Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Визуализация и характеризация наночастиц в суспензии 16
1.2. Визуализация взаимодействия наночастиц с клетками 20
1.3. Проникновение наночастиц в клетки посредством прямого пересечения мембран 23
1.4. Пути поглощения веществ клетками 24
1.5. Проникновение наночастиц в клетки посредством эндоцитоза
1.5.1. Контакт наночастиц с плазматической мембраной клеток 31
1.5.2. Клатрин-зависимый эндоцитоз наночастиц 34
1.5.3. Кавеолин-зависимый эндоцитоз наночастиц 36
1.5.4. Клатрин-кавеолин-независимый эндоцитоз наночастиц 36
1.5.5. Фагоцитоз наночастиц 37
1.5.6. Макропиноцитоз наночастиц 39
1.5.7. «Судьба» наночастиц в клетках
1.6. Токсические эффекты наночастиц 40
1.7. Заключение 44
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.2. Приборы 47
2.3. Синтез наночастиц 47
2.4. Модификация наночастиц 48
2.5. Методы характеризации наночастиц 49
2.6. Изучение поведения наночастиц в культуральных средах 50
2.7. Работа с животными з
2.8. Культуры клеток 51
2.9. Обработка наночастиц для исследований на культурах клеток.. 52
2.10. Исследование токсичности наночастиц in vitro 53
2.11. Изучение взаимодействия наночастиц с клетками методом световой микроскопии 54
2.12. Изучение взаимодействия наночастиц с клетками методом просвечивающей электронной микроскопии 55
2.12.1. Культивирование клеток 55
2.12.2. Приготовление препаратов для ультраструктурного исследования 56
2.13. Изучение способности наностержней золота вызывать фототермолиз в клетках ВНК-21 и В16 при облучении лазером in vitro
2.14. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз меланомы мыши В16 при облучении лазером in vivo
Глава 3. Результаты 60
3.1. Физико-химические характеристики препаратов наночастиц 60
3.2. Поведение наночастиц палладия в культуральных средах 62
3.3. Поведение наносфер и наностержней золота в культуральных средах 66
3.4. Изучение ультраструктурных характеристик суспензий наносфер и наностержней золота в культуральных средах 69
3.5. Морфология культур клеток, использованных в работе 73
3.6. Взаимодействие наносфер золота с перитонеальными макрофагами и клетками культуры MDCK 75
3.7. Взаимодействие наночастиц палладия с клетками культуры MDCK и с перитонеальными макрофагами 80
3.8. Взаимодействие наносфер и наностержней золота с клетками культур ВНК-21 и В16 85
3.9. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз в клетках ВНК-21 и В16 при облучении лазером in vitro 92
3.10. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз меланомы мышей В16 при облучении лазером in vivo 95
Глава 4. Обсуждение результатов 101
Заключение 114
Выводы 117
Список литературы 1
- Пути поглощения веществ клетками
- Методы характеризации наночастиц
- Поведение наночастиц палладия в культуральных средах
- Взаимодействие наночастиц палладия с клетками культуры MDCK и с перитонеальными макрофагами
Введение к работе
Актуальность. С развитием нанобиотехнологии и нанобиомедины связывают перспективы создания принципиально новых лекарственных и диагностических препаратов (Menon et al. 2013; Mieszawska et al. 2013; Kumar et al. 2013; Schrofel et al. 2014; Shah et al. 2014). Количество публикаций, сообщающих о создании наночастиц (НЧ) для медицинских целей, постоянно растет, однако, сообщения о внедрении нанопрепаратов в медицинскую практику единичны, что связано, в том числе, с отсутствием знаний о фундаментальных аспектах взаимодействия НЧ с клетками и что определяет актуальность данной работы.
Внедрение наноматериалов во все сферы жизнедеятельности человека приводит к увеличению контактов людей и животных с наноразмерными объектами, которые могут обладать мутагенными, канцерогенными и другими негативными свойствами (Супотницкий 2013; Khlebtsov and Dykman 2011; Maurer-Jones et al. 2013). В окружающей среде нарастает содержание НЧ металлов, являющихся результатом деятельности человека (Whiteley and Murray 2003; Buzea et al. 2007; Leopold et al. 2008; Roy et al. 2014). Существенный вклад в этот процесс вносят НЧ, выделяемые при работе автомобильных двигателей. Известно, что вдыхание загрязненного воздуха, содержащего микро- и наноформы металлов, оказывает вредное действие на здоровье людей (Kampa and Castanas 2008). Механизмы воздействия на клетки антропогенных НЧ неизвестны, что делает данную работу актуальной.
Размеры НЧ сопоставимы с размерами макромолекул и клеточных структур, что определяет принципиально иной характер взаимодействия НЧ с клетками, отличный от взаимодействия с ними микро- и макрообъектов. В настоящее время идет накопление знаний о том, какие НЧ способны проникать в клетки и каким образом, какое действие они оказывают на клетки, как изменяются НЧ внутри клеток и с какими клеточными структурами они взаимодействуют. Изучение взаимодействия НЧ с клетками на нано-уровне, который обеспечивает электронная микроскопия, необходимо, поскольку без понимания того, как ведут себя НЧ в клетках, невозможно найти пути управления этим поведением, оценить возможные риски применения НЧ и их потенциальные позитивные эффекты.
Цель исследования. Целью данной работы явилось изучение взаимодействия НЧ золота и палладия с макрофагальными, эпителиальными, фибробластоидными и опухолевыми клетками.
Задачи.
-
Изучить структурные и физико-химические параметры препаратов наносфер, наностержней золота и НЧ палладия в различных жидкостях, включая культуральные среды.
-
Исследовать взаимодействие наносфер золота и НЧ палладия с перитонеальными макрофагами первичной культуры и в условиях организма.
-
Исследовать взаимодействие наносфер золота и НЧ палладия с клетками эпителиальной культуры MDCK.
-
Изучить взаимодействие наностержней золота с клетками культуры ВНК-21 и клетками меланомы В16.
-
Исследовать способность наностержней золота вызывать фототермолиз клеток меланомы В16 в культуре и на животных при облучении лазером.
Научная новизна. В данной работе впервые описаны механизмы проникновения наносфер (НЧЗ), наностержней золота (НСЗ) и наночастиц палладия (НЧП) в эукариотические клетки на ультраструктурном уровне. Выявлены прямое пересечение НЧП мембран клеток MDCK и эндоцитоз НСЗ посредством циркулярных дорзальных складок. Впервые показано, что модификация НСЗ не влияет на механизм их эндоцитоза, но определяет скорость связывания с клеточной поверхностью и накопление в клетках. Установлено накопление НЧЗ и НСЗ в фагосомах и лизосомах. Впервые показана определяющая роль типа клеток в реализации механизмов взаимодействия НЧП с клетками. Выявлено накопление НЧП в ядре и, в меньшей степени, в цитоплазматических органеллах эпителиальных клеток и установлена связь между пересечением клеточных мембран НЧП и их повреждающим действием на эпителиальные клетки. Впервые показан фототермический эффект НСЗ, покрытых линейным полиэтиленимином, на меланоме мышей, открывающий новые перспективы их использования в ветеринарной и медицинской практике.
Научно-практическая значимость исследования. В работе получены новые фундаментальные знания о поведении НЧЗ, НСЗ и НЧП в разных жидкостях, механизмах их проникновения в эукариотические клетки и о «судьбе» этих НЧ в клетках. Результаты исследования могут быть использованы (1) при разработке систем адресной доставки медицинских препаратов на основе НЧЗ и (2) в разработке методов лечения поверхностных опухолевых образований с помощью направленного фототермолиза клеток с применением НСЗ и лазерного облучения. Результаты исследования
взаимодействия НЧП с макрофагами и эпителиальными клетками раскрывают механизмы потенциального вреда антропогенных НЧ и позволяют прогнозировать «судьбу» этих НЧ в условиях организма. Разработанные экспериментальные модели могут быть использованы для изучения биологических аспектов взаимодействия НЧ других металлов. Положения, выносимые на защиту.
-
Поверхностный заряд НЧЗ и НСЗ, определяемый их модификацией, влияет на скорость установления контакта НЧ с клеточной поверхностью и, соответственно, напоглощение НЧ клетками.
-
НЧЗ и НСЗ интернализуются посредством тех типов эндоцитоза, которые активны в исследуемых клетках; перемещаются по эндосомально-лизосомальному компартменту и остаются в фагосомах и лизосомах, не повреждая клетки и клеточные структуры.
-
НЧП проникают в эпителиальные клетки путем прямого пересечения плазмалеммы, а макрофаги - с помощью эндоцитоза. Пересечение клеточных мембран НЧП приводит к повреждению клеточных структур, отеку и деструкции клеток.
-
Облучение лазером НСЗ, модифицированных линейным полиэтиленимином, вызывает фототермолиз клеток меланомы В16 в культуре и на животных.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях рекомендованного перечня ВАК. Материалы диссертации представлены на 8-й международной конференции по биоинформатике, регуляции генома и структурно-системной биологии (Новосибирск, 2012), 2-й международной школе-конференции «Прикладная нанотехнология и нанотоксикология» (Иркутск, 2013), 11-й международной научной конференции (Владимир, 2014), 21-м конгрессе по ликвидации последствий химических и биологических воздействий (Тбилиси, Грузия, 2014) и 1-й международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «OpenBio» (Новосибирск, 2014).
Вклад автора. Эксперименты по светооптическому и электронно-микроскопическому изучению взаимодействия НЧ с клетками in vitro и in vivo, а также характеризация НЧ были выполнены автором самостоятельно.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения и заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в котором
Пути поглощения веществ клетками
Наночастицы, используемые в биомедицинских исследованиях, синтезируют из разнообразных материалов: золота, серебра, железа, титана, меди, кремния и др. Исследователи разработали методы получения НЧ разной формы и сложности: сферические, нанооболочки, наностержни, нанотрубки, нанозвезды, нанокоробочки и др. Наиболее распространены в биомедицинских исследованиях НЧ, приготовленные из инертного для организма металла золота (Pissuwan et al. 2008; Menon et al.,2013; Shah et al. 2014). Методы синтеза НЧ представляют собой отдельную область науки, представленную сотнями публикаций, которая не является предметом наших исследований и не будет освещена в данном обзоре.
Важной характеристикой препаратов НЧ, предназначенных для применения в биомедицинских исследованиях, является соответствие критериям безопасности и стандартизации (Каркищенко 2009). Изучение препаратов НЧ начинают с их визуализации, определения размеров и формы. Увидеть НЧ можно с помощью атомно-силовой, растровой и просвечивающей электронной микроскопии (Красовский и др. 2009). Для определения размеров НЧ используют также непрямые методы, в частности, динамическое светорассеяние и спектроскопию. Метод динамического светорассеяния (ДСР) наиболее распространен в научной практике, однако, он позволяет установить лишь гидродинамический размер НЧ в диапазоне от 5 мкм до 3 нм, который может существенно отличаться от истинного (Arnida et al. 2011; Mikhaylov, Vasiljeva 2011). Достоинством этого метода является возможность получения интегральных оценок препарата НЧ и определение соотношения НЧ разных размеров (Красовский и др. 2009). Оптимальным подходом к характеризации препаратов НЧ является сочетание непрямых методов и электронной микроскопии.
Сведения о физико-химических характеристиках НЧ являются необходимой отправной точкой в нанобиомедицинских исследованиях, а их набор определяется задачами исследования и возможностями приборной базы. Необходимым и немаловажным в характеризации препаратов НЧ является изучение их дисперсности и ее изменений в зависимости от величины рН, заряда НЧ, а также исследование сохранения структуры и размеров НЧ в биологических средах (Perez-Juste et al. 2005; Jiang et al. 2009; Samimet al. 2011).
Синтез НЧ, как правило, сопровождается использованием агрессивных химических веществ и сред с высокой кислотностью, что делает полученные препараты НЧ несовместимыми с живыми клетками. Для использования синтезированных НЧ в медико-биологических исследованиях необходима специальная подготовка, обеспечивающая получение высокодисперсной суспензии НЧ в растворе, имеющем физиологическую величину рН (7,2-7,4). Такой препарат будет пригоден для внесения в культуры клеток и для введения животным, однако, его получение сопряжено с рядом сложностей. Так, рутинное разведение препаратов НЧ фосфатным буфером зачастую приводит к их выраженной агрегации с образованием макроформ и, соответственно, потерей нано-свойств (Арсентьева и др. 2007; Jiang et al. 2009). Для повышения биосовместимости препаратов НЧ с клетками и уменьшения агрегации используют добавление сыворотки крови (Elder et al. 2007; Pelka et al. 2009) или сывороточного альбумина (Casals et al. 2010; Dominguez-Medina et al. 2013). Очевидно, это приводит к изменению физико-химических свойств НЧ. Опубликованы многочисленные исследования поведения НЧ в таких растворах, целью которых является стремление понять, как будут изменяться свойства НЧ при попадании в культуру клеток, а также в кровь животных и человека. Кровь и культуральная среда, в которой растут клетки, являются сложными многокомпонентными системами, содержащими электролиты, белки, липиды, различные питательные вещества, метаболиты и другие активные соединения. Понимание химических и физических аспектов взаимодействия НЧ с компонентами крови и культуральной среды является первоочередной задачей при изучении взаимодействия НЧ с живыми организмами.
В условиях организма и в культуре клеток на поверхности НЧ могут адсорбироваться ионы или биомолекулы с образованием слоя разной толщины, который называется, соответственно, ионной (Xu et al. 2012) ИЛИ белковой «короной» (Cedervall et al. 2007А; Monopoli et al. 2011). Формирование «короны» вокруг НЧ неизменно ведет к увеличению их размеров и изменению композиционного состава. Изменение размеров НЧ можно зарегистрировать путем измерения их гидродинамического диаметра с помощью метода динамического светорассеяния, однако без электронно-микроскопического исследования будет невозможно понять, связан этот прирост с появлением «короны», или обусловлен агрегацией НЧ (формирование кластеров) (Schaffler et al. 2013). С помощью электронного микроскопа можно прямо измерить размер отдельных частиц и толщину «короны» на их поверхности, а также оценить степень агрегации НЧ. Сочетание этих двух методов позволяет достаточно точно описать поведение НЧ при их внесении в ту или иную биологическую жидкость.
О способности НЧ адсорбировать на своей поверхности белки было известно давно, однако особое внимание этому факту стали уделять в последние 10-15 лет, что связано с ростом числа исследований биологических свойств наночастиц (Cedervall et al. 2007A; Cedervall et al. 2007Б). Было замечено, что одни и те же наноматериалы могут вызывать различные биологические реакции в зависимости от того, присутствует или отсутствует на их поверхности «корона» (Lesniak et al. 2012). Кроме того, условия проведения экспериментов могут влиять на уровень поглощения НЧ клетками и обуславливать различия во внутриклеточной локализации НЧ и их воздействии на клетки (Maiorano et al. 2010).
Формирование макромолекулярного слоя на поверхности НЧ сопровождается смещением инфракрасного пика поверхностного плазмонного резонанса, изменением поверхностного заряда и увеличением гидродинамического диаметра (Casals et al. 2010), которые регистрируются методами динамического светорассеяния, плазмонного резонансного светорассеяния и спектроскопии поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях света (Maiorano et al. 2010). Электрофорез в полиакриламидном геле и масс-спектроскопия позволяют определить основные компоненты «короны» (Casals et al. 2010; Maiorano et al. 2010). При характеризации «короны» НЧ нередко определяют и такие параметры, как скорость ее формирования и время «жизни» (Lesniak et al. 2012).
Методы характеризации наночастиц
Клетки культуры В16 и ВНК-21 высевали в 12-луночные культуральные планшеты (1х105 клеток/лунку) и инкубировали в течение 24 ч в 1 мл среды DMEM с сывороткой. Затем среду отбирали и добавляли порцию свежей. В экспериментальные лунки добавляли ПЭИ-НЧЗ, БСА- и ПЭИ-НСЗ в концентрации 0,1 мкг/л. Планшеты помещали в инкубатор на 30 мин, 3 и 24 ч. Необработанные НЧ клетки служили контролем.
Клетки культуры MDCK высевали в 12-луночные культуральные планшеты (2x105 клеток/лунку в 1 мл среды) и инкубировали в течение 24 ч. По истечении этого времени среду заменяли и в экспериментальные лунки добавляли подготовленные НЧЗ или НЧП в концентрации 0,3 мкг/л, после чего планшеты инкубировали 10, 30 мин, 3, 5 и 24 ч.
По окончании инкубации клетки культур MDCK, В16 и ВНК-21 снимали с помощью трипсина (200 мкл на лунку), который инактивировали 500 мкл среды с 10% сыворотки, переносили в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин).
Для изучения взаимодействия НЧ с перитонеальными макрофагами in vitro макрофаги высевали в чашках Петри диаметром 25 мм (3x106 клеток/чашку) в 3,5 мл среды DMEM с 10 % сыворотки. Через сутки среду заменяли на свежую и добавляли подготовленные НЧЗ или НЧП в концентрации 0,1 мкг/л. Контролем служили необработанные НЧ клетки. Через 10 и 30 мин, 3, 5 и 24 ч инкубации клетки снимали культуральным скребком, переносили в пробирки объемом 1,5 мл и осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин).
Для изучения взаимодействия НЧЗ с перитонеальными макрофагами in vivo мышам линии СВА после предварительной стимуляции 2%-ным раствором тиогликолята (как описано выше) вводили в перитонеальную полость подготовленную суспензию НЧЗ (0,1 мкг/мышь в 0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl). Забор клеток из перитонеальной полости проводили через 10, 30 мин, 3, 5 и 24 ч после введения НЧЗ путем смыва 0,9%-ным раствором NaCl. Далее клетки осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин). Контролем служили клетки, взятые от мышей, которым не вводили НЧЗ.
Фиксированные осадки промывали 3 раза средой и дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия. Через 1 ч осадки промывали 3 раза средой и последовательно добавляли 30%-ный раствор этанола на 5 мин; 2 раза 50%-ный раствор этанола по 5 мин; 3 раза 70%-ный раствор этанола по 10 мин и 3 раза 96%-ный этанол по 10 мин. Затем 4 раза промывали абсолютным ацетоном по 15 мин. Далее осадки на 24 ч оставляли в пропитке (смесь ацетона со смолой 1:1). Для приготовления смолы смешивали 7,50 мл аралдита (Araldite 502), 11,25 мл смолы эпон (SPI-PON 812) и 27,75 мл смягчителя (DDSA). После высушивания на воздухе осадки помещали в конические формочки и заливали смолой, смешанной с катализатором (DMP-30, 100 мкл на 5 мл смолы). Для полимеризации образцы выдерживали 7 ч при 30С, 12 ч при 42С и 2 суток при 54С. На ультрамикротоме делали ультратонкие срезы, которые контрастировали растворами уранилацетата и цитратом свинца. Часть срезов не контрастировали для лучшей визуализации НЧ небольшого размера. Изучали ультратонкие срезы с помощью ПЭМ.
Клетки В16 и ВНК-21 (по 5хЮ4 клеток/лунку в 0,5 мл DMEM) высевали в 48-луночные культуральные планшеты, на дно которых клали покровные стекла, и культивировали в течение 24 ч до формирования монослоя с плотностью 70-80%. В контрольных лунках заменяли среду. В экспериментальных лунках отбирали среду и добавляли суспензию НСЗ, модифицированных БСА или ПЭИ, до концентрации 0,05 мкг/л. Через 24 ч клетки облучали лазером. Параметры облучения: полупроводниковый лазер ближнего ИК диапазона с длиной волны 808 нм или 650 нм при плотности мощности лазерного излучения 0,7 Вт/см , продолжительность воздействия -15 мин при комнатной температуре. Вне СОг-инкубатора контрольные и экспериментальные образцы находились одинаковое время.
Было сформировано 4 группы (по 8 лунок в каждой группе): (1) контрольные клетки; (2) клетки, обработанные НСЗ; (3) клетки, облученные лазером; (4) клетки, обработанные НСЗ и облученные лазером. Сравнение лазеров с разными длинами волн проводили на культуре клеток ВНК-21 (соответственно, исследовалось 8 групп). Клетки меланомы В16 облучали только лазером с длиной волны 808 нм.
После облучения препараты готовили для светооптического анализа тремя способами: (1) клетки на покровных стеклах (по 2 стекла на группу) сразу же окрашивали трипановым синим и фиксировали 4%-ным раствором парафольмадегида и помещали в среду BioMount; (2) клетки на покровных стеклах (по 2 стекла на группу) фиксировали в течение суток 4%-ным раствором парафольмадегида, окрашивали гематоксилин-эозином и заключали в среду BioMount; (3) клетки (по 4 стекла на группу) помещали в СОг-инкубатор на 24 ч и окрашивали трипановым синим или гематоксилин-эозином. По результатам сравнения в световом микроскопе плотности монослоя клеток контрольных и экспериментальных образцов делали заключение о повреждающем действии лазера в присутствии или в отсутствии НСЗ.
Для электронно-микроскопического анализа клетки В16 и ВНК-21 (по 5х Ю4 клеток на лунку в 0,5 мл DMEM, по 2 лунки на группу) высевали в 48-луночные культуральные планшеты и культивировали в течение суток, затем заменяли среду в лунках и в экспериментальные лунки добавляли НСЗ в концентрации 0,05 мкг/л. Через 24 ч образцы облучали лазером. Клетки отделяли путем обработки трипсином, который инактивировали средой с сывороткой. Суспензию клеток центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин) и фиксировали в 4%-ном растворе парафольмадегида в течение суток при 4С. Далее образцы обрабатывали, как описано выше, и изучали с помощью ПЭМ.
Модель меланомы получали путем подкожного введения мышам С57В1/6 (самки, 18-20 г) клеток меланомы В16 (1,5х105 клеток/мышь в 0,5 мл стерильного фосфатного буфера) (Overwijk, Restifo 2001). Данная часть работы выполнена к.б.н. Е. П. Гончаровой (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Суспензии клеток хранили во льду. Предварительно с участка кожи, куда вводили клетки, удаляли волосяной покров. На 10-й день, когда размеры опухоли составляли примерно 0,5 см в диаметре, внутрь опухоли вводили ПЭИ-НСЗ (0,2 мг/мышь в 100 мкл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl). Мышам вводили 2 типа ПЭИ-НСЗ: с продольным плазмонным резонансом на длине волны 760 или 808 нм. Контрольной группе мышей вводили такое же количество стерильного 0,9%-ного раствора NaCl. В итоге были сформированы следующие группы мышей по 5 животных в каждой, которым: (1) вводили стерильный 0,9% раствор NaCl (контроль); (2) вводили ПЭИ-НСЗ; (3) вводили стерильный 0,9%-ный раствор NaCl и облучали лазером; и (4) вводили ПЭИ-НСЗ и облучали лазером.
Поведение наночастиц палладия в культуральных средах
В фосфатном буфере значение дзета-потенциала НЧП было отрицательным (-19,0±1,2 мВ); анализ дисперсного состояния частиц в суспензии с помощью ДСР выявил их полную агрегацию. ПЭМ показала большие (до 10 мкм) агрегаты НЧП (этот термин подразумевает отсутствие видимого пространства между НЧ) высокой электронной плотности, обособленные НЧП отсутствовали. Данные агрегаты не разрушались ультразвуковым воздействием. Таким образом, НЧП в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) активно агрегировали, и агрегаты были устойчивы к интенсивному взбалтыванию и пипетированию, а также к воздействию ультразвуком.
Получение высокодисперсной и стабильной суспензии НЧП в фосфатном буфере было первоочередной задачей, поскольку данный раствор используется для приготовления культуральных сред и для разведения препаратов НЧ. С этой целью мы исследовали влияние модификации БСА, полиэтиленгликолем (ПЭГ) и поливинилпирролидоном (ПВП) на дисперсность НЧП (Рис. 3.3). Электронно-микроскопический анализ показал, что БСА-НЧП агломераты размером от 0,1 до 2 мкм (Рис. 3.3 Б). Наночастицы палладия, модифицированные с помощью ПЭГ или ПВП, адсорбировались на сетке, в основном, агломератами размером 200-500 нм, и более крупными агломератами (около 8-10 мкм), которые покрыты ПЭГ (Рис. 3.3 В) или ПВП (Рис. 3.3 Г). Обособленные НЧП при данных модификациях обнаружены не были. Характеристики препаратов наночастиц палладия, разведенных в различных жидкостях: дистиллированная вода (А); раствор бычьего сывороточного альбумина (Б); раствор полиэтиленгликоля (В); раствор поливинилпирролидона (Г); среда DMEM с 10% сыворотки (Д) и кондиционированная среда (Е). Приведено электронно-микроскопическое изображение суспензии при адсорбции на сетку и интенсивность светорассеяния НЧП в суспензии.
Исследования на культурах клеток проводятся с использованием питательных сред, которые являются сложными буферными системами. Мы изучили поведение НЧП в культуральных средах DMEM и IMDM и обнаружили, что разведение в среде DMEM существенно снижает агломерацию НЧП (Табл. 3.1). Значение дзета-потенциала в среде DMEM составляло -10,6 мВ. Исследование с помощью ПЭМ показало, что НЧП, разведенные средой DMEM, диспергированы сильнее, чем разведенные в среде IMDM. В экспериментах in vitro используется инактивированная бычья сыворотка для обогащения среды ростовыми факторами и питательными веществами, поэтому мы также изучили влияние среды с сывороткой, на поведение НЧП. Оказалось, что НЧП, разведенные в среде DMEM с 10% сыворотки, формируют рыхлые агломераты размером около 50-120 нм, окруженные гомогенной субстанцией средней электронной плотности (Рис. 3.3 Д). Таким образом, разведение средой DMEM с сывороткой позволило получить стабильную суспензию НЧП, пригодных для использования в экспериментах с культурами клеток.
Изображение скопления наночастиц палладия в кондиционированной среде (А) и его увеличенные фрагменты (Б-Г), полученные с помощью ПЭМ высокого разрешения. Интересно, что при разведении НЧП средой DMEM, собранной с клеток после 48 ч инкубации (кондиционированная среда), дисперсность НЧП была выше, чем после разведения свежеприготовленной средой DMEM, содержащей 10% сыворотки (Табл. 3.1). Электронно-микроскопический анализ показал, что при разведении НЧП кондиционированной средой DMEM частицы адсорбируются на сетки поодиночке, в окружении субстанции средней электронной плотности (Рис. 3.3 Е). При хранении этой суспензии при 4С в течение 24 ч отмечалось медленное осаждение НЧП; однако, частицы легко диспергировались под воздействием ультразвука. Похожие результаты были получены при разведении НЧП кондиционированной средой и хранении суспензии при 4С в течение 7 дней. Таким образом, можно добиться необходимой дисперсности и стабильности НЧП путем их разведения в кондиционированной среде, полученная суспензия будет пригодна для использования в работах с культурами клеток.
Кондиционированная среда DMEM после недельного хранения 20-200 49,1 Электронно-микроскопический анализ показал, что НЧП до и после обработки были одного размера (около 6 нм) и формы. ПЭМ высокого разрешения подтвердила, что разведение суспензии НЧП кондиционированной средой не влияет на их структуру, которая имеет кристаллическую конфигурацию (Рис. 3.4) с Брэгговским расстоянием 2,25 А, что соответствует кубической решетке металлического палладия в наноразмерных кластерах (Berger et al. 2010).
Нами было изучено поведение НЧЗ и НСЗ, модифицированных БСА и ПЭИ, в различных растворах (10% раствор сыворотки, культуральная среда DMEM с 10% сыворотки и кондиционированная среда). Размер и заряд НЧ через 40 мин инкубации не отличались от таковых через 24 ч инкубации в одной и той же среде. Изменение гидродинамического размера и дзета-потенциала было выявлено при сравнении различных разведений (Рис. 3.5 и 3.6). По данным ДСР размер цитратных НЧЗ увеличился на 65 и 75 нм после инкубации, соответственно, в исходной и в кондиционированной среде DMEM, при модификации ПЭИ такого рода изменения отсутствовали. Гидродинамический размер НЧЗ, модифицированных БСА, также увеличивался на 30-40 нм в исходной и кондиционированной среде DMEM.
Исходные НЧЗ имели отрицательный поверхностный заряд во всех растворах (Рис. 3.5 А), их модификация с помощью ПЭИ приводила к изменению поверхностного заряда на положительный в дистиллированной воде (34,03±1,32 мВ). После инкубации в культуральных средах, растворе сыворотки и в фосфатном буфере заряд ПЭИ-НЧЗ сменился на отрицательный (Рис. 3.5 А). Значения дзета-потенциала НЧЗ, модифицированных ПЭИ или БСА, были близкими по значению и знаку в фосфатном буфере, среде DMEM, растворе сыворотки и в кондиционированной среде.
Взаимодействие наночастиц палладия с клетками культуры MDCK и с перитонеальными макрофагами
Наночастицы представляют большой интерес для нанобиотехнологии и наномедицины, количество публикаций, сообщающих о перспективах создания новых диагностических и лекарственных препаратов на основе НЧ, постоянно растет (Arvizo et al. 2012; Beija et al. 2012; Doane, Burda 2012; Kumar et al. 2013; Mieszawska et al. 2013). Одновременно с этим отмечается отставание в изучении тонких механизмов взаимодействия НЧ с клетками, не разработано общепринятых методов оценки потенциального вреда для живых организмов и эффективности нанопрепаратов (Maurer-Jones et al. 2013; Roy et al. 2014; Teske, Detweiler et al. 2015).
Любой препарат, применяемый в медицинских целях, должен быть стандартизован по определенным параметрам. Для НЧ такими параметрами, в первую очередь, являются их размерные, морфологические и дисперсные характеристики (Perez-Juste et al. 2005; Jiang et al. 2009; Samim et al. 2011), поэтому разработка любого препарата НЧ начинается с исследования этих характеристик. Полученные в результате химического синтеза суспензии НЧ металлов зачастую находятся в агрессивной или несовместимой с живыми клетками среде, что определяет необходимость дополнительной их обработки, которая должна сохранить нано-свойства и обеспечить отсутствие негативного воздействия на организм. С этой целью проводится изучение поведения НЧ в условиях, приближенных к физиологическим, и разработка методов, сохраняющих нано-свойства препаратов и снижающих их токсичность (Gupta А.К., Gupta М. 2005). Наше исследование показало, что все препараты наносфер и наностержней золота, а также НЧ палладия стабильны и дисперсны в дистиллированной воде, но водные суспензии НЧ непригодны для внесения в среду, где культивируются клетки. Самым простым разбавителем является фосфатный буфер, входящий в состав всех культуральных сред. Однако, многие НЧ в фосфатном буфере агрегируют и агломерируют, причем образующиеся агрегаты часто устойчивы и не поддаются ультразвуковому воздействию. Агломерация металлических НЧ в богатых солевых растворах, таких как фосфатный буфер, является общим свойством нанообъектов ввиду наличия активных атомов на их поверхности (Jiang et al. 2009; Harraz et al. 2012; Dominguez-Medina et al. 2013). Макрочастицы, образующиеся при агрегации НЧ, теряют наноразмерные свойства (Jiang et al. 2009), что определяет необходимость подбора условий, сохраняющих нано-свойства материала. Проведенные нами эксперименты позволили установить условия получения высокодисперсной суспензии НЧП, пригодной для исследований на культурах клеток, путем разведения НЧП в культуральной среде DMEM с 10% сыворотки и последующей обработки ультразвуком. Аналогичный подход к получению высоко дисперсной суспензии применялся для НЧ платины (5-10 нм), которые разводили средой DMEM с 1% телячьей сыворотки (Pelka et al. 2009) и НЧ платины размером около 35 и 20 нм, которые разводили фосфатным буфером с добавлением 1% телячьей сыворотки (Elder et al. 2007). Считается, что стабилизирующим агентом может выступать альбумин, содержащийся в большом количестве в сыворотке, который и предотвращает агрегацию НЧ путем взаимодействия с их поверхностью (Orts-Gil et al. 2013; Wang et al. 2013). Были испробованы и другие методы подготовки НЧП (модификация с помощью БСА, ПЭГ или ПВП), которые оказались менее эффективными (Verma, Stellacci 2010; Bryaskova et al. 2011). Наше исследование показало, что наилучшие результаты дает разведение НЧП кондиционированной средой DMEM, собранной после 2-суточного культивирования клеток: полученная суспензия имела наибольшие стабильность и дисперсность. Этот эффект свидетельствует о влиянии небелковых факторов, возможно, продуктов жизнедеятельности клеток, на стабильность и дисперсность суспензии, поскольку содержание сывороточных белков в кондиционированной среде меньше, чем в свежеприготовленной среде. Мы впервые использовали кондиционированную среду, по сути - «отходы» культивирования клеток, для получения биосовместимых и стабильных при физиологических рН металлических НЧ. Мы полагаем, что данный подход позволит решить проблему подготовки суспензий металлических НЧ для биологических исследований.
Другой проблемой использования НЧ металлов в биологических исследованиях является высокая токсичность соединений, применяемых при их синтезе. Так, ЦТАБ, без которого невозможно получить частицы стержневидной формы, обеспечивает токсичность наностержней золота. ЦТАБ является катионным поверхностно-активным веществом, молекулы которого проникают в клетки и повреждают митохондрии, индуцируя апоптоз (Perez-Juste et al. 2005). Цитотоксичность НСЗ может быть снижена с помощью модификации их поверхности (Menon et al. 2013). Например, для того, чтобы НСЗ были нетоксичны для мышей, используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Lin et al. 2010; Park et al. 2010), но применение ПЭГ-покрытия снижает доставку НСЗ в клетки. В целом проблема получения нетоксичных НСЗ, которые стабильны в биологических жидкостях и способны активно проникать в клетки, не решена.
Мы исследовали НСЗ, синтезированные в ИХБФМ, для покрытия которых впервые был использован линейный полиэтиленимин (ПЭИ), для анализа эффекта покрытия были приготовлены покрытые ПЭИ наносферы золота. Для сравнения использовали наносферы и наностержни золота, покрытые бычьим сывороточным альбумином (БСА). Изучение поведения модифицированных ПЭИ и БСА НЧЗ и НСЗ в разных жидкостях выявило увеличение их гидродинамических размеров через 40 мин и 24 ч инкубации. Полагают, что такое увеличение может быть обусловлено связыванием компонентов культуральной среды с поверхностью НЧ, либо агрегацией или агломерацией частиц в растворе (Dobrovolskaia et al. 2009; Schaffler et al. 2013). Методы динамического и электрофоретического светорассеяния выявляет изменение поверхностного заряда и гидродинамического диаметра НЧ в суспензии, а метод просвечивающей электронной микроскопии позволяет понять, в чем фактически заключается это изменение.