрогенных растений. Получены 20 сортов пшеницы и 80 сортов и перспективных линий риса, новые сорта табака, стручкового перца, продуктивные линии кукурузы, гевеи, сахарного тростника (Zeng Junzhi, 1983; Ни Han, 1986; Li Chun ling et al., 1990).
Во Франции создан сорт озимой пшеницы Флорин, на выведение которого было затрачено, по крайней мере, на четыре года меньше, чем потребовалось бы при традиционных методах селекции. Авторы сорта считают, что высокая гомозиготность линий, полученных в культуре пыльников, не является вредной и на этой основе можно быстро получать высокоурожайные сорта (Buiser de J. et al., 1987).
В Болгарии методом культуры пыльников получен сорт риса Марианна (Бояджиев, 1990), и создан сорт табака Биопреслава, успешно внедряемый в производство (Атанасов, 1993). Этим же методом в Венгрии получен сорт риса Дама (Heszky Laszlo et al., 1992). В Канаде выведен сорт яровой пшеницы МакКензи (Kartha & Graf, 1999).
Метод "бульбозум" широко применяется в селекции ячменя. Так, в Канаде за 5 лет был создан дигаплоидный сорт Минго (Но & Jones, 1980). В 1984 г. Лицензирован второй дигаплоидный сорт ячменя Rodeo (Cambell et al., 1984). В Великобритании в течение пяти лет с минимальными трудовыми затратами было получено 6 000 дигаплоидных линий ячменя. Итогом явилось создание сорта Gwilan (Choo et al.,1985). В Одессе (ВСГИ) методом гаплопродюсера созданы 2 сорта ячменя - Исток и Одесский 115.
При культивировании пыльников кукурузы получено 20 эмбриогенных клеточных агрегатов из 5000 пыльцевых эмбриоидов. Два эмбриогенных клона характеризовались быстрым ростом и способностью к индукции растений в течение двух лет. После 15 пассажей получено более 10000 зеленых растений, из которых 250 высажено в поле; 140 из них выжили, 35 растений достигли стадии созревания, 20 завязали семена при самоопылении. Во втором поколении наблюдали высокую гомозиготность среди растений одной линии и различия среди линий от разных растений. При изучении межлинейных гибридов, созданных при гибридизации чистых линий, образованных из эмбриогенных клонов, наблюдали явное проявление гетерозиса.
Культура пыльников - простое и эффективное средство получения разнообразных анеуплоидов (Ни Han et al., 1982). Их выход резко увеличивается при воздействии высокой температуры. Так, у мягкой пшеницы, культивирование пыльников при 24 дает 6 типов анеуплоидов, а при 32-34 - 13 типов. Появление тело- и дицентриков свидетельствует об изменениях не только в числе, но и в структуре хромосом и возможности использования культуры пыльников для внедрения желательных генов в культуру вида, что важно для гибридов.
Используя гаплоиды у ячменя (до удвоения числа хромосом), удается быстро отобрать эффективные гены устойчивости к мучнистой росе и исключить при этом эффект взаимодействия генов (Powell et al., 1984). Аналогичные работы, проведенные на пшенице, позволили усилить признак устойчивости к мучнистой росе (Hadwiger & Heberle-Bors, 1986) и другим болезням (Paris & Picard, 1986).
Возрастает эффективность отбора рекомбинантов, устойчивых к вирусу желтой мозаики, из F1 от скрещивания устойчивых форм с восприимчивыми. При культивировании пыльников от таких гибридов удалось в среднем получить по 3,6 зеленых растений на 1000 пыльников, из которых 62% оказались нечувствительными (Foroughi-Wehretal., 1982).
Но особую ценность гаплоиды представляют при работе с количественными признаками. В настоящее время они уже используются для оценки числа генов, контролирующих количественные признаки (Choo, 1981; Simpson & Snape, 1981; Jinks et al., 1985; Caligari et al., 1986), а также для повышения эффективности отбора по ним. Например, у риса удалось выделить урожайные линии с высоким содержанием белка (Schaeffer et al., 1984).
Обработкой мутагенами культуры гаплоидов табака получили полиморфную популяцию, отбор в которой проводили на высокий фотосинтез в условиях высокой освещенности, адекватной температуры, питания и влажности при низком содержании СОг. Выжившие в таких условиях растения размножали. Скорость роста, величина листовой поверхности, продукция биомассы и неттоассимиляция у таких растений были значительно выше, чем у контрольных растений (Medrano, 1985; Schell & Wernsman, 1984).
Обоснование введения некоторых параметров андрогенеза в качестве тестерных характеристик исходных генотипов Л. glaucum
В первых экспериментах по выбору эффективных сред для индукции андрогенеза у пырея мы испытали 7 питательных сред, различающихся по концентрации сахарозы и составу фитогормонов и 2 среды с различным содержанием картофельного экстракта и сахарозы (табл. 1). Выбор сред проводили исходя из литературных данных, как наиболее эффективных для индукции андрогенеза у злаков и других культур. Некоторые из этих сред были нами модифицированы.
В качестве доноров были выбраны 9 хорошо развитых растений различных генотипов пырея сизого, из коллекции, выращиваемой в поле. С каждого растения срезали по 3 колоса и проводили холодовую предобработку в течение 10 дней, после которой пыльники инокулировали равномерно на 9 испытуемых сред. Через 7-10 дней после инокуляции пыльников провели выборочный цитологический анализ пыльников в различных вариантах опыта. Было выявлено, что только в вариантах №8 и №9 (табл.1) внутри микроспор происходит развитие многоклеточных, ярко окрашиваемых кармином структур, причем, в варианте №8 с 3% сахарозой и 3% картофельного экстракта не было обнаружено выхода многоклеточных структур через разрыв оболочки микроспоры (рис.5а). Вместо этого, в единичных случаях наблюдали частичное выдавливание многоклеточной структуры наружу сквозь пору (рис. 5Ь). В варианте №9 с 9% сахарозой и 9% картофельного экстракта развитие многоклеточных структур наблюдали у большего числа микроспор, причем выход таких структур наружу происходил через разрыв оболочки микроспоры (рис. 5с).
Развитие многоклеточных структур в культуре пыльников A. glaucum а), Ь) - при индукции на среде с 3% сахарозой и 3% картофельным экстрактом; с) на среде с 9% сахарозой и 9% картофельным экстрактом. Стрелка показывает лопнувшую оболочку микроспоры. МС - многоклеточная структура.
Через 4 недели после начала инкубации было обнаружено появление новообразований на пыльниках в вариантах опыта №8 и №9 (табл. 1; рис. 6), причем в варианте №9 процент эмбриогенных пыльников было на порядок выше, чем в варианте №8. В остальных вариантах (№№ 1-7) развития новообразований на пыльниках не было.
Результаты эксперимента показывают, что пырей сизый - культура более требовательная к условиям культивирования, чем пшеница, у которой индукция андрогенеза наблюдается при низких концентрациях сахарозы и без обязательного присутствия в среде картофельного экстракта. Вывод из полученных результатов следует однозначный для индукции андрогенеза у пырея сизого требуются одновременно высокая концентрация сахарозы и картофельного экстракта. Мы предполагаем, что это обусловлено тем, что пырей является перекрестноопыляющейся культурой, а у перекрестников пыльца имеет более толстую и прочную оболочку, чем у самоопыляющихся видов растений. Для разрыва такой оболочки, собственной силы многоклеточным структурам недостаточно и требуется дополнительная сила, обеспечиваемая высоким осмотическим давлением, привносимым высокими концентрациями сахарозы и картофельного экстракта. Положительный вклад картофельного экстракта в индукцию андрогенеза, видимо связан еще и с содержанием в нем биологически активных веществ, что требует отдельного исследования.
После того, как мы выяснили, что среда П-2 эффективна для индукции андрогенеза в небольшой выборке пырея сизого, мы исследовали способность к андрогенезу в двух выборках из 42 кроссбредных растений дикого типа (1о) и 32 инбредных растений пырея 2 и 3 поколений инбридинга (1г-з) из лабораторной коллекции, выращиваемой в поле.
В результате исследования было показано широкое варьирование процента индуцибельных пыльников у разных генотипов от 0 до 80, и числа эмбриоидов и каллюсов (ЭК) на 100 высаженных пыльников от 0 до 180. Для удобства, эти два важных числовых параметра андрогенеза мы объединили и обозначили как: F = fe/fa - частота индукции андрогенеза для данного генотипа, где fe - количество ЭК на 100 культивируемых пыльников, fa - процент андрогенных пыльников. Например, если F = 30/20, это значит, что у данного генотипа индуцировано 30 ЭК на 20 из 100 высаженных пыльников. Для выборки из п растений вычисляется средняя частота андрогенеза Fm: I fe / Zfa Fm = / n / n
В таблице 2 приведены усредненные параметры андрогенеза в двух выборках кроссбредных и инбредных растений пырея. Более высокая андрогенезная активность . наблюдается в кроссбредной выборке, причем, если процент андрогенных генотипов в lo был только на 10% выше, чем в Ь-з, то средняя частота андрогенеза Fm была выше в 2-2.5 раза. Так, как в результате индукции андрогенеза развитие микроспор может происходить в виде каллюсов или эмбриоидов (визуально дифференцированных, согласно Ногпег & Street, 1978), такие структуры были нами подсчитаны для каждого генотипа и вычислены средние значения для обеих выборок. На рисунке 7 приведены фотографии типичных каллюсов и эмбриоидов, наблюдаемых в процессе индукции. Результаты подсчета показали, что в обеих выборках эмбриоиды индуцируются чаще, чем каллюсы, но в кроссбредной выборке разница была более значительной. Принимая во внимание, что эмбриоидогенез является более дифференцированным процессом, чем каллюсогенез, мы ввели термин «коэффициент морфогенности пыльцы» (М) для данного генотипа, или для выборки генотипов:
Получение гаплоидных и гомодиплоидных андрогенных растений A. glaucum
Полученные в настоящем исследовании факты хорошо подтверждают представления о том, что андрогенез in vitro является специфическим типом развития многоклеточных структур из мужских половых клеток растений, который осуществляется в результате реализации генетической программы спорофитного развития компетентных клеток микроспор. Реализация этой программы развития зависит от целого комплекса разнообразных факторов: генотипа и физиологического состояния донорного растения, условий предобработки, состава питательной среды и др. От сочетания этих факторов зависит частота формирования андрогенных структур и растений-регенерантов.
На основе изучения взаимодействия генотип-среда и цитологических особенностей процессов морфогенеза нам удалось создать модельную систему культуры изолированных пыльников пырея сизого Адгоругоп glaucum in vitro и усовершенствовать гаплоидную технологию, которая может быть использована в практической селекции и генетической инженерии пырея и других растений.
Мы установили, что одним из главных факторов, обусловливающих специфичность процессов каллюсо- и эмбриоидогенеза при культивировании пыльников является степень инбредности донорных растений. Так, при сравнении способности к андрогенезу in vitro у кроссбредных и инбредных растений пырея сизого нами показано, что выход андрогенеза у кроссбредных растений был значительно более высок, чем у инбредных. Частота индукции эмбриоидов и каллюсов в кроссбредной выборке растений была в 2-2.5 раза выше, чем в инбредной. Важно отметить, что при этом преобладал эмбриоидный тип развития, тогда, как у инбредных растений развитие чаще происходило по менее дифференцированному пути - через каллюсогенез. Процент генотипов, регенерировавших гаплоидные растения у кроссбредных растений был выше в 1.8 раз, а средняя оценка гаплоидов - в 4 раза. Полученные данные показывают, что микроспоры у инбредных растений имеют значительно меньшую способность к морфогенезу, чем у инбредных. Это заставляет по-новому взглянуть на феномены инбредной депрессии и гетерозиса. Важным для практики является по вывод, что для получения андрогенных линий пырея сизого целесообразно брать в качестве доноров кроссбредные растения, или растения с неглубоким инбридингом.
Другим важным фактором оказалось взаимодействие генотип-среда в культуре пыльников пырея. Для различных генотипов были характерны специфичность реакции индукции андрогенеза и регенерации гаплоидов на определенных питательных средах. В то же время, нами найдены несколько комбинаций индукционных и регенерационных сред, обеспечивающих высокий выход андрогенеза у большего числа генотипов. Так, было показано, что применение индукционных сред, содержащих такие дисахариды, как мальтоза и мелибиоза, и регенерационных сред, содержащих фитогормоны: НУК, гиббереловую кислоту и кинетин значительно увеличивает выход андрогенеза по сравнению со стандартными условиями индукции на среде П-2 с сахарозой и регенерации на безгормональной среде. Превышение составило: по проценту андрогеных генотипов - в 1.5 раза, по проценту генотипов, давших зеленые гаплоиды - в 4.5 раза. Выявлено, что мальтоза и мелибиоза индуцируют интенсивное андрогенное развитие, с прямым морфогенезом на индукционной среде у большинства микроспор в составе пыльника, в то время, как на среде с сахарозой замедленное андрогенное развитие наблюдалось у единичных микроспор.
Анализ структуры молекул испытанных дисахаридов показал, что высокий индукционный эффект мальтозы и мелибиозы обусловлен наличием в их составе 0-глюкозы, которая выполняет в клетках растений важную функцию - связывание гормона стресса АБК, в неактивный комплекс (Phillips, 1971; Dorfling, 1972; Burden, Taylor, 1973; Milborrow, 1972; 1974a; 1974b). АБК является важнейшим полифункциональным фитогормоном и играет ключевую роль в процессе созревания микроспор и превращения их в зрелую пыльцу (Beaumont et al., 1995). Являясь антагонистом гиббереловой кислоты, которая стимулирует гидролиз крахмала ферментами: а- и 3- амилазами, АБК способствует накоплению крахмала в созревающей пыльце. Отсюда мы сделали важный вывод: используя в составе индукционных сред (3-глюкозу или другие сахара, в которых она присутствует, можно затормозить синтез крахмала в микроспорах. Мы предположили, что это является отправной точкой, наблюдаемого в эксперименте перевода процесса развития микроспор с нормального пути созревания на путь эмбриоидо- и каллюсогенеза.
Что касается механизмов индукции андрогенеза у пырея сизого на среде с сахарозой и другими сахарами, не содержащими В-глюкозу, то рядом исследователей получены экспериментальные данные о наличие в пуле нормальных микроспор немногочисленной группы так называемой аномальной пыльцы, или Р-зерен (Sunderland, 1983; Sunderland, Wicks, 1971; Sunderland et al., 1975; Sunderland, Evans, 1980). Считается, что именно аномальные микроспоры на питательных средах с ауксинами, типа 2.4D, НУК и др. способны к развитию андрогенных структур. В пользу этого свидетельствуют и наши собственные наблюдения за развитием микроспор в процессе культивирования, в результате которых было показано, что только единичные микроспоры дают начало многоклеточным структурам на сахарозной среде. В то же время наблюдаемое нами в эксперименте массовое развитие новообразований у микроспор на средах с S-глюкозосодержащими сахарами указывает на способность таких Сахаров индуцировать андрогенез у большинства нормальных микроспор в составе пыльника.
Следует обратить внимание, на то, что генотипы A.glaucum, обладающие высокой частотой эмбриоидо- и каллюсогенеза (ЭК-генез) на среде с сахарозой, имели пониженные фенотипические и хозяйственно-важные характеристики. Падение наблюдалось по таким параметрам, как вегетативная мощность, выживаемость и самофертильность. В то же время, у таких генотипов был повышен процент колосьев с аномальной формой. Анализ регенерационных характеристик в культуре пыльников показал, что гаплоиды с высокими оценками могут быть получены только от генотипов пырея сизого с относительно низкой частотой ЭК-генеза на индукционной среде с сахарозой. Обнаружена обратно пропорциональная зависимость оценок гаплоидов от индуцибельности новообразований.
