Введение к работе
Актуальность теш. Сопряжение потоков частиц различных видов (потоков ионов, ионов к молекул неэлектролитов) при их переносе через плазматические мембрана клеток и мембраны внутриклеточных органоидов является одним из фундаментальных явлений, определяющих закономерности функционирования систем активного и пассивного транспорта в живых клетках. Механизмы поступления в клетки субстратов я удаления продуктов метаболизма, гомеостати-ровакия ионного состава гиалошіазш и внутренней среды клеточных органоидов теснейшим образом связаны с взаимодействием (сопряжением) потоков в мембранних транспортных системах. Несмотря на огромный литературный материал, посвященный феноменологии сопряжения потоков (в частности, ионных потоков), определению стехиометрии противоположно направленных потоков ргтличных ионов (oountertrem.sport) и сочетанных потоков частям в одном направлении (cotranaport), физические основы этого^ гіринщшиально важного биологического явления до настоящего времени остаются практически неизвестными. Б значительной степени это обусловлено трудностью проведения точных количественных определений параметров, характеризующих взаимодействие трансмембранних потоков. Для получения наде:.-шых результатов, позволяющих выяснить тринцшш механизмов сопряжения, совершенно необходимым, является широкое варьирование условий эксперимента, что в случае крайне лабильных клеточных мембран не представляется возможным. Это обстоятельство заставляет обращаться к модельним системам и, в частности, к бимолекулярным дипидннм мембранам в введенными в них веществами-каналоформерами. По ряду показателей (скорости движения ионов, водной проницаемости, сопряжении ионных й водных потоков и др.) такие системы могут рассматриваться как достаточно адекватне модели клеточных мембран, '* ^ »:".
К моменту начала нашей габоты в jrcworinwrio о»су?с?5овгля данные, касапциеся. сопряжения ионных потоков в модельных системах. Нами была разработана методика, с Помощью которой было об-іаружено и количественно охарактеризовано взаимодействие встреч-1ых ионных потоков в каналах, индуцированных внтибиотиком-канало-Ьормером грамицидином А в модельных лййидных бислоях. Эти первые
исследования /Щагина и др.,1978/ показали сходство грамицидино-вых каналов с калиевыми каналами клеточных мембран /HodcWn, Keynes,1955/ в отношении взаимодействия потоков ионов, что убедило нас в правильности выбора модели и принятого подхода к исследованию эффектов сопряжения ионных потоков. В основу этого подхода мы положили одновременное измерение изотопных и электрических параметров транспортных систем, сопоставление которых позволяет в ряде случаев делать выводы о свойствах системы без привлечения тех или иных модельных представлений. О наличии сопряжения трансмембранних потоков частиц можно судить по отклонению от единицы показателя а± в уравнении Уссинга-Ходакина-Кейнеса:
Tt/V± = (с^ /с) * ехр (а^п^/НТ) (I)
где $ ,"ф^ - встречные потоки ионов і через мембрану; с± , с^ — концентрации ионов сорта і по обе стороны мембраны; zi - заряд иона; V - трансмембранная разность потенциалов; р - число Фарадея; R - универсальная газовая постоянная; т - абсолютная температура.
Результаты современных теоретических исследовании позволяют выделить два случая отклонения значений показателя п± от единицы. Случай, в котором пА<1, относят к явлению обменной диффузии и трактуют в рамках представлений о транспорте, осуществляемом с помощью подвижного переносчика /Маркин, Чизмадаев,1974/. Величины nt>1 считаются характерными для переноса ионов по трансмембранним ионным каналам, причем наиболее наглядной моделью такого транспортного механизма является так называемая однорядная диффузия /Haokmann,I972/. Для того, чтобы убедиться в предсказательной силе транспортного параметра п^ представлялось целесообразным в сходных условиях определить значения п± для случаев трансмембранного переноса ионов, индуцированного введением . в бислойные липиднне мембраны антибиотика валшюмицина, который принято считать цодвшшым переносчиком, и грамицидина А, наиболее полно к настоящему времени изученного ващества-каналсформера. И если исследования на модельных системах - липидннх бислоях открывали возможность использования широкого диапазона эксперимен-
тальных условий, то последующее сопоставление результатов модельных опытов с данными, полученными при действии тех же модификаторов на мембраны живых клеток (эритроцитов человека), позволило приблизиться к пониманию транспортных процессов в зтих объектах.
Цель и задачи исследования,. Основной целью работы было детальное количественное изучение взаимодействия ионных потоков в транспортных системах, образованных введением в липидные биолои и клеточные мембраны веществ-модификаторов ионного транспорта, используемых в современных биологических исследованиях в качестве так называемых "химических инструментов".
В число задач входили следующие: I. Разработка методики количественных определений встречных потоков через бислойные липидные мембраны. 2. Обнаружение и исследове-гие взаимодействия встречных потоков ионов при индуцированном мембрано-активными антибиотиками транспорте катионов через искусственные липидные бислои и эритроцитарные мембраны в зависимости от ионного состава среды: концентрации, вида и соотношения присутствующих в окружающих мембраны растворах катионов щелочных металлов. 3» Изучение кинетики каналойормерной активности антибиотика грамицидина А и ее зависимости от липидного состава мембран. 4. Разработка общих представлений о механизмах каналоформерного эффекта грамицидина А.
Научная новизна -работы. Впервые систематически исследовано взаимодействие ионных потоков в строго детерминированных мембранных системах о использованием методов одновременного определения массопереноса и электрохимических транспортных параметров.
Впервые на модельных бимолекулярных липидных мембранах, кодифицированных валиномицином, получены непосредственные доказательства существования явления обменной диффузии.
Впервые обнаружено влияние вида проходящих по грамицидино-вым каналам катионов на характеристики взаимодействия встречных ионных потоков и катионную избирательность этих каналов.
.Впервые показана эволюция свойств грзшцидиновых каналов в модельных и эритроцитарннх мембранах (их "инактивация"). Доказана зависимость такого рода инактивации от стерольного состава мембран.
Научно-практическая значимость работы заключается в получении результатов, необходимых для фундаментальных исследований транспортных процессов в клеточных мембранах. Развитые в работе подходы позволяют устанавливать и количественно характеризовать механизмы индуцированного транспорта ионов через модельные и клеточные мембраны. Результаты работы обосновывают эффективность использования модифицированных ыембрано-активншли антибиотиками искусственных липидных бислоев для моделирования пассивного ионного транспорта в клеточных мембранах, Полученнпе в работе результаты послужили основой для ряда теоретических моделей мембранного транспорта /Айтьян,1986; Kohler,I987/, Разработанный метод определения потоков веществ через бислойные липидные мембраны большой площади используется исследователями у нас в стране и за рубежом, в частности, для изучения сопрянения противогра-диевтного переноса ионов с активностью ферментов энергообеспечения транспорта. Результаты работы могут быть использованы d биохимических и биофизических исследованиях процессов, происходящих т. клетках и связанных с потоками ионов через клеточные мембраны. Результаты работы используются в курсах лекций по биофизике в ЛГУ, ЛШ, в учебном процессе Медицинского университета Г.Будапешта /ВНР/, а также использованы в монографиях: А.АЛев "Моделирование ионной проницаемости клеточных мембран", 1976; B.Hille "Ionio channels in exitable membranes",1984.
На защиту выносится;
-
Новая методика исследования взаимодействия потоков ионов в модельных мембранных транспортных системах, основанная на сочетании измерения параметров массопереноса и электрохишчесглх характеристик.
-
Доказательство зависимости свойств трансмембранных ионных каналов от состава протекающего по ним потока ионов различных видов. Выдвигается представление о том, что свойства ион-траиспор-тирующих оиотем определяются взаимодействием каналоформера с формирующим мембрану липэдом и движущимися по транспортной системе ионами.
-
Доказательство протекающей во времени и зависящей от липидно-го состава мембран эволюции Каналоформорной активности грамицидина А - выявление стерол-завиоимой инактивации кана-іої-ор-.:ера,
проявляющейся в уменьшении проницаемости модифицированных антибиотиком мембран.
Апробация -работы. Основные результаты работы были доложены или представлены на: Всесоюзных конференциях "Биофизика мембран" (Паланга, 1972,1973,1974), 21-м Ежегодном совещании по ядерной спектроскопии и структуре ядра (Киев,1972), 4-м и 5-м Международных биофизических конгрессах (Москва,1972; Копенгаген,1975), 3-м и 4-м Всесоюзных биохимических съездах (Рига,1974; Москва, 1981), Научной конференции Института цитологии АН СССР (1974), семинаре Всесоюзного биохимического общества им.Д.И.Менделеева "Биологические мембраны и физико-химические аспекты их функционирования" (Ленинград, 1975,1976,1977,1980,1981,1982), Международной конференции "Переносчики и каналы в биологических системах" (Нью-Йорк,1975), Зимних школах ЛИЯФ "Биофизика мембран" (1975,1980), 2-м Советско-американском симпозиуме по биомембранам (Киев,1978), Международном симпозиуме "Энергетические аспекты мембранного транспорта" (Сегед,1978), Советско-финском совещании по проблемам "Биохимические аспекты структуры и функций ядерных и цитоплазматических мембран" (Ленинград, 1979), 3-м Советско-шведском симпозиуме "Физико-химическая биология" (Тбилиси,1981), Научных конференциях стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблемам биошизики мембран (Смоленицн,1981; Балатонферед,1983; Эйзенах,1985; Москва,1987), Научных совещаниях Венгерского биофизического общества (Будапешт, 1981,1983,1987,1988,1989; Дебрецен,1985; Шумег,1985), Рабочих совещаниях по биоэлектрохимии (Пущино,1983,1985; Рига,1986; Ленинград,1987), Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Ташкент, 1983; Рига,1988), Научной сессии по. фазовым превращениям (Будапешт,1984), II-м Международном симпозиуме "Структура и функции яритропитарных мембран" (БерлинЛ986), 12-м Всесоюзном совещании "Ионный гомеостаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клеток" (Иркутск,1987), Советско-западногерманском симпозиуме "Возбудимые мембраны" (Киев,1987), Международном симпозиуме "Структура и функции молекул, влияющих на свойства клеточных мембран" (Париж,1987), 4-м Международном симпозиуме "Биоэлектрохимия сегодня и завтра" (Москва-Суздаль,1983), Всесо-
юзном симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг,1989), Кустовом научном семинаре Института цитологии АН СССР (Ленинград,1989).
Объем и структура работы; Для защиты диссертации представляется совокупность работ: 35 публикаций, в их числе 19 в отечественных и 16 в международных изданиях.